Title: Functional consequences of perinatal hypoxia-ischemia in rat Objectives: The aim of this diploma thesis is to design a set of behavioral tests which provide an effective assessment of motor and cognitive-behavioural deficits in adults rats after experimental hypoxic-ischemic insult during the perinatal period (P7). Supposed benefit is to establish a model of motor and cognitive-behavioural abilities of individuals after this procedure. Methods: The present thesis has a theoretical-empirical character. The practical part describes how the experiment was performed. 32 long Evans Rats were randomly devided into two groups: experimental group (HIE) and control group (Ctrl). The method to produce hypoxic-ischemic brain damage in the 7 day-old rats consisted of right common carotid ligation followed by systemic hypoxia by the inhalation of 8% oxygen and 92% nitrogen. The adult animals (55-75 days old) were tested by the following list of behavioral tests: Bar holding test, Rotarod test, Ladder rung walking test, Reaching test, Open field test and Morris water maze test. Sigma Plot and Microsoft Excel 2010 were the programs used for statistical analysis. Results: Results of Open field test, Ladder rung walking test and Morris water maze test confirmed that hypoxic-ischemic insult affects the...

A avaliação através de imagem por ressonância magnética (RM) com utilização de sequências convencionais demonstra evidência de lesões destrutivas ou malformativas do sistema nervoso central em 70-90% das crianças com paralisia cerebral (PC), embora sua capacidade para identificação de tratos específicos da substância branca seja limitada. A grande variabilidade das lesões da substância branca na PC, já demonstrada por estudos post-mortem, é tida como uma das razões pelas quais as respostas a tratamento se mostrem tão variadas. Nossa hipótese é de que a técnica de imagem por tensores de difusão (TD) seja uma técnica apropriada para caracterização in vivo de lesões em tratos específicos da substância branca em crianças com PC associada à leucomalácia periventricular (LMP). Neste estudo, 24 crianças com PC associada à LMP e 35 controles normais foram avaliados pela técnica. Foram estabelecidos critérios para identificação de 26 tratos da substância branca com base nos mapas de cores bidimensionais gerados utilizando-se TD. Um sistema de escore qualitativo foi criado, com base na inspeção visual dos tratos em comparação com controles pareados por idade, para graduar a gravidade das anormalidades, sendo aplicado para cada trato da substância branca estudado. Foi encontrada uma grande variabilidade do padrão de lesões da substância branca nos pacientes com LMP, com as lesões mais frequentes ocorrendo na porção retrolenticular da cápsula interna, radiação talâmica posterior, coroa radiada e fibras comissurais. A técnica de TD se mostrou adequada para a avaliação in vivo de lesões em tratos específicos da substância branca em pacientes com LMP e, portanto, uma potencial ferramenta diagnóstica valiosa. A avaliação de tratos específicos em pacientes com LMP revelou um conjunto de tratos altamente suscetíveis na LMP, informação relevante que pode ser potencialmente utilizada para condução de opções de tratamento no futuro / Conventional magnetic resonance (MR) imaging shows evidence of brain injury and/or maldevelopment in 70-90% of children with cerebral palsy (CP), though its capability to identify specific white matter tract injury is limited. The great variability of white matter lesions in CP already demonstrated by post-mortem studies is thought to be one of the reasons why response to treatment is so variable. Our hypothesis is that diffusion tensor imaging (DTI) is a suitable technique to provide in vivo characterization of specific white matter tract lesions in children with CP associated with periventricular leukomalacia (PVL). In this study, 24 children with CP associated with PVL and 35 healthy controls were evaluated with DTI. Criteria for identification of 26 white matter tracts on the basis of 2D DTI colorcoded maps were established, and a qualitative scoring system, based on visual inspection of the tracts in comparison with age-matched controls, was used to grade the severity of abnormalities for each white matter tract evaluated. There was marked variability in white matter injury pattern in patients with PVL, with the most frequent injury to the retrolenticular part of the internal capsule, posterior thalamic radiation, superior corona radiata, and commissural fibers. DTI is a suitable technique for in vivo assessment of specific white matter lesions in patients with PVL and, thus, a potentially valuable diagnostic tool. Tract-specific evaluation revealed a family of tracts that are highly susceptible in PVL, important information that can potentially be used to tailor treatment options in the future

