Interaktionen zwischen Insekten und Pflanzen können auf chemischen oder mechanischen Faktoren beruhen. Mechanische Faktoren spielen eine besonders wichtige Rolle bei den Fallen karnivorer Pflanzen. Ziel dieser Arbeit war es, die Rolle mechanischer Faktoren in der Interaktion zwischen der Kannenpflanze Nepenthes bicalcarata und der Ameise Camponotus schmitzi aufzuklären, bei der Ameisen Gegenanpassungen zu spezialisierten pflanzlichen Fangstrukturen entwickelt haben. Im Rahmen meiner Arbeit habe ich mich mit den Fragen beschäftigt, 1) welche Kannenstrukturen und welche Mechanismen für den Fang von Arthropoden wichtig sind und 2) welche speziellen Anpassungen C. schmitzi-Ameisen für das Leben auf ihrer karnivoren Wirtspflanze besitzen. Bisher wurde angenommen, dass Nepenthes-Kannen Tiere mit Hilfe von rutschigen Wachskristallschichten fangen. Ich konnte zeigen, dass ein weiterer, bisher unbekannter Fangmechanismus existiert, welcher auf speziellen Oberflächeneigenschaften des Kannenrandes (Peristom) und "Insekten-Aquaplaning" basiert. Das Peristom besitzt eine regelmäßige Mikrostruktur, welche dafür sorgt, dass die Oberfläche vollständig mit Wasser benetzbar ist, so dass sie bei feuchter Witterung von homogenen Flüssigkeitsfilmen überzogen ist. Auf dem trockenen Peristom können Ameisen ohne Schwierigkeiten laufen und Nektar von den am inneren Peristomrand gelegenen Nektarien ernten. Wird die Oberfläche aber beispielsweise durch Regen nass, rutschen die meisten Tiere ab und stürzen in die Kanne. Messungen der Reibungskräfte von Weberameisen (Oecophylla smaragdina) auf dem Peristom von N. bicalcarata zeigten, dass Flüssigkeitsfilme auf der Oberfläche die Anhaftung der Haftorgane (Arolien) verhindern, und dass die Mikrostruktur des Peristoms auch den Einsatz der Krallen unterbindet. Versuche an Nepenthes alata zeigten darüber hinaus, dass dieser Fangmechanismus des Peristoms auch für Nepenthes-Arten mit wachsbereifter Kanneninnenwand essentiell, und die Wachsschicht eher für die Retention gefangener Tiere wichtig ist. Zur Analyse der ökologischen Auswirkungen des "Aquaplaning"-Fangmechanismus habe ich die Peristomfeuchte von Nepenthes rafflesiana var. typica-Kannen zeitgleich mit meteorologischen Daten im Feld kontinuierlich aufgezeichnet und mit Experimenten zur Beurteilung der Fangeffizienz der Kannen kombiniert. Die Ergebnisse dieser Versuche zeigen, dass die Kannen abhängig vom Befeuchtungsgrad des Peristoms zeitweise sehr effiziente Fallen mit Fangraten von 80% sein können, während sie zu anderen Zeiten vollkommen ineffizient sind. Die Variation der Peristomfeuchte wird durch Regen, Kondensation und von den Peristomnektarien sezerniertem Nektar verursacht. Es ist zu vermuten, dass die nur zeitweise und unvorhersehbare Aktivierung der Nepenthes-Kannenfallen durch Nässe der Evolution von Vermeidungsstrategien bei Beutetieren entgegenwirkt. Im Rahmen der Untersuchungen, welche mechanischen Anpassungen C. schmitzi-Ameisen für das Leben auf N. bicalcarata besitzen habe ich mich auf die Fragen konzentriert, wie es den Ameisen gelingt den Peristom-Fangmechanismus zu umgehen und welche Anpassungen sie besitzen um in der Kannenflüssigkeit tauchend und schwimmend nach Nahrung zu suchen. Im Gegensatz zu generalistischen Arten stürzen C. schmitzi-Ameisen auf dem nassen Peristom nicht ab. Durch selektive Manipulation der tarsalen Haftstrukturen konnte ich demonstrieren, dass die Arolien für die Peristomlauffähigkeit der C. schmitzi-Ameisen eine wesentliche Rolle spielen. Für das Furagieren in der Kannenflüssigkeit verfügen C. schmitzi-Ameisen über ein sich wiederholendes, stereotypes Verhaltensmuster, welches aus einer Unterwasserlauf- und einer Oberflächenschwimmphase besteht. Meine Untersuchungen dieses Verhaltensmusters zeigten, dass die Ameisen am Ende der Unterwasserlaufphase mit Hilfe ihres stets vorhandenen Auftriebs zur Flüssigkeitsoberfläche aufsteigen. Dabei taucht ein Teil ihres Hinterleibs aus der Kannenflüssigkeit auf, was den Ameisen die Sauerstoffaufnahme aus der Luft ermöglicht. Nach dem Auftauchen schwimmen C. schmitzi-Ameisen mittels schneller Beinbewegungen an der Oberfläche der Kannenflüssigkeit. Dabei ähnelt die Bewegungskoordination ihrer Beine dem bei Ameisen für die Fortbewegung an Land typischen Dreifußgang. Ein Vergleich der Kinematik von schwimmenden und laufenden C. schmitzi-Ameisen hat gezeigt, dass schwimmende Ameisen ihre Beine in der Schlagphase