Schlaganfälle gehören zu den drei häufigsten Todesursachen und stellen das Gesundheitssystem vor große Herausforderungen. Behandlungsstrategien des ischämischen Schlaganfalls sind immer noch begrenzt, wobei enorme Anstrengungen in der präklinischen Forschung zwar erfolgreich waren, aber unter klinischen Bedingungen keine Effektivität zeigen konnten. Zu den Voraussetzungen einer Translation präklinischer Ergebnisse zählen klinisch relevante Schlaganfallmodelle sowie die Berücksichtigung potentieller Komorbiditäten und altersabhängiger Effekte. Eine umfassende Betrachtungsweise des schlaganfallbedingten Gewebeschadens gilt als vielversprechend, wie es das Konzept der neurovaskulären Einheit (neurovascular unit, NVU) erlaubt. Dieses Konzept beinhaltet Neurone, Gefäße und Gliazellen mit Astrozytenendfüßen, die in enger Beziehung zur extrazellulären Matrix (EZM) stehen. Die Rolle der EZM-Bestandteile während der Entwicklung von schlaganfallbedingten Gewebeschäden wird bislang nur wenig verstanden und kann daher nicht für Behandlungsstrategien genutzt werden. Die bereits Ende des 19. Jahrhunderts erstmals von Camillo Golgi beschriebenen perineuronalen Netze (PN) sind ein wichtiger Bestandteil der EZM, die in vielen Hirnregionen zu finden sind. PN bilden eine aus Proteoglykanen, Glykoproteinen und Hyaluronsäure bestehende netzartige Struktur, die um Neurone und deren proximalen Dendriten sowie um die Initialsegmente von Axonen nachweisbar ist. Weitere Studien zeigten PN häufig als Umhüllung von inhibitorischen GABAergen Zellen, die das Kalzium-bindende Protein Parvalbumin und die Untereinheit des spannungsabhängigen Kaliumkanals Kv3.1b koexprimieren. Zu den diskutierten Funktionen gehört eine neuroprotektive Wirkung gegenüber neuropathologischen Veränderungen und oxidativem Stress, die Stabilisierung von Synapsen, die Kontrolle neuronaler Plastizität und eine Pufferfunktion um hochaktive Neurone. Die vorliegende tierexperimentelle Studie fokussiert auf Veränderungen der PN als Teil der EZM und Parvalbumin-enthaltender GABAerge Neurone in Mäusen. Dabei lag der Schwerpunkt auf dem Nucleus reticularis thalami (NRT), der in enger Beziehung zur ischämischen Läsion steht, die durch ein Filament-basierendes Schlaganfallmodell induziert wurde. Der NRT erfüllt wichtige neurophysiologische Funktionen, z. B. bei der Regulation des Schlaf-Wach-Rhythmus. Die Neurone des NRT sind als GABAerg bekannt und von zahlreichen PN umhüllt. Um PN darzustellen, können Lektine genutzt werden, die an N-Azetylgalaktosamin binden wie z. B. das Wisteria floribunda Agglutinin (WFA). Zum Nachweis der durch Ischämie induzierten Schädigung von Neuronen und Netzkomponenten dienten Immunfluoreszenztechniken. Um den Verlust von PN und die Veränderung von Parvalbumin-immunpositiven Neuronen abzubilden, wurden Färbeserien mittels einer Doppelmarkierung von WFA und Parvalbumin durchgeführt. Ausgewertet wurden insgesamt vier Tiergruppen mit je 7 Mäusen: 3- und 12-Monate alte Wildtyp-Mäuse und komorbide triple-transgene (3xTg) Mäuse mit Alzheimer-ähnlichen Veränderungen. Es erfolgten qualitative und semiquantitative Vergleiche zwischen der ischämischen und der nicht ischämischen Hemisphäre einen Tag nach Induktion des Schlaganfalls. Zur Überprüfung der statistischen Signifikanz kamen der Wilcoxon-Test und der Mann-Whitney-U-Test zur Anwendung. Ergänzend wurden durch Mehrfach-Fluoreszenzmarkierungen detektierte Veränderungen zusätzlicher Netzkomponenten sowie von neuronalen Markern des NRT qualitativ erfasst. Einen Tag nach Induktion der Ischämie ergaben die semiquantitativen Analysen einen drastischen Verlust der PN im ischämischen NRT. Konkret zeigte die WFA-Markierung einen Verlust von Intensität und Zellzahl in allen 4 analysierten Tiergruppen. Die Zahl Parvalbumin-positiver Zellen im ischämischen NRT nahm ab, wobei sich die Intensität der Färbung von betroffener und nicht betroffener Hemisphäre nicht unterschied. Ältere Tiere zeigten eine deutliche Verringerung der Färbeintensität und der Fläche gegenüber jüngeren Tieren in Bezug auf Parvalbumin-Immunreaktivität und WFA-Bindung. Unter Berücksichtigung des genetischen Hintergrundes war die Fläche unabhängig verringert, wobei Wildtypen gegenüber transgenen Tieren in Bezug auf die Zellzahl einen stärkeren Verlust aufwiesen. Die Färbeintensität von Parvalbumin-positiven Zellen hingegen zeigte bei 3xTg Mäusen gegenüber Wildtypen eine geringe Zunahme auf. Zusätzliche qualitative Analysen detektierten im NRT sowohl den Ischämie-induzierten Verlust von PN