A avaliação através de imagem por ressonância magnética (RM) com utilização de sequências convencionais demonstra evidência de lesões destrutivas ou malformativas do sistema nervoso central em 70-90% das crianças com paralisia cerebral (PC), embora sua capacidade para identificação de tratos específicos da substância branca seja limitada. A grande variabilidade das lesões da substância branca na PC, já demonstrada por estudos post-mortem, é tida como uma das razões pelas quais as respostas a tratamento se mostrem tão variadas. Nossa hipótese é de que a técnica de imagem por tensores de difusão (TD) seja uma técnica apropriada para caracterização in vivo de lesões em tratos específicos da substância branca em crianças com PC associada à leucomalácia periventricular (LMP). Neste estudo, 24 crianças com PC associada à LMP e 35 controles normais foram avaliados pela técnica. Foram estabelecidos critérios para identificação de 26 tratos da substância branca com base nos mapas de cores bidimensionais gerados utilizando-se TD. Um sistema de escore qualitativo foi criado, com base na inspeção visual dos tratos em comparação com controles pareados por idade, para graduar a gravidade das anormalidades, sendo aplicado para cada trato da substância branca estudado. Foi encontrada uma grande variabilidade do padrão de lesões da substância branca nos pacientes com LMP, com as lesões mais frequentes ocorrendo na porção retrolenticular da cápsula interna, radiação talâmica posterior, coroa radiada e fibras comissurais. A técnica de TD se mostrou adequada para a avaliação in vivo de lesões em tratos específicos da substância branca em pacientes com LMP e, portanto, uma potencial ferramenta diagnóstica valiosa. A avaliação de tratos específicos em pacientes com LMP revelou um conjunto de tratos altamente suscetíveis na LMP, informação relevante que pode ser potencialmente utilizada para condução de opções de tratamento no futuro / Conventional magnetic resonance (MR) imaging shows evidence of brain injury and/or maldevelopment in 70-90% of children with cerebral palsy (CP), though its capability to identify specific white matter tract injury is limited. The great variability of white matter lesions in CP already demonstrated by post-mortem studies is thought to be one of the reasons why response to treatment is so variable. Our hypothesis is that diffusion tensor imaging (DTI) is a suitable technique to provide in vivo characterization of specific white matter tract lesions in children with CP associated with periventricular leukomalacia (PVL). In this study, 24 children with CP associated with PVL and 35 healthy controls were evaluated with DTI. Criteria for identification of 26 white matter tracts on the basis of 2D DTI colorcoded maps were established, and a qualitative scoring system, based on visual inspection of the tracts in comparison with age-matched controls, was used to grade the severity of abnormalities for each white matter tract evaluated. There was marked variability in white matter injury pattern in patients with PVL, with the most frequent injury to the retrolenticular part of the internal capsule, posterior thalamic radiation, superior corona radiata, and commissural fibers. DTI is a suitable technique for in vivo assessment of specific white matter lesions in patients with PVL and, thus, a potentially valuable diagnostic tool. Tract-specific evaluation revealed a family of tracts that are highly susceptible in PVL, important information that can potentially be used to tailor treatment options in the future

Introdução: Sequelas neurológicas são comuns em prematuros de muito baixo peso ao nascer.A prevenção de injúria cerebral e o desenvolvimento de estratégias neuroprotetorastem sido os principais objetivos da neurologia neonatal moderna. O eletroencefalograma de amplitude integrada (aEEG) é um método de monitorização cerebral contínua que pode auxiliar no diagnóstico precoce e detectar pacientes em risco. Enquanto o seu papel na avaliação de recém nascidos a termo já está bem estabelecido, em prematuros ainda existem dúvidas. Objetivos: avaliar a relação do aEEG realizadoem prematuros de muito baixo peso ao nascer estáveis durante as primeiras 48 horas de vida com alterações graves nos exames de imagemdurante o período neonatal. Métodos: o aEEG foi realizado durante as primeiras 48 horas de vida em prematuros de muito baixo peso ao nascer, estáveis clinicamente, e analisado em relação à atividade de base, ciclo sono vigília e atividade epiléptica. O desfecho adverso considerado foi a alteração grave em exames de imagem (hemorragia periventricular graus 3 ou 4, leucomalácia e outras alterações de substância branca, hidrocefalia) durante o período neonatal. Resultados: 70 pacientes com peso de nascimento médio de 1226g e idade gestacional média de 30 semanas participaram do estudo. Desfechos adversos foram observados em 7 pacientes (10%). Houve relação significativa do aEEG com alterações moderadas a graves na atividade de base com alterações graves nos exames de imagem (p<0,001). O aEEG apresentou uma sensibilidade de 85%, especificidade de 89%, valor preditivo positivo de 46% e valor preditivo negativo de 98% para lesões graves detectadas em US ou RNM durante o período neonatal. Conclusão: em prematuros de muito baixo peso ao nascer, o aEEG precoce com alterações moderadas a graves na atividade de base tem relação com alterações