mit einer höheren Winkelgeschwindigkeit als in der Rückholphase bewegen, während dies bei den laufenden Tieren genau umgekehrt ist. Ferner strecken schwimmende Ameisen ihre Beine während der Schlagphase weiter aus als in der Rückholphase, wohingegen laufende Ameisen in beiden Bewegungsphasen vergleichbare Beinradien aufweisen. Dies lässt den Schluss zu, dass die Schwimmkinematik der C. schmitzi-Ameisen eine abgewandelte Form ihrer Laufkinematik darstellt, welche für die Erzeugung von Vortrieb im Wasser optimiert wurde. / Insect-plant interactions based on either chemical or mechanical factors, play a key role in nature. Mechanical factors are of particular importance for the animal traps of carnivorous plants. The aim of this study is to clarify the role of mechanical factors in the interaction between the pitcher plant Nepenthes bicalcarata and its ant partner, Camponotus schmitzi which has evolved counter adaptations against the specialised capture structures of the plant. This study investigates two questions, firstly, which of the pitchers' structures and which mechanisms are important for the capture of arthropods and secondly, what are the special adaptations that enable the C. schmitzi ants to live on their carnivorous host plant. It has so far been suggested, that Nepenthes pitchers capture prey by means of slippery epicuticular wax crystals. I was however able to show, that another, yet unknown capture mechanism exists. It is based on the special surface properties of the pitcher rim (peristome) and on the phenomenon of insect "aquaplaning". The peristome is characterized by a regular microstructure with radial ridges of smooth overlapping epidermal cells, which form a series of steps toward the pitcher interior. This surface is completely wettable by water, so that under humid weather conditions it is covered by homogenous liquid films. If the peristome is dry, ants can run freely on it and harvest nectar from the nectaries at the inner margin of the peristome. As soon as the peristome surface is wetted, for example by rain, it becomes extremely slippery for insects, so that most of the ant visitors are trapped. By measuring the friction forces of weaver ants (Oecophylla smaragdina) on the peristome of N. bicalcarata, I was able to show that the liquid films on the surface disrupt attachment for the soft adhesive pads (arolia) and that the surface topography impedes the use of claws. Experiments on Nepenthes alata demonstrated that the trapping mechanism of the peristome is also essential in Nepenthes species with waxy inner pitcher walls, indicating that the waxy surfaces are more important for the retention rather than the capture of prey. I investigated the ecological implications of the "aquaplaning" capture mechanism in Nepenthes rafflesiana var. typica by combining meteorological data and continuous field measurements of peristome wetness with experimental assessments of the pitchers’ capture efficiency. My results demonstrate that pitchers can be highly effective traps with capture rates as high as 80% but are completely ineffective at other times. These dramatic changes are due to the wetting conditions of the peristome. Variation of peristome wetness and thus the variation of capture efficiency is caused by rain, condensation, and nectar secreted from the peristome nectaries. I propose that the intermittent and unpredictable activation of Nepenthes pitcher traps prevents the evolution of avoidance strategies in prey animals. In the second part of my study I investigated the mechanical adaptations that the C. schmitzi possess in order to live on N. bicalcarata. I focused on two principal questions, how are the ants able to circumvent the peristome capture mechanism and what adaptations do they need in order to swim and dive in the digestive fluid. In contrast to generalist ants, C. schmitzi ants are capable of running on the wet peristome without difficulties. Through selective manipulation of tarsal attachment structures I was able to demonstrate, that the arolia are essential for the ants’ capability to run on the wet peristome. Whilst foraging in the pitcher fluid C. schmitzi ants show a repetitive stereotyped behaviour pattern, consisting of an underwater running and surface swimming phase. My analysis of this behaviour pattern showed that at the end of the underwater running phase the ants advance to the fluid surface with the aid of