und im umgebendem Neuropil EZM-Immunreaktivität für Aggrecan und Neurocan als auch verringerte Immunreaktivität für Calbindin, die Kaliumkanal-Untereinheit Kv3.1b sowie die Glutamatdekarboxylase-Isoformen GAD65 und GAD67. Zusammenfassend bestätigen die vorgelegten Daten PN als hochsensitive Bestandteile der EZM. Die Befunde favorisieren EZM-Bestandteile als vielversprechende Angriffspunkte für aussichtsreich erscheinende, künftige Behandlungsmethoden des ischämischen Schlaganfalls.:Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 1 2 Grundlagen 2 2.1 Pathophysiologie des ischämischen Schlaganfalls 2 2.2 Translation 4 2.3 Komorbidität 5 2.4 Neurovaskuläre Einheit 6 2.5 Perineuronale Netze 8 2.5.1 Chemischer Aufbau der perineuronalen Netze 9 2.5.2 Funktionen perineuronaler Netze 11 2.5.3 Verteilungsmuster im ZNS 13 2.6 Nucleus reticularis thalami 14 3 Zielstellung 15 4 Material und Methoden 16 4.1 Material 16 4.1.1 Versuchstiere 16 4.1.2 Chemikalien 17 4.1.3 Antikörper 18 4.2 Methoden 19 4.2.1 Gewebeaufarbeitung 19 4.2.2 Auswahl der Hirnschnitte 20 4.2.3 Immunhistochemie und indirekte Immunfluoreszenz 20 4.2.4 Lektinhistochemie 21 4.2.5 Fluoreszenz-Doppelmarkierung von perineuronalen Netzen und Parvalbumin 21 4.2.6 Fluoreszenz-Mehrfachmarkierungen für qualitativeAnalysen 22 4.2.7 Kontrollfärbungen 23 4.2.8 Mikroskopie und Bildgebung 23 4.2.9 Semiquantitative Auswertung 24 5 Ergebnisse 26 6 Diskussion 41 6.1 Technische Aspekte 41 6.2 Ischämie und GABAerge Neurone im NRT und anderen Hirnregionen 43 6.3 Schlaganfall-induzierte Veränderungen von perineuronalen Netzen des Nucleus reticularis thalami und anderer Hirnregionen 44 6.4 Perineuronale Netze bei anderen neuropathologischen Veränderungen 45 6.5 Abbau perineuronaler Netze mit Metalloproteinasen, Chondroitinasen und Aggrecanasen 47 6.6 Perineuronale Netze nach Ischämie 49 7 Zusammenfassung 51 8 Literaturverzeichnis 54 8.1 Abbildungs- und Tabellenverzeichnis 83 9 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 84 10 Danksagung 85 11 Curriculum Vitae 86

Asiatische Elefanten, Afrikanische Elefanten und Klippschliefer gehören zur phylogenetisch sehr alten Gruppe der Afrotheria, welche sich bereits vor 100 Millionen Jahren von anderen Vertretern der Mammalia abgespaltet haben. Die Vertreter dieser Spezies zeichnen sich durch Besonderheiten in ihrer Vokalisation und Kommunikation aus, welche die Verwendung von Infraschallfrequenzen der Elefanten und die Gesänge der Klippschliefer umfassen. Auf neuroanatomischer Ebene spiegeln sich durch bestimmte Spezies wahrnehmbare Frequenzbereiche in der spezifischen Ausbildung auditorischer Kerngebiete wie der Kochleariskerne (CN) und des Komplexes der oberen Olive (SOC) wider. Diese Kerngebietskomplexe befinden sich im Hirnstamm und erfüllen die Funktion der Schallverarbeitung und -lokalisation durch komplexe Mikrokreisläufe, was für in freier Wildbahn lebende Tiere unerlässlich ist. Die Kerngebiete des zentralen auditorischen Systems sind besonders reich an perineuronalen Netzen (PN), einer Sonderform der extrazellulären Matrix im Gehirn, welche in Zusammenhang mit einer schnellen synaptischen Übertragung und Stabilisierung synaptischer Kontakte gebracht wird. PNs bilden sich bei Nesthockern erst zu Beginn der kritischen Periode, welche mit dem Beginn der Wahrnehmung akustischer Signale einhergeht aus, (bei Maus und Ratte circa zum Ende der ersten postnatalen Woche). Dementsprechend wird den PNs auch eine wichtige Rolle in der Synaptogenese zugesprochen. Bislang gibt es keine Studien über die Ausprägung von PNs bei nestflüchtenden Tieren zum Zeitpunkt der Geburt. Die Ziele dieser Arbeit waren die Darstellung, Identifikation und Charakterisierung der Kerngebiete des auditorischen Hirnstammes sowie der Nachweis perineuronaler Netze und deren Charakterisierung, insbesondere beim neonatalen Elefanten. Die Ergebnisse galt es im Speziesvergleich und im Kontext des aktuellen Wissensstandes darzustellen. Dafür wurden die Gehirne von drei verstorbenen Elefanten im Alter von 0 Tagen bis eineinhalb Jahren und die Gehirne eines adulten und eines juvenilen Klippschliefers mittels histologischer und immunhistochemischer Methoden bearbeitet. Es kamen sowohl Fluoreszenfärbungen als auch Markierungen mithilfe der klassischen ABC-Methode (DAB-Nickelfärbungen) sowie eine kombinierte Klüver-Barrera-Markscheiden- und Nissl-Färbung zum Einsatz. Da für die Identifikation der auditorischen Kerngebiete weder für den Klippschliefer, noch für den Elefanten geeignete Publikationen oder