estruturais graves detectadas em exames de imagem no período neonatal. Esse método deve ser considerado como uma ferramenta de triagemauxiliar na detecção de lesões cerebrais nessa população. / Introduction: Neurologic sequelae are common in very low birth weight preterm infants. The prevention of brain injury and the development of neuroprotective strategies have been the main objectives of modern neonatal neurology. The amplitude integrated electroencephalogram (aEEG) is a continuous brain monitoring method that can assist in early diagnosis and detect patients at risk. While the aEEG role in the assessment of full-termnewbornsisalreadywellestablished, in preterminfantsthere are stilldoubts. Objective: To evaluate the relationship between aEEG performed in very low birth weight preterm infants during the first 48 hours of life and severe alterations in imaging tests performed during the neonatal period. Methods: An aEEG was performed during the first 48 hours of life and analyzed for the background activity, sleep wake cycle, and epileptic activity. Severe lesionson imaging tests (grade 3 or 4 periventricular hemorrhage, leukomalacia and other white matter changes, and hydrocephalus) during the neonatal period were considered as adverse conditions. Results: A total of 70 patients with a mean birth weight of 1226g and mean gestational age of 30 weeks participated in the study. Adverse outcomes were observed in 7 patients (10%). There was a significant relationship (p<0.001) between moderate to severe abnormalities on the aEEGand severe alterations observed on the imaging tests, for both ultrasonography (US) and magnetic resonance imaging (MRI). The aEEG showed a sensitivity of 85%, specificity of 89%, positive predictive value of 46%, and negative predictive value of 98% for serious lesions detected on the imaging during the neonatal period. Conclusion: In very low birth weight preterms, early aEEG with moderate to severe background activity is associated with severe structural changes detected in imaging studies conductedduring the neonatal period. This method should be considered as an auxiliary screening tool for the detection of brain lesions in this population.

Introdução: Sequelas neurológicas são comuns em prematuros de muito baixo peso ao nascer.A prevenção de injúria cerebral e o desenvolvimento de estratégias neuroprotetorastem sido os principais objetivos da neurologia neonatal moderna. O eletroencefalograma de amplitude integrada (aEEG) é um método de monitorização cerebral contínua que pode auxiliar no diagnóstico precoce e detectar pacientes em risco. Enquanto o seu papel na avaliação de recém nascidos a termo já está bem estabelecido, em prematuros ainda existem dúvidas. Objetivos: avaliar a relação do aEEG realizadoem prematuros de muito baixo peso ao nascer estáveis durante as primeiras 48 horas de vida com alterações graves nos exames de imagemdurante o período neonatal. Métodos: o aEEG foi realizado durante as primeiras 48 horas de vida em prematuros de muito baixo peso ao nascer, estáveis clinicamente, e analisado em relação à atividade de base, ciclo sono vigília e atividade epiléptica. O desfecho adverso considerado foi a alteração grave em exames de imagem (hemorragia periventricular graus 3 ou 4, leucomalácia e outras alterações de substância branca, hidrocefalia) durante o período neonatal. Resultados: 70 pacientes com peso de nascimento médio de 1226g e idade gestacional média de 30 semanas participaram do estudo. Desfechos adversos foram observados em 7 pacientes (10%). Houve relação significativa do aEEG com alterações moderadas a graves na atividade de base com alterações graves nos exames de imagem (p<0,001). O aEEG apresentou uma sensibilidade de 85%, especificidade de 89%, valor preditivo positivo de 46% e valor preditivo negativo de 98% para lesões graves detectadas em US ou RNM durante o período neonatal. Conclusão: em prematuros de muito baixo peso ao nascer, o aEEG precoce com alterações moderadas a graves na atividade de base tem relação com alterações estruturais graves detectadas em exames de imagem no período neonatal. Esse método deve ser considerado como uma ferramenta de triagemauxiliar na detecção de lesões cerebrais nessa população. / Introduction: Neurologic sequelae are common in very low birth weight preterm infants. The prevention of brain injury and the development of neuroprotective strategies have been the main objectives of modern neonatal neurology. The amplitude integrated electroencephalogram (aEEG) is a continuous brain monitoring method that can assist in early diagnosis and detect patients at risk. While the aEEG role in the assessment of full-termnewbornsisalreadywellestablished, in preterminfantsthere are stilldoubts. Objective: To evaluate the relationship between aEEG performed in very low birth weight preterm infants during the first 48 hours of life and severe alterations in imaging tests performed during the neonatal period. Methods: An aEEG was performed during the first 48 hours of life and analyzed for the background activity, sleep wake cycle, and epileptic activity. Severe lesionson imaging tests (grade 