buoyancy. When reaching the surface film parts of the ants’ gaster and head emerge. I was able to show that while foraging in the pitcher fluid the emerging of the gaster is crucial for the respiration of the ants. After emersion the ants swim at the surface of the pitcher fluid using fast leg movements. Hence the leg coordination is similar to a tripod gait which is typical for their locomotion on land. A comparison between the kinematics of swimming and running C. schmitzi ants showed that whilst swimming, the angular velocity of their legs is higher in the stroke than in the recovery, whereas the opposite is true whilst running. Furthermore the swimming ants stretch their legs further in the stroke than in the recovery whereas the leg radius of running ants does not vary much throughout a step. It can be concluded that the swimming kinematics of C. schmitzi ants derives from the kinematics of their running and has been optimized for generating thrust in water.

Die Naturstoffchemie ist ein bedeutendes Teilgebiet der Chemie, da die Naturstoffe, mit ihrer breiten strukturellen Diversität, als neue Leitstrukturen für die Entwicklung spezifisch wirksamer Agrochemikalien und Arzneimittel dienen. Pflanzen und Bodenorganismen sind daher aussichtsreiche Quellen für neue Wirkstoffe im Bereich Pflanzenschutz- und Pharmaforschung. Aus der in der Kongo-Region beheimateten Liane Ancistrocladus ealaensis J. LEONARD (Ancistrocladaceae) wurde sieben Metabolite isoliert: Amyrin, 3,3-Di-O-methylellagsäure, zwei bisher unbekannte Naphthylisochinoline, Ancistroealain A und B, sowie drei Naphthoesäuren, die hier erstmals beschriebenen Ancistronaphthoesäuren A und B, sowie die bisher nur als Syntheseprodukt bekannte Eleutherolsäure. Ausgehend von Ancistroealain A gelang die stereoselektive Partialsynthese des bekannten Ancistrobertsonin C. Ancistroealain A zeigte in-vitro eine zehnfach höhere Aktivität gegen Leishmania donovani, dem Erreger der visceralen Leishmaniose, als das derzeit bei der Behandlung eingesetzte Pentostam. Um für In-vivo-Untersuchungen genug Material zur Verfügung stellen zu können, wurde ein totalsynthetischer Zugang etabliert. Die Suzuki-Kupplung eines geeigneten Isochinolin-Bausteines (zehn Stufen ausgehend von 3,5-Dimethoxybenzoesäure) mit einer Naphthalin-Boronsäure (acht Stufen ausgehend von 3-Methoxybenzaldehyd) führte in einer Gesamtausbeute von 9.2 % bzw. 6.2 % zu dem Naturstoff. Ancistroealain A und sein Atropdiastereomer Ancitrotanzanine B, die an einer chiralen HPLC-Phase getrennt werden konnten, entstanden aufgrund der asymmetrischen Induktion durch das stereogene Zentrum C-3 in einem Verhältnis von 45:55. Der Ansatz einer atropselektiven Suzuki-Kupplung mit chiralem Katalysator führte zu Diastereomerenüberschüssen bis zu 75:25. Aus Pavetta crassipes K. SCHUMANN (Rubiaceae) konnte das Phythosterol Ursolsäure isoliert werden, während aus Rothmannia urcelliformis (HIERN) BULLOCK (Rubiaceae) 1-epi-Geniposid und Gardenamid A isoliert wurde. Im Rahmen einer Kooperation mit H. Rischer gelang die Isolierung von Plumbagin, Plumbasid A und Rossolisid aus der in Neu Guinea beheimateten tropischen Kannenpflanze Nepenthis insignis DANSER. Bei Verfütterungsexperimenten wurde (L)-[13C3,15N]-Alanin in die Kannen von sterilen Pflanzen eingebracht und ein Einbau in Plumbagin beobachtet. Die Pflanze verstoffwechselt die Aminosäuren auf den üblichen Abbauwegen und erlaubt so die Verfütterung von Alanin als ‚maskiertes’ Acetat. Das beobachtete Einbaumuster bewies die polyketidische Biosynthese von Plumbagin. In einer Kooperation mit Prof. Fiedler (Tübingen) wurden Streptomyceten aus extremen Habitaten auf die Produktion interessanter Sekundärmetabolite untersucht und z.B. bekannte Verbindungen wie Sulfomycin I, Benzoesäure, p-(Dimethylamino)-benzoesäure, Juliochrome Q3-3 und Dehydrorabelomycin nachgewiesen. Der alkalophile Stamm AK 409 produzierte Pyrrol-2-carbonsäure und Pyrocoll, das im Rahmen dieser Arbeit erstmals als Naturstoff auftrat. Besonderes Interesse erregten die Antitumor-Eigenschaften von Pyrocoll. Die durchgeführte ‚biomimetische’ Synthese von Pyrocoll ausgehend von Pyrrol-2-carbonsäure ermöglichte es uns, die für die In-vivo-Biotests nötigen Substanzmengen darzustellen. Aus dem Streptomyceten AK 671 wurden eine bekannte Anthrachinoncarbonsäure und ein als Naturstoff neuartiges Diketonaphthalinglucuronid isoliert. Eine enzymatische Hydrolyse führte