Atlanten existieren, erfolgte deren Analyse und Zuordnung im Speziesvergleich mit Ratte, Katze, Rhesusaffe und Mensch. Die CN der untersuchten Spezies konnten identifiziert und das Zusammenspiel von Neuronen, Synapsen und perineuronalen Netzen dargestellt werden. Eine Besonderheit stellt der Nachweis von Oktopuszellen beim Elefanten dar, die sich in dorsolateraler Lage am Rande des Hirnstammes markieren ließen und eine typische tentakelartige Morphologie ihrer Dendriten aufzeigten. Charakteristische Büschelzellen im Nucleus cochlearis ventralis gingen bei allen untersuchten Tieren mit einem deutlich ausgeprägten Nucleus medialis olivae superioris (MSO) einher, der Signale dieser Zellen empfängt und für eine binaurale Integration zur Ermittlung des Schallursprunges verantwortlich ist. Lateral des MSO konnte ein weniger stark ausgeprägter Nucleus lateralis olivae superioris (LSO) markiert und zugeordnet werden, der ebenfalls an der Berechnung des Schallursprunges beteiligt ist, diese Aufgabe aber vornehmlich anhand hoher Frequenzen bewerkstelligt. Der Vergleich der Ausprägung von LSO und MSO bestärken beim Elefanten, einem tieffrequent hörenden Tier, die Hypothese zu dessen Fähigkeit zur Schallortung durch interaurale Zeitunterschiede (ITD) tiefer Frequenzen und lassen beim Klippschliefer die Vermutung aufkommen, dass auch diese Tierart den Schallursprung anhand von tiefen Frequenzen berechnet. Die Berechnung des ITD im Gehirn ist möglich, wenn die Geräuschquelle seitlich auf den Kopf auftrifft und somit ein Wellenmaximum die Ohren zeitversetzt erreicht. Weitere Kerngebiete des Komplexes der oberen Olive, zu dem auch MSO und LSO gehören, konnten charakterisiert werden: der Nucleus corporis trapezoidei medialis (MNTB) fiel sowohl durch seinen glutamatergen Signaleingang in Form einer Riesensynapse beim Elefanten als auch durch seine intensive Netzmarkierung auf, unterschied sich jedoch bei Klippschliefer und Elefant erheblich. Während der MNTB des Elefanten Ähnlichkeiten mit dem Menschen aufwies und nur aus wenigen Prinzipalneuronen bestand, zeichnet sich der Klippschliefer durch die Prominenz dieses Kerngebietes mit einer gewissen Ähnlichkeit zur Mongolischen Rennmaus aus. Riesensynapsen konnte mit der verwendeten Auswahl an Antikörpern nicht dargestellt werden. Außerdem wurden kleinere, sogenannte perioliväre Kerngebiete bei den untersuchten Spezies charakterisiert, die zwar schon im Jahr 1909 von Ramon y Cajal beschrieben worden sind, deren Funktionen jedoch bis heute nicht eindeutig geklärt werden konnten. Die Charakteristika der Kerngebiete des auditorischen Hirnstammes konnten bei allen untersuchten Spezies aufgezeigt werden, wichtige Orientierungspunkte im Hirnstamm des Elefanten neu definiert werden und erstmals gelang der Nachweis für die Existenz perineuronaler Netze bei einem nestflüchtenden Neugeborenen. Zusammenfassend können die auditorischen Kerngebiete der untersuchten Spezies als säugetiertypisch eingeordnet werden und erste Hinweise auf den Hörbereich des Klippschliefers ermittelt werden. Es wurden sowohl Ähnlichkeiten zwischen den Vertretern der Afrotheria aufgezeigt als auch Unterschiede bewertet, die höchstwahrscheinlich nicht auf der phylogenetischen Herkunft dieser Tiere beruhen.:1. Einleitung 2. Literaturübersicht 2.1 Afrotheria 2.1.1 Elephantidae 2.1.2 Hyracoideae/ Procaviidae 2.2 Schallverarbeitung im zentralen Nervensystem 2.2.1 Grundlagen zur neuronalen Kodierung des perzipierten Schalls 2.2.2 Nomenklatur 2.2.3 Die Kerngebiete des zentralen auditorischen Systems und deren Funktion 2.2.4 Schalllokalisation 2.3 Die extrazelluläre Matrix des Nervensystems 2.3.1 Perineuronale Netze: Aufbau und Visualisierung 2.3.2 Vorkommen, Evolution und Entwicklung perineuronaler Netze 2.3.3 Potentielle Funktionen perineuronaler Netze 3. Tiere, Material, Methoden 3.1 Material 3.1.1Chemikalien 3.1.2 Puffer und Lösungen 3.1.3 Antikörper 3.1.4 Geräte und Verbrauchsmaterialien 3.1.5 Tiere und Gewebe 3.2 Methoden, Schnittverfahren und Färbungen 3.2.1 Gehirnentnahme und Nachfixierung 3.2.2 Anfertigung der Schnittserien 3.2.3 Übersichtsfärbungen und anatomische Eingrenzung 3.2.4 Antigendemaskierung 3.2.5 Immunhistochemie 3.2.6 Nachbehandlung mit Sudan-Schwarz-B 3.2.7 Fotodokumentation 4. Ergebnisse 4.1 Makroskopische und mikroskopische Orientierung im Hirnstamm des Elefanten 4.2 Immunhistochemie: Antikörperreaktivität im Gehirn des Elefanten 4.3 Identifikation der Kerngebiete des zentralen auditorischen Systems des Elefanten 4.3.1 Nuclei cochleares des