3 or 4 periventricular hemorrhage, leukomalacia and other white matter changes, and hydrocephalus) during the neonatal period were considered as adverse conditions. Results: A total of 70 patients with a mean birth weight of 1226g and mean gestational age of 30 weeks participated in the study. Adverse outcomes were observed in 7 patients (10%). There was a significant relationship (p<0.001) between moderate to severe abnormalities on the aEEGand severe alterations observed on the imaging tests, for both ultrasonography (US) and magnetic resonance imaging (MRI). The aEEG showed a sensitivity of 85%, specificity of 89%, positive predictive value of 46%, and negative predictive value of 98% for serious lesions detected on the imaging during the neonatal period. Conclusion: In very low birth weight preterms, early aEEG with moderate to severe background activity is associated with severe structural changes detected in imaging studies conductedduring the neonatal period. This method should be considered as an auxiliary screening tool for the detection of brain lesions in this population.

Introdução: Sequelas neurológicas são comuns em prematuros de muito baixo peso ao nascer.A prevenção de injúria cerebral e o desenvolvimento de estratégias neuroprotetorastem sido os principais objetivos da neurologia neonatal moderna. O eletroencefalograma de amplitude integrada (aEEG) é um método de monitorização cerebral contínua que pode auxiliar no diagnóstico precoce e detectar pacientes em risco. Enquanto o seu papel na avaliação de recém nascidos a termo já está bem estabelecido, em prematuros ainda existem dúvidas. Objetivos: avaliar a relação do aEEG realizadoem prematuros de muito baixo peso ao nascer estáveis durante as primeiras 48 horas de vida com alterações graves nos exames de imagemdurante o período neonatal. Métodos: o aEEG foi realizado durante as primeiras 48 horas de vida em prematuros de muito baixo peso ao nascer, estáveis clinicamente, e analisado em relação à atividade de base, ciclo sono vigília e atividade epiléptica. O desfecho adverso considerado foi a alteração grave em exames de imagem (hemorragia periventricular graus 3 ou 4, leucomalácia e outras alterações de substância branca, hidrocefalia) durante o período neonatal. Resultados: 70 pacientes com peso de nascimento médio de 1226g e idade gestacional média de 30 semanas participaram do estudo. Desfechos adversos foram observados em 7 pacientes (10%). Houve relação significativa do aEEG com alterações moderadas a graves na atividade de base com alterações graves nos exames de imagem (p<0,001). O aEEG apresentou uma sensibilidade de 85%, especificidade de 89%, valor preditivo positivo de 46% e valor preditivo negativo de 98% para lesões graves detectadas em US ou RNM durante o período neonatal. Conclusão: em prematuros de muito baixo peso ao nascer, o aEEG precoce com alterações moderadas a graves na atividade de base tem relação com alterações estruturais graves detectadas em exames de imagem no período neonatal. Esse método deve ser considerado como uma ferramenta de triagemauxiliar na detecção de lesões cerebrais nessa população. / Introduction: Neurologic sequelae are common in very low birth weight preterm infants. The prevention of brain injury and the development of neuroprotective strategies have been the main objectives of modern neonatal neurology. The amplitude integrated electroencephalogram (aEEG) is a continuous brain monitoring method that can assist in early diagnosis and detect patients at risk. While the aEEG role in the assessment of full-termnewbornsisalreadywellestablished, in preterminfantsthere are stilldoubts. Objective: To evaluate the relationship between aEEG performed in very low birth weight preterm infants during the first 48 hours of life and severe alterations in imaging tests performed during the neonatal period. Methods: An aEEG was performed during the first 48 hours of life and analyzed for the background activity, sleep wake cycle, and epileptic activity. Severe lesionson imaging tests (grade 3 or 4 periventricular hemorrhage, leukomalacia and other white matter changes, and hydrocephalus) during the neonatal period were considered as adverse conditions. Results: A total of 70 patients with a mean birth weight of 1226g and mean gestational age of 30 weeks participated in the study. Adverse outcomes were observed in 7 patients (10%). There was a significant relationship (p<0.001) between moderate to severe abnormalities on the aEEGand severe alterations observed on the imaging tests, for both ultrasonography (US) and magnetic resonance imaging (MRI). The aEEG showed a sensitivity of 85%, specificity of 89%, positive predictive value of 46%, and negative predictive value of 98% for serious lesions detected on the imaging during the neonatal period. Conclusion: In very low birth weight preterms, early aEEG with moderate to severe background activity is associated with severe structural changes detected in imaging studies conductedduring the neonatal period. This method should be considered as an auxiliary screening tool for the detection of brain lesions in this population.