zu dem Harris-Franck-Keton, das in dem Kulturfiltrat erstmals als Naturstoff nachgewiesen werden konnte. Das bei Verfütterungsexperimenten mit [13C2]-Acetat von uns beobachtete Einbaumuster in das Glucuronid erlaubte die Aufklärung der Schlüsselschritte der Biogenese. Bei der Synthese von Naphthylisochinolinen besteht die zentrale Aufgabe in dem Aufbau der Biarylachse. Bei der Synthese von Ancistrobertsonin A nach dem ‚Lacton-Konzept’ wird ein Naphtalin-Baustein mit einer zusätzlichen C1-Einheit für die Esterbrücke benötigt, die nach der Kupplung entfernt werden muß. Hierzu bewährte sich bei Versuchen an einem Modelsystem die Reaktionssequenz Baeyer-Villiger-Oxidation, Triflierung und reduktive Eliminierung. Der für die Synthese von Ancistrobertsonin A benötigte Naphthalin-Bausteines wurde in neun Stufen (Gesamtausbeute: 37 % bzw. 13%) dargestellt. Die Synthese des Isochinolin-Bausteines gelang in zwölf Stufen (9.4 %). Der Abschluß dieser Synthese ist in zukünftigen Arbeiten geplant. / The natural product chemistry is a important part of chemistry because natural products, with there broad variety of structural features, are new leads for the development of specific pharmaceuticals and pesticides. Plants and microorganisms are excellent sources for new active compounds in pest control and pharmacy. Ancistrocladus ealaensis J. Léonard (Ancistrocladaceae), a tropical liana indigenous to Central Africa, belongs to the small monogeneric family of the Ancistrocladaceae. Seven metabolites were isolated: the well-known phytosterol -amyrin , 3,3- di-O-methylellagic acid, two new 5,8’-coupled naphthylisoquinoline alkaloids, ancistroealaines A and B , and three naphthoic acids, the synthetically known eleutherolic acid and the two new naphthoic acids ancistronaphthoic acids A and B. Ancistrobertsonine C was synthesized by stereoselective partial-synthetic preparation starting from ancistroealaine A. Against Leishmania donovani, the pathogen of visceral Leishmaniasis, we found excellent activities of ancistroealaine A, ten times more active than the standard pentostam. The synthesis of ancistroealaine A was established to allow further investigations on the in vivo activities. Starting from 3-methoxybenzaldehyde, the naphthalene moiety was prepared in eight steps. The isoquinoline part was synthesized starting from 3,5-dimethoxybenzoic acid in ten steps. The concluding Suzuki coupling resulted in the natural product with an overall yield of 9.2 % or 6.2 % and a diastereomeric ratio of 45:55 induced by the chiral center C-3. The atropoisomeres were separated by chromatography on a chiral phase. The application of a catalytic atroposelective Suzuki coupling gave diastereomeric ratios up to 75:25 Ursolic acid was found in Pavetta crassipes K. SCHUMANN (Rubiaceae), a shrub indigenous to tropical Africa, whereas 1-epi-geniposide and gardenamide A were isolated from Rothmannia urcelliformis (HIERN) BULLOCK, a small tree, which is widespread in the forests of East Africa. In this work, the absolute configuration of gardenamide A was established. From Nepenthes insignis Danser, a species occurring in the lowlands of New Guinea, three metabolites were isolated: Plumbagin, plumbaside A and rossoliside. Feeding experiments with (L)-[13C3,15N]-alanine revealed the acetogenic origin of plumbagin. This work showed that alanine is transformed into acetyl-CoA and can be used as a ‘masked’ precursor. None of the two glycosides were labelled after any of the feeding experiments. They probably constitute storage forms of the respective naphthoquinones. In cooperation with Prof. Fiedler et al. Streptomyces strains, living under extreme conditions, were screened for secondary metabolites. A number of known compounds such as sulfomycine I, benzoic acid, p-(dimethylamino)-benzoic acid, juliochrome Q3-3 and dehydrorabelomycine were found. The alcalophilic strain AK 409 became attractive due to the isolation of two metabolites, pyrrol-2-carboxylic acid and pyrocoll, the latter found as a natural product for the first time. Pyrocoll exhibited in vitro high anticancer activities. ‘Biomimetic’ synthesis of pyrocoll, starting from pyrrol-2-carboxylic acid led to the desired material and showed a better yield (91 %) than all synthetic pathways previously known. From the strain AK671 two natural products were isolated: a known anthraquinone carboxylic acid and a new diketonaphthalene glucuronide. Enzymatic