Elefanten 4.3.2 Komplex der oberen Olive des Elefanten 4.4 Makroskopische und mikroskopische Orientierung im Hirnstamm des Klippschliefers 4.5 Immunhistochemie: Antikörperreaktivität im Gehirn des Klippschliefers 4.6 Identifikation der Kerngebiete des zentralen auditorischen Systems des Klippschliefers 4.6.1 Nuclei cochleares des Klippschliefers 4.6.2 Der Komplex der oberen Olive des Klippschliefers 5. Diskussion 5.1 Identifikation der Kerngebiete des zentralen Auditorischen Systems des Elefanten 5.1.1 Nuclei cochleares 5.1.2 Komplex der oberen Olive 5.2 Perineuronale Netze im zentralen auditorischen System des Elefanten 5.3 Die Auditorischen Kerngebiete des Klippschliefers 5.4 Vergleich der zentralen auditorischen Kerngebeite und Perineuronalen Netze von Klippschliefer und Elefant 5.5 Limitationen und Fehlerbetrachtung 5.6 Ausblick 6. Zusammenfassung 7. Summary 8. Literaturverzeichnis 9. Anhang 9.1 Tabellenverzeichnis 9.2 Abbildungsverzeichnis 9.3 Protokolle

Perineuronale Netze (PN) sind eine spezialisierte Form der neuronalen extrazellulären Matrix. Es wird vermutet, dass sie neuroprotektive Eigenschaften besitzen und die von ihnen umschlossenen Neurone gegenüber Degeneration schützen. Mehrere Studien untersuchten bereits die PN in Zusammenhang mit der Pathologie der Alzheimer-Erkrankung. Für die Frontotemporalen Demenzen, die nach der Alzheimer-Erkrankung und der vaskulären Demenz zu den häufigsten dementiellen Erkrankungen gehören, ist die Beziehung von PN und Tau-Protein (TP)-Pathologie noch nicht untersucht worden. Die Dissertation beschäftigt sich mit der Korrelation von netztragenden Neuronen mit TP-Pathologie in einem Mausmodel der Frontotemporalen Demenz mit Parkinsonismus des Chromosoms 17 (FTDP-17). Sie geht der Frage nach, ob netztragende Neuronen vor Degeneration und intrazellulären Ablagerungen von verändertem TP, in Form von Hyperphosphorylierungen (HP) und Neurofibrillären Tangles (NFT), geschützt sind. Mit Hilfe immunhistochemischer Fluoreszenzmarkierung und Western Blot wurden die Gehirne transgener Mäuse mit der P301L-Mutation des TP im Alter von drei und achteinhalb Monaten untersucht. Dabei wurden sechs Hirnregionen ausgewählt: Primärer Somatosensorischer Kortex (PSC), Entorhinaler Kortex (EC), Hippokampus (Hipp), Pars magnocellularis des Nucleus ruber (NR-m), Pars reticulata der Substantia nigra (SN-r) und Motorischer Trigeminuskern (Mo5). Die Untersuchungen zeigen, dass die PN bei der FTDP-17 die Neurone nicht explizit vor TP-Pathologie schützen. Jedoch kommt es zu keiner signifikanten Reduktion der netztragenden Zellen im Altersgang, sodass eine neuroprotektive Funktion der PN weiterhin vermutet werden kann.

Tauopathien wie u.a. die Alzheimer-Demenz sind eine Gruppe neurodegenerativer Erkrankungen mit intrazellulärer Ablagerung des hyperphosphorylierten Tau-Proteins. Perineuronale Netze sind eine spezialisierte Form der extrazellulären Matrix im Zentralen Nervensystem. Sie bestehen u.a. aus Chondroitinsulfat-Proteoglykanen und Tenascin-R. Ziel der vorliegenden Arbeit war der Nachweis einer Protektion perineuronaler Netze vor Tau-Protein-Einlagerung. Zu Beginn wurde die Verteilung des Tau-Proteins und die verschiedenen Arten perineuonaler Netze in der Mauslinie C57Bl6 (Wildtyp) und deren Tenascin-R-Knockout beschrieben. Die Darstellung der Komponenten erfolgte mithilfe von Gefrierschnitten und Immunhistochemie. Um die Ausbreitung von Tau-Protein zu untersuchen, wurden organotypische Hirnschnittkulturen angelegt und markiertes Tau-Protein zugesetzt. Es wurden verschiedene Antikörper genutzt, welche bestimmte Seitenketten von Chondroitinsulfat-Proteoglykanen darstellen. Die Chondroitinsulfat-Seitenketten wurden mit dem Enzym Chondroitinase ABC entfernt, um deren Funktion zu untersuchen. Die Ergebnisse der Arbeit zeigten deutliche Unterschiede in der Verteilung von Tau-Protein. Es reicherte sich bei den Wildtypen und den Tenascin-R-Knockout-Mäusen diffus extrazellulär um Neuronen mit perineuronalen Netzen an. Im Unterschied dazu verteilte sich Tau-Protein nach der Abspaltung der Chondroitinsulfat-Seitenketten vom perineuronalen Netz gleichmäßig über die Schnittkultur ohne sich an perineuronalen Netzen anzureichern. Die vorliegende Arbeit stellt die neuroprotektive Funktion der perineuronalen Netze und insbesondere ihrer Chondroitinsulfat-Seitenketten gegenüber zugegebenem Tau-Protein heraus. Weiterhin weist sie den Verlust der neuroprotektiven Funktion gegenüber zugegebenem Tau-Protein nach Behandlung mit Chondroitinase ABC nach.