Les grands prématurés sont particulièrement vulnérables aux lésions inflammatoires de la substance blanche (WMI) qui augmentent le risque de troubles cognitifs et neurodéveloppementaux à long terme dans cette population. L’utilisation de l’imagerie par résonance magnétique (IRM) dans cette population a permis une évaluation non invasive de la progression des WMI et une meilleure compréhension de la pathologie. Les WMI sont associées une activation de la microglie et des astrocytes et la production de facteurs pro-inflammatoires, dont l’interleukine 1 (IL-1). En utilisant un modèle de WMI induite par injection intracérébrale de lipopolysaccharides (LPS), nous avons évalué dans un premier temps les changements de méthylation de l’ADN durant la phase aigüe (24 h) et la phase chronique (21 jours) de l’inflammation. Par la suite, nous avons déterminé la capacité de l’IRM multimodale de détecter la lésion et la réponse thérapeutique à un antagoniste du récepteur de l’IL-1. Finalement, par le biais d’un antagoniste et d’un modulateur allostérique du récepteur à l’IL-1, nous avons évalué in vitro le rôle de la signalisation IL-1 durant la phase aigüe de la modulation de l’activation de la microglie et des astrocytes par le LPS. Nous avons démontré la présence d’une altération du méthylome cérébral dans divers mécanismes liés au neurodéveloppement et à la réponse immunitaire. De plus, l’application de l’IRM multimodale dans notre modèle a permis d’évaluer in vivo la lésion et le début de la réponse thérapeutique durant la phase aigüe (24 h) de l’inflammation. L’évaluation à l’IRM corrèle aux changements observés par immunomarquage post mortem. In vitro, le LPS induit une réponse mixte de la microglie et des astrocytes qui évoluent dans le temps vers une réponse pro-inflammatoire et neurotoxique. Bien que l’IL-1 est hautement exprimée par la microglie et les astrocytes, son inhibition a un effet limité sur la modulation de l’activation gliale dû à la multitude de voies activées par le LPS durant la phase aigüe de l’inflammation. / Very premature infants are particularly vulnerable to inflammatory white matter injury (WMI) which increases the risk of long-term cognitive and neurodevelopmental disorders in this population. The use of magnetic resonance imaging (MRI) in this population has allowed non-invasive assessment of the progression of WMI and a better understanding of the pathology. WMI is associated with activation of microglia and astrocytes and the production of pro-inflammatory mediators, including interleukin 1 (IL-1). Using a model of inflammatory WMI induced by intracerebral injection of lipopolysaccharides (LPS), we first evaluated the changes in DNA methylation during the acute phase (24 h) and the chronic phase (21 days) of inflammation. We then determined the ability of multimodal MRI to detect the lesion and the therapeutic response to an IL-1 receptor antagonist. Finally, using an antagonist and an allosteric modulator of the IL-1 receptor, we evaluated in vitro the contribution of IL-1 signaling during the acute phase of the modulation of microglia and astrocytes activation by LPS. We have shown the presence of persistent alteration DNA methylation profile in the brain that was associated with pathways involved in neurodevelopment and immune response. In addition, the application of multimodal MRI in our model made it possible to evaluate in vivo the lesion and the therapeutic response during the acute phase (24 h) of the inflammation. The changes at the MRI correlated to post-mortem evaluation by immunostaining. In vitro, LPS induce a mixed response of microglia and astrocytes which evolved over time toward a pro-inflammatory and neurotoxic phenotype. Although IL-1 is highly expressed by microglia and astrocytes, its inhibition has a limited effect on the modulation of glial activation due to the multitude of pathways activated by LPS during the acute phase of inflammation.