hydrolysis gave the Harris-Franck ketone, a known synthetic compound, which was found as natural product in the culture for the first time. Even though the enzymes that are responsible for the biosynthetic construction of anthraquinones are well known, intermediates as such are isolated only very rarely. Feeding experiments with [13C2]-acetate resolved the biosynthesis of the Harris-Franck ketone and proofed it to be an intermediate in the synthesis of anthraquinones. For the synthesis of ancistrobertsonine A the ‘lactone concept’ was used. Therefore a naphthalene building block with an additional C1-unit next to the axis was needed. The necessary removal of this group (Baeyer-Villiger oxidation, conversion to the triflate and reductive elimination) after the coupling was tested on a model system. The synthesis of ancistrobertsonine A was developed up to the esterification of the naphthalene building block (synthesised in nine steps) and the isoquinoline moiety (synthesised, starting from 3,5-dimethoxybenzoic acid in twelve steps). The synthesis will be finished in future work.

In der vorliegenden Arbeit wurden lichtaktivierte Nucleotidcyclasen auf Basis der lichtaktivierten Adenylatcyclase bPAC (=BlaC, Ryu et al., 2010; Stierl et al., 2011), sowie der direkt lichtaktivierbare Kationenkanal Channelrhodopsin-2 (Nagel et al., 2003) eingesetzt, um lichtinduzierte und damit nicht-invasive Manipulationen der Second Messenger cAMP, cGMP und Calcium, sowie des Membranpotentials in Pflanzenzellen vorzunehmen. Nach transienter Transfektion von N. benthamiana konnte sowohl die Expression der beiden Channelrhodopsinvarianten C128A::YFP und C128T::YFP (unveröffentlichte Daten von R. Gueta und G. Nagel, 2008, Berndt et al., 2009; Bamann et al., 2010), als auch deren Lokalisation in der Plasmamembran von Protoplasten fluoreszenzmikroskopisch gezeigt werden. Die Funktion von Channelrhodopsin als lichtaktivierbarer Kationenkanal konnte in dieser Arbeit erstmals elektrophysiologisch in Pflanzenzellen nachgewiesen werden. In Einstichmessungen im Mesophyllgewebe von N. benthamiana wurden reproduzierbar blaulichtinduzierte Depolarisationen der Plasmamembran erzielt, die in Dauer und Frequenz über das applizierte Lichtmuster steuerbar waren. In Patch-Clamp-Messungen an epidermalen Protoplasten von N. benthamiana, welche transient Channelrhodopsin-2-C128A und Channelrhodopsin-2-C128T exprimierten, konnten zudem blaulichtinduzierte Einwärts-Ströme gezeigt werden. Die Expression der beiden verwendeten Channelrhodopsinvarianten schien hierbei annähernd unabhängig von der vorliegenden Konzentration des zugegebenen Retinals. Des Weiteren konnte in A. thaliana sowohl die Expression als auch die Funktion der lichtaktivierbaren Adenylatcyclase bPAC::YFP (Stierl et al., 2011), sowie einer hieraus durch gezielte Mutation (nach Ryu et al., 2010) abgeleiteten lichtaktivierbaren Guanylatcyclase (bPGC::YFP) erstmalig in höheren Pflanzen gezeigt werden. Nach Bestätigung der Funktion dieser beiden lichtaktivierbaren Nucleotidcyclasen in transient transfizierten Protoplasten von A. thaliana wurden zwei stabil transgene Pflanzenlinien generiert. ZUSAMMENFASSUNG DER ARBEIT - 190 - Pflanzen dieser Linie exprimierten neben dem konstitutiv unter der Kontrolle des 35S-CaMV-Promotors exprimierten Calciumreporterprotein Aequorin zusätzlich und unter der Kontrolle eines östrogeninduzierbaren Glucocorticoidpromotors (Zuo et al., 2000) die lichtaktivierten Nucleotidcyclasen bPAC::YFP bzw. bPGC::YFP. In beiden stabil transgenen Pflanzenlinien wurden Expression und Funktion der jeweiligen lichtaktivierten Nucleotidcyclase gezeigt. In Messungen an einem modifizierten Luminometer konnten weiterhin erstmals blaulichtinduzierte Calciumsignaturen in Pflanzenzellen generiert werden. Auf die Folge von Blaulichtpulsen kam es wiederholt zum Calciumeinstrom in Zellen der erstellten transgenen Pflanzenlinien. Neben der Möglichkeit, sowohl die Konzentration der cyclischen Nucleotide als auch des cytoplasmatischen Calciums über Licht zu manipulieren, wurde durch diese Pflanzen ein direkter Zusammenhang beider Second Messenger gezeigt. Weiterhin sind phänotypische Auffälligkeiten der erstellten Pflanzenlinien beobachtet worden. Es kam zur Verzögerung des Keimungszeitpunktes bPAC::YFP-exprimierender Samen im Licht, jedoch wuchsen die Pflanzen im Anschluss an die verzögerte Keimung normal und uneingeschränkt weiter. In