No description available.

Perineuronale Netze (PN) sind eine spezialisierte Form der neuronalen extrazellulären Matrix. Es wird vermutet, dass sie neuroprotektive Eigenschaften besitzen und die von ihnen umschlossenen Neurone gegenüber Degeneration schützen. Mehrere Studien untersuchten bereits die PN in Zusammenhang mit der Pathologie der Alzheimer-Erkrankung. Für die Frontotemporalen Demenzen, die nach der Alzheimer-Erkrankung und der vaskulären Demenz zu den häufigsten dementiellen Erkrankungen gehören, ist die Beziehung von PN und Tau-Protein (TP)-Pathologie noch nicht untersucht worden. Die Dissertation beschäftigt sich mit der Korrelation von netztragenden Neuronen mit TP-Pathologie in einem Mausmodel der Frontotemporalen Demenz mit Parkinsonismus des Chromosoms 17 (FTDP-17). Sie geht der Frage nach, ob netztragende Neuronen vor Degeneration und intrazellulären Ablagerungen von verändertem TP, in Form von Hyperphosphorylierungen (HP) und Neurofibrillären Tangles (NFT), geschützt sind. Mit Hilfe immunhistochemischer Fluoreszenzmarkierung und Western Blot wurden die Gehirne transgener Mäuse mit der P301L-Mutation des TP im Alter von drei und achteinhalb Monaten untersucht. Dabei wurden sechs Hirnregionen ausgewählt: Primärer Somatosensorischer Kortex (PSC), Entorhinaler Kortex (EC), Hippokampus (Hipp), Pars magnocellularis des Nucleus ruber (NR-m), Pars reticulata der Substantia nigra (SN-r) und Motorischer Trigeminuskern (Mo5). Die Untersuchungen zeigen, dass die PN bei der FTDP-17 die Neurone nicht explizit vor TP-Pathologie schützen. Jedoch kommt es zu keiner signifikanten Reduktion der netztragenden Zellen im Altersgang, sodass eine neuroprotektive Funktion der PN weiterhin vermutet werden kann.

Einleitung: Bei generalisierten Dystonieformen, gekennzeichnet durch abnorme Haltungen und Verdrehungen infolge unwillkürlicher Muskelkontraktionen, kommt häufig die Tiefe Hirnstimulation (THS) im Globus pallidus internus (Nucleus entopeduncularis, EPN, in Nagern) zum Einsatz. Die Entwicklung rationaler Therapieansätze bzw. die Optimierung der THS ist durch mangelnde Kenntnisse zur Pathophysiologie sowie zum Wirkmechanismus der THS bei Dystonien erschwert. Veränderungen der neuronalen Plastizität innerhalb der Basalganglienschleife scheinen hierbei allerdings eine entscheidende Rolle zu spielen. Einen wichtigen Modulator der neuronalen Plastizität stellen die perineuronalen Netze (PNs) dar, welche sich um die Zellsomata und proximalen Dendriten von Neuronen, insbesondere Parvalbumin-reaktiven (PV+) Interneuronen, befinden. Ein wichtiger Bestandteil dieses kondensierten Subtyps der extrazellulären Matrix (EZM) sind die Chondroitinsulfat-Proteoglykane, wie Aggrecan und Brevican. Während die Rolle einer abnormen PN-Expression in der Pathophysiologie der Dystonien weitgehend unbekannt ist, konnte bei einer Form der paroxysmalen Dyskinesie des Hundes mit dystonen Symptomen ein Defekt im Brevican-Gen gefunden werden. Somit könnten die PNs auch an der Pathophysiologie der Dystonien beteiligt sein. Ziele der Untersuchungen: Daher wurde im ersten Teil dieser Arbeit der Hypothese nachgegangen, dass die basale Expression von Brevican in Dystoniemodellen verändert ist und PN pathophysiologische Bedeutung bei Dystonien haben. Da Veränderungen der PN durch elektrische Impulse ein wichtiger Mechanismus der THS darstellen könnte, wurde im zweiten Teil untersucht, ob eine antidyston wirksame THS mit Veränderungen in der neuronalen Aktivität (c-Fos) und Brevican-Expression einhergeht. Tiere, Material und Methoden: Als phänotypisches Modell der paroxysmalen Dystonie wurde der dtsz Hamster genutzt, bei dem wahrscheinlich die Reifung von PV+ Interneuronen verzögert ist. Die DYT1 Knock-in Maus, die keine dystonen Symptome zeigt, ist ein ätiologisches Modell für eine permanente generalisierte Dystonieform. In beiden Tiermodellen wurde die Brevican-Expression immunhistochemisch mittels Intensitätsmessungen und Zellzählung von Brevican-exprimierenden PV+ Neuronen untersucht: dtsz Hamster (n = 8; Kontrolltiere n = 5) bzw. DYT1 KI-Maus (n = 9, Kontrolltiere n = 8). Zudem erfolgten im Mausmodell (je n = 6) Untersuchungen der Proteine mittels Western Blot und der mRNA-Expression (qPCR). Weiterhin wurde nach EPN-THS mit 130 Hz (antidyston wirksam) bzw. 40 Hz (Tendenz zu antidystonen Effekten) sowohl Brevican als auch c-Fos in dtsz und Kontrollhamstern vs. sham-Stimulationen (je n = 8 dtsz, n = 5 Kontrolltiere) untersucht. Die graphische Darstellung und statistische Auswertung mittels t-Test bzw. ANOVA erfolgte mit SigmaPlot (Signifikanzniveau von 5 % (p ≤ 0,05)). Ergebnisse: Der Vergleich von dtsz vs. Kontrollhamster ergab interessante (basale) Unterschiede innerhalb des Basalganglien-Netzwerks. So zeigte sich eine geringere Anzahl Brevican-positiver Zellen an der Gesamtzahl PV+ Zellen (Brev+/PV+) im motorischen Cortex und an striatalen schwach PV+ Interneuronen, während die Brevican-Intensitäten im Striatum und dem ventromedialen Thalamus erhöht waren. Die Untersuchungen in der DYT1 KI-Maus ergaben hingegen nur eine subtile Erhöhung von Brevican im motorischen Cortex. Eine dreistündige THS im dtsz Hamster (vs. sham) führte nicht zu Veränderungen von Brevican, die basalen Genotyp-Veränderungen bestätigten sich jedoch. Erhöhungen in der neuronalen Aktivität (c-Fos) nach EPN-THS zeigten sich nahe der Elektrodenspitze und eine Verringerung in den tiefen Cerebellarkernen nach 130 Hz EPN THS. Schlussfolgerungen: Im dtsz Hamstermodell könnte eine Entwicklungsstörung der PN an der verzögerten Ausreifung der PV+ Interneurone beteiligt sein. Die weiteren Veränderungen stimmen mit bekannten regionalen Störungen im Basalgangliennetz überein. Allerdings bleibt unklar, ob sie Ursache der Dystonie oder Folge anderer Veränderungen darstellen. Die nur kurze, dreistündige THS hatte keine weitreichenden Effekte auf die neuronale Aktivität und Brevican. Stärkere Effekte sind auch eher bei den noch laufenden Langzeit-THS Versuchen über 10 Tage bei dtsz Hamstern zu erwarten. Die basalen Brevican-Veränderungen bei der dtsz Mutante zeigten sich nicht im asymptomatischen DYT1 KI-Mausmodell, bei dem die corticale Erhöhung der Anzahl Brev+/PV+ jedoch ein Grund für sensomotorische Störungen sein könnte. Brevican ist somit zwar nicht generell vermindert, jedoch in beiden Dystoniemodellen verändert, so dass weiterführende Untersuchungen zur pathophysiologischen Bedeutung von Brevican sowie anderen PN Komponenten, wie HAPLN4 und Aggrecan, sinnvoll erscheinen.:1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2.1 Dystonien 2.1.1 Definition und Einteilung 2.1.2 Pathophysiologie primärer Dystonien 2.1.2.1 Neuronale Plastizität 2.1.2.2 Neuronale Aktivität 2.1.3 Therapieoptionen für Dystonien 2.1.3.1 Tiefe Hirnstimulation (THS) 2.1.4 Tiermodelle für die primäre Dystonie 2.1.4.1 dtsz Hamstermutante 2.1.4.2 DYT1 KI-Mausmodell 2.2 Extrazelluläre Matrix und perineuronale Netze 2.2.1 Aufbau und Funktion 2.2.2 Manipulationen der Expression von PN-Komponenten 2.2.3 Pathophysiologische Bedeutung von perineuronalen Netzen in Bewegungsstörungen 2.3 Hypothesen der vorliegenden Arbeit 3 Tiere, Material, Methoden 3.1 Tiere 3.1.1 Haltung und Fütterung von Hamstern 3.1.2 Haltung und Fütterung von Mäusen 3.2 Material 3.3 Methoden 3.3.1 Dystonie-Induktion und Beurteilung der Schweregrade beim dtsz Hamster 3.3.2 Tiefe Hirnstimulation dtsz Hamster und Kontrolltiere 3.3.3 Genotypisierung der DYT1 KI-Mäuse 3.3.4 Euthanasie und Probenentnahme 3.3.5 Immunhistochemie (IHC) 3.3.5.1 Brevican und Parvalbumin 3.3.5.2 c-Fos 3.3.5.3 Aggrecan 3.3.6 Western Blot (WB) 3.3.6.1 Probenvorbereitung und Proteinextraktion 3.3.6.2 Durchführung Western Blot 3.3.7 Quantitative Real-Time PCR (qPCR) 3.3.7.1 Probenvorbereitung und mRNA-Isolation 3.3.7.2 cDNA-Synthese und Durchführung qPCR 3.3.8 Statistische Auswertung 3.3.8.1 Statistische Auswertung der IHC 3.3.8.2 Statistische Auswertung des WB 3.3.8.3 Statistische Auswertung der qPCR 4 Ergebnisse 4.1 Basale Veränderungen von Brevican beim dtsz Hamster 4.1.1 Intensität von Brevican 4.1.2 Anteil von Brevican-exprimierenden Parvalbumin-reaktiven (PV+) Zellen 4.1.3 Einzelzellintensität von Brevican an striatalen Parvalbumin-positiven (PV+) Zellen 4.2 Veränderungen von Brevican im DYT1 KI-Mausmodell 4.2.1 Intensität von Brevican bei DYT1 KI-Mäusen 4.2.2 Anteil von Brevican-exprimierenden Parvalbumin-reaktiven (PV+) Zellen 4.2.3 Western Blot 4.2.4 qPCR 4.3 Brevican und Parvalbumin im dtsz Hamstermodell nach Tiefer Hirnstimulation (THS) 4.3.1 Intensität von Brevican bei sham-stimulierten und stimulierten dtsz und Kontrollhamstern 4.3.2 Effekte von 130 Hz THS auf den Anteil von Brevican-exprimierenden Parvalbumin-reaktiven (PV+) Zellen 4.3.3 THS-Effekte auf die Anzahl von PV+ Zellen 4.3.4 Einzelzellintensitäten von Brevican um striatale PV+ Zellen 4.4 Neuronale Aktivität im dtsz Hamstermodell nach Tiefer Hirnstimulation (THS) 4.4.1 c-Fos Intensität in der Umgebung der Elektroden 4.4.2 Anzahl c-Fos-reaktiver Zellen 4.5 Vorversuche zu weiteren Komponenten perineuronaler Netze 4.6 Zusammenfassung der Ergebnisse 5 Diskussion 5.1 Ausgewählte Aspekte zur Methodik 5.1.1 Methodische Aspekte zur Immunhistochemie 5.1.2 Methodische Aspekte zum Western Blot 5.1.3 Methodische Aspekte zur qPCR 5.2 Diskussion der Ergebnisse 5.2.1 Brevican im dtsz Hamster 5.2.2 Brevican in der DYT1 KI-Maus 5.2.3 Brevican und Parvalbumin nach THS im dtsz Hamster 5.2.4 Neuronale Aktivität nach THS im dtsz Hamster 5.3 Bedeutung und Ausblick 6 Zusammenfassung 7 Summary 8 Literaturverzeichnis 9 Anhang / Introduction: Deep brain stimulation (DBS) in the globus pallidus internus (nucleus entopeduncularis, EPN, in rodents) is frequently used in generalized forms of dystonia, characterized by abnormal postures and contortions due to involuntary muscle contractions. The development of rational therapeutic approaches or optimization of DBS is hampered by a lack of knowledge about the pathophysiology as well as the mechanism of action of DBS in dystonia. However, changes in neuronal plasticity within the basal ganglia loop seem to play a crucial role in this regard. An important modulator of neuronal plasticity is represented by the perineuronal nets (PNs) located around the cell somata and proximal dendrites of neurons, particularly parvalbumin-reactive (PV+) interneurons. An important component of this condensed extracellular matrix (ECM) subtype are chondroitin sulfate proteoglycans, such as aggrecan and brevican. While the role of abnormal PN expression in the pathophysiology of dystonia is largely unknown, a defect in the brevican gene was found in a form of canine paroxysmal dyskinesia with dystonic symptoms. Thus, PNs may also be involved in the pathophysiology of dystonia. Aims of the studies: Therefore, the first part of this work addressed the hypothesis that basal expression of brevican is altered in dystonia models and PNs have pathophysiological significance in dystonia. Because changes in PN by electrical stimuli may represent an important mechanism of DBS, the second part examined whether antidystonic DBS is associated with changes in neuronal activity (c-Fos) and brevican expression. Animals, Materials, and Methods: The dtsz hamster, in which maturation of PV+ interneurons is probably delayed, was used as a phenotypic model of paroxysmal dystonia. The DYT1 knock-in mouse, which does not show dystonic symptoms, is an etiologic model for a permanent generalized form of dystonia. In both animal models, brevican expression was examined immunohistochemically using intensity measurements and cell counting of brevican-expressing PV+ neurons: dtsz hamster (n = 8; control animals n = 5) and DYT1 KI mouse (n = 9, control animals n = 8), respectively. In addition, examination of protein (western blot) and mRNA expression (qPCR) were performed in the mouse model (n = 6 each). Furthermore, after EPN-DBS at 130 Hz (antidystonic effects) or 40 Hz (tendency to antidystonic effects), both brevican and c-Fos were examined in dtsz and control hamsters vs. sham stimulation (n = 8 dtsz each, n = 5 control animals). Graphical representation and statistical analysis using t-test and ANOVA, respectively, were performed using SigmaPlot (significance level of 5% (p ≤ 0.05)). Results: Comparison of dtsz vs. control hamsters revealed interesting (basal) differences within the basal ganglia network. For example, there was a lower number of brevican-positive cells to total PV+ cells (Brev+/PV+) in motor cortex and striatal weakly PV+ interneurons, while brevican intensities were increased in striatum and ventromedial thalamus. In contrast, the studies in the DYT1 KI mouse revealed only a subtle increase in brevican in the motor cortex. Three-hour DBS in the dtsz hamster (vs. sham) did not result in changes of