bPAC::YFP-exprimierenden Pollen von Nicotiana SR-1 konnte zudem das Wachstum der Pollenschläuche durch blaues Licht gestoppt werden. bPGC::YFP-exprimierende Pollen hingegen zeigten auch im blauen Licht unverändertes Pollenschlauchwachstum. Neben den beiden erfolgreich generierten, stabil transgenen Pflanzenlinien wurden in analogen Ansätzen transgene A. thaliana Col-0 Aequorin Zellkulturlinien generiert, die neben dem konstitutiv aktiven Calciumreporterprotein Aequorin ebenso bPAC::YFP bzw. bPGC::YFP unter der Kontrolle des östrogeninduzierbaren Glucocorticoidpromotors (Zuo et al., 2000) exprimierten. Auch hier konnten Expression und Funktion beider Nucleotidcyclasen immunologisch und fluoreszenzmikroskopisch gezeigt werden. Über den Einsatz einer sog. 2A-Sequenz wurde weiterhin ein funktionsfähiges Fusionskonstrukt aus dem cAMP-aktivierten Kationenkanal CNGA2 (C460W-E583M, nach Rich et al., 2001) und der lichtaktivierten Adenylatcyclase EuPACα (Iseki et al., 2002) erstellt. Die Funktion dieses Fusionskonstruktes wurde elektrophysiologisch sowie immunologisch gezeigt. / In this study, light-activated nucleotide cyclases based on bPAC (= BlaC, Ryu et al., 2010; Stierl et al., 2011), and the direct light-activated cation channel channelrhodopsin-2 (Nagel et al., 2003) have been used to non-invasively manipulate the level of the second messengers cAMP, cGMP and calcium as well as the membrane potential in plant cells by means of light. After transient transfection of N. benthamiana, the expression of the two channelrhodopsin variants C128A and C128T (unpublished data from Ronnie Gueta and G. Nagel 2008; Berndt et al., 2009; Bamann et al., 2010) as well as their correct localization in the plasma membrane, was shown by fluorescence microscopy imaging. The general function of channelrhodopsin as a light-activated cation channel was shown for the first time electrophysiologically in higher plants. Using impalement measurements on leaf discs, blue-light-induced depolarizations of the plasma membrane could reproducibly be evoked, which followed the given light pattern in duration and frequency. By Patch-Clamp recordings on N. benthamiana protoplasts, clear blue-light-induced inward currents were demonstrated. The expression of both employed channelrhodopsin variants C128A and C128T was almost independent from supplementation of Retinal during their expression. Furthermore, expression and function of the light activated adenylyl cyclase bPAC::YFP (Stierl et al., 2011) and a therefrom derived light activated guanylyl cyclase bPGC::YFP (according to Ryu et al., 2010) was shown for the first time in higher plants. Two stable transgenic plant lines have been generated, which, aside to the constitutively expressed calcium reporter protein Aequorin, express the light-activated nucleotide cyclases bPAC::YFP and bPGC::YFP, respectively, under the control of an estrogen-inducible glucocorticoid promotor (Zuo et al., 2000). Also in these transgenic plants, expression and function of both light-activated nucleotide cyclases was shown. ZUSAMMENFASSUNG DER ARBEIT - 192 - For the first time, blue-light-induced calcium signatures in plant cells were evoked by illumination of leafdiscs of the transgenic plant lines as an implication of an elevated cNMP-level. Beside the possibility to manipulate cNMP-levels as well as the free cytoplasmic calcium concentration in those plants by means of light, a direct interrelation between these two second messengers was shown. Also physiological impairments in the generated plant lines were observed. The germination of bPAC::YFP expressing seeds was considerably delayed when grown in light. Further, the pollen tube growth of transiently bPAC::YFP-transfected pollen of Nicotiana SR-1 was fully stopped by illumination with blue light, whereas normal growth was documented under dark conditions. In contrast, bPGC-transfected pollen did not show affected growth of their pollen tubes neither in darkness nor upon blue light illumination. Beside the generated stable transgenic plant lines, two stable transgenic Arabidopsis thaliana Col-0-Aequorin cell-culture lines have been generated in an analogous approach. Also in this case, the expression of bPGC::YFP and bPAC::YFP was estrogen-inducibly expressed under control of the glucocorticoid-promotor (Zuo et al., 2000), and expression as well as function was shown by means of fluorescence microscopy imaging and cNMP-quantification using ELISA. Furthermore, a fused construct of the cAMP-gated cation channel CNGA2 (C460W-E583M, according to Rich et al., 2001) and the light activated adenylyl-cyclase EuPACα (Iseki et al., 2002) was cloned using a 2A-sequence (Tang et al., 2009) and expressed in oocytes. The function of this construct has been shown electrophysiologically and immunologically.

In order to function properly, organisms have a complex control mechanism, in which a given gene is expressed at a particular time and place. One way to achieve this control is to regulate the initiation of transcription. This step requires the assembly of several components, i.e., a basal/general machinery common to all expressed genes, and a specific/regulatory machinery, which differs among genes and is the responsible for proper gene expression in response to environmental or developmental signals. This specific machinery is composed of transcription factors (TFs), which can be grouped into evolutionarily related gene families that possess characteristic protein domains. In this work we have exploited the presence of protein domains to create rules that serve for the identification and classification of TFs. We have modelled such rules as a bipartite graph, where families and protein domains are represented as nodes. Connections between nodes represent that a protein domain should (required rule) or should not (forbidden rule) be present in a protein to be assigned into a TF family. Following this approach we have identified putative complete sets of TFs in plant species, whose genome is completely sequenced: Cyanidioschyzon merolae (red algae), Chlamydomonas reinhardtii (green alga), Ostreococcus tauri (green alga), Physcomitrella patens (moss), Arabidopsis thaliana (thale cress), Populus trichocarpa (black cottonwood) and Oryza sativa (rice). The identification of the complete sets of TFs in the above-mentioned species, as well as additional information and reference literature are available at http://plntfdb.bio.uni-potsdam.de/. The availability of such sets allowed us performing detailed evolutionary studies at different levels, from a single family to all TF families in different organisms in a comparative genomics context. Notably, we uncovered preferential expansions in different lineages, paving the way to discover the specific biological roles of these proteins under different conditions. For the basic leucine zipper (bZIP) family of TFs we were able to infer that in the most recent common ancestor (MRCA) of all green plants there were at least four bZIP genes functionally involved in oxidative stress and unfolded protein responses that are bZIP-mediated processes in all eukaryotes, but also in light-dependent regulations. The four founder genes amplified and diverged significantly, generating traits that benefited the colonization of new environments. Currently, following the approach described above, up to 57 TF and 11 TR families can be identified, which are among the most numerous transcription regulatory families in plants. Three families of putative TFs predate the split between rhodophyta (red algae) and chlorophyta (green algae), i.e., G2-like, PLATZ, and RWPRK, and may have been of particular importance for the evolution of eukaryotic photosynthetic organisms. Nine additional families, i.e., ABI3/VP1, AP2-EREBP, ARR-B, C2C2-CO-like, C2C2-Dof, PBF-2-like/Whirly, Pseudo ARR-B, SBP, and WRKY, predate the split between green algae and streptophytes. The identification of putative complete list of TFs has also allowed the delineation of lineage-specific regulatory families. The families SBP, bHLH, SNF2, MADS, WRKY, HMG, AP2-EREBP and FHA significantly differ in size between algae and land plants. The SBP family of TFs is significantly larger in C. reinhardtii, compared to land plants, and appears to have been lost in the prasinophyte O. tauri. The families bHLH, SNF2, MADS, WRKY, HMG, AP2-EREBP and FHA preferentially expanded with the colonisation of land, and might have played an important role in this great moment in evolution. Later, after the split of bryophytes and tracheophytes, the families MADS, AP2-EREBP, NAC, AUX/IAA, PHD and HRT have significantly larger numbers in the lineage leading to seed plants. We identified 23 families that are restricted to land plants and that might have played an important role in the colonization of this new habitat. Based on the list of TFs in different species we have started to develop high-throughput experimental platforms (in rice and C. reinhardtii) to monitor gene expression changes of TF genes under different genetic, developmental or environmental conditions. In this work we present the monitoring of Arabidopsis thaliana TFs during the onset of senescence, a process that leads to cell and tissue disintegration in order to redistribute nutrients (e.g. nitrogen) from leaves to reproductive organs. We show that the expression of 185 TF genes changes when leaves develop from half to fully expanded leaves and finally enter partial senescence. 