brevican, but the basal genotype changes were confirmed. Increases in neuronal activity (c-Fos) after EPN-DBS were seen near the electrode tip and a decrease in deep cerebellar nuclei after 130 Hz EPN-DBS. Conclusions: In the dtsz hamster model, developmental disruption of the PN may be involved in the delayed maturation of PV+ interneurons. The other changes are consistent with known regional disturbances in the basal ganglia network. However, it remains unclear whether they represent a cause of the dystonia or a consequence of other changes. DBS, which was only brief and lasted three hours, had no widespread effects on neuronal activity and brevican. Stronger effects are also more likely after the long-term DBS which is still ongoing for 10 days in dtsz hamsters. The basal brevican changes in the dtsz mutant were not evident in the asymptomatic DYT1 KI mouse model, in which the cortical increase in Brev+/PV+ number could, however, be a cause of sensorimotor dysfunction. Thus, although brevican is not generally decreased, it is altered in both dystonia models, so further studies on the pathophysiological significance of brevican as well as other PN components, such as HAPLN4 and aggrecan, seem reasonable.:1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2.1 Dystonien 2.1.1 Definition und Einteilung 2.1.2 Pathophysiologie primärer Dystonien 2.1.2.1 Neuronale Plastizität 2.1.2.2 Neuronale Aktivität 2.1.3 Therapieoptionen für Dystonien 2.1.3.1 Tiefe Hirnstimulation (THS) 2.1.4 Tiermodelle für die primäre Dystonie 2.1.4.1 dtsz Hamstermutante 2.1.4.2 DYT1 KI-Mausmodell 2.2 Extrazelluläre Matrix und perineuronale Netze 2.2.1 Aufbau und Funktion 2.2.2 Manipulationen der Expression von PN-Komponenten 2.2.3 Pathophysiologische Bedeutung von perineuronalen Netzen in Bewegungsstörungen 2.3 Hypothesen der vorliegenden Arbeit 3 Tiere, Material, Methoden 3.1 Tiere 3.1.1 Haltung und Fütterung von Hamstern 3.1.2 Haltung und Fütterung von Mäusen 3.2 Material 3.3 Methoden 3.3.1 Dystonie-Induktion und Beurteilung der Schweregrade beim dtsz Hamster 3.3.2 Tiefe Hirnstimulation dtsz Hamster und Kontrolltiere 3.3.3 Genotypisierung der DYT1 KI-Mäuse 3.3.4 Euthanasie und Probenentnahme 3.3.5 Immunhistochemie (IHC) 3.3.5.1 Brevican und Parvalbumin 3.3.5.2 c-Fos 3.3.5.3 Aggrecan 3.3.6 Western Blot (WB) 3.3.6.1 Probenvorbereitung und Proteinextraktion 3.3.6.2 Durchführung Western Blot 3.3.7 Quantitative Real-Time PCR (qPCR) 3.3.7.1 Probenvorbereitung und mRNA-Isolation 3.3.7.2 cDNA-Synthese und Durchführung qPCR 3.3.8 Statistische Auswertung 3.3.8.1 Statistische Auswertung der IHC 3.3.8.2 Statistische Auswertung des WB 3.3.8.3 Statistische Auswertung der qPCR 4 Ergebnisse 4.1 Basale Veränderungen von Brevican beim dtsz Hamster 4.1.1 Intensität von Brevican 4.1.2 Anteil von Brevican-exprimierenden Parvalbumin-reaktiven (PV+) Zellen 4.1.3 Einzelzellintensität von Brevican an striatalen Parvalbumin-positiven (PV+) Zellen 4.2 Veränderungen von Brevican im DYT1 KI-Mausmodell 4.2.1 Intensität von Brevican bei DYT1 KI-Mäusen 4.2.2 Anteil von Brevican-exprimierenden Parvalbumin-reaktiven (PV+) Zellen 4.2.3 Western Blot 4.2.4 qPCR 4.3 Brevican und Parvalbumin im dtsz Hamstermodell nach Tiefer Hirnstimulation (THS) 4.3.1 Intensität von Brevican bei sham-stimulierten und stimulierten dtsz und Kontrollhamstern 4.3.2 Effekte von 130 Hz THS auf den Anteil von Brevican-exprimierenden Parvalbumin-reaktiven (PV+) Zellen 4.3.3 THS-Effekte auf die Anzahl von PV+ Zellen 4.3.4 Einzelzellintensitäten von Brevican um striatale PV+ Zellen 4.4 Neuronale Aktivität im dtsz Hamstermodell nach Tiefer Hirnstimulation (THS) 4.4.1 c-Fos Intensität in der Umgebung der Elektroden 4.4.2 Anzahl c-Fos-reaktiver Zellen 4.5 Vorversuche zu weiteren Komponenten perineuronaler Netze 4.6 Zusammenfassung der Ergebnisse 5 Diskussion 5.1 Ausgewählte Aspekte zur Methodik 5.1.1 Methodische Aspekte zur Immunhistochemie 5.1.2 Methodische Aspekte zum Western Blot 5.1.3 Methodische Aspekte zur qPCR 5.2 Diskussion der Ergebnisse 5.2.1 Brevican im dtsz Hamster 5.2.2 Brevican in der DYT1 KI-Maus 5.2.3 Brevican und Parvalbumin nach THS im dtsz Hamster 5.2.4 Neuronale Aktivität nach THS im dtsz Hamster 5.3 Bedeutung und Ausblick 6 Zusammenfassung 7 Summary 8 Literaturverzeichnis 9 Anhang