76% of these TFs are down-regulated during senescence, the remaining are up-regulated. The identification of TFs in plants in a comparative genomics setup has proven fruitful for the understanding of evolutionary processes and contributes to the elucidation of complex developmental programs. / Organismen weisen einen komplexen Steuerungsmechanismus auf, bei dem die Aktivität eines Gens räumlich und zeitlich reguliert wird. Eine Möglichkeit der Kontrolle der Genaktivität ist Regulation der Initiation der Transkription. Eine Voraussetzung für die Transkriptionsinitiation ist die Zusammenlagerung verschiedener Komponenten: eine allgemeine Maschinerie, die für alle exprimierten Gene gleich ist und eine spezifische Maschinerie, die sich von Gen zu Gen unterscheidet und die für die korrekte Genexpression in Abhängigkeit der Entwicklung und von Umweltsignalen verantwortlich ist. Diese spezifische Maschinerie besteht aus Transkriptionsfaktoren (TFs), welche in evolutionär verwandte Genefamilien eingeteilt werden können, die charakteristische Proteindomänen aufweisen. In dieser Arbeit habe ich die Proteindomänen genutzt, um Regeln aufzustellen, die die Identifizierung und Klassifizierung von TFs erlauben. Solche Regeln wurden als Graphen modelliert, in denen die Familien und Proteindomänen als Knoten repräsentiert wurden. Verbindungen zwischen den Knoten bedeuten, dass eine Proteindomäne in einem Protein entweder vorhanden sein sollte oder nicht vorhanden sein darf, damit das Protein einer TF-Familie zugeordnet wird. Mit Hilfe dieses Ansatzes wurden vermutlich vollständige Datensätze von TFs in Pflanzenspezies generiert, deren Genom komplett sequenziert wurde: C. merolae, C. reinhardtii, O. tauri, P. patens, A. thaliana, P. trichocarpa and O. sativa. Diese kompletten TF-Sätze sowie weitergehende Informationen und Literaturhinweise wurden unter der Internetadresse http://plntfdb.bio.uni-potsdam.de/ öffentlich zugänglich gemacht. Die Datensätze erlaubten es, detailliertere evolutionäre Studien mit unterschiedlichen Schwerpunkten durchzuführen. Diese reichten von der Analyse einzelner Familien bis hin zum genomweiten Vergleich aller TF-Familien in verschiedenen Organismen. Als Resultat besonders erwähnenswert ist, dass bevorzugt einige bestimmte TF-Familien in verschiedenen Spezies expandierten. Diese Studien ebnen den Weg, um die spezifische biologische Rolle dieser Proteine unter verschiedenen Bedingungen zu ergründen. Für die wichtige TF-Familie bZIP konnte gezeigt werden, dass der letzte gemeinsame Vorfahr aller Grünpflanzen mindestens vier bZIP Gene hatte, die funktionell in die Antwort auf oxidativen Stress eingebunden waren. Aus den vier Gründergene entstand durch Genverdopplung und –differenzierung eine große Familie, die Eigenschaften hervorbrachte, die die Besiedelung neuer Lebensräume ermöglichten. Mit Hilfe des oben beschriebenen Ansatzes können derzeit aus der Vielzahl der Transkriptionsregulatorfamilien in Pflanzen bis zu 57 TF und 11 TR Familien identifiziert werden. Drei Familien mutmaßlicher TFs markieren die Trennung zwischen Rhodophyta (Rotalgen) und Chlorophyta (Grünalgen): G2-like, PLATZ und RWPRK. Diese könnten eine besondere Rolle bei der Evolution eukaryotischer photosynthetisch aktiver Organismen gespielt haben. Neun zusätzliche Familien (ABI3/VP1, AP2-EREBP, ARR-B, C2C2-CO-like, C2C2-Dof, PBF-2-like/Whirly, Pseudo ARR-B, SBP und WRKY) kennzeichnen die Trennung zwischen Grünalgen und Streptophyten. Die Identifizierung putativer kompletter Listen an TFs erlaubte auch die Identifizierung abtammungsspezifischer regulatorischer Familien. Die Familien SBP, bHLH, SNF2, MADS, WRKY, HMG, AP2-EREBP und FHA unterscheiden sich signifikant in ihrer Größe zwischen Algen und Landpflanzen. Die SBP Familie ist in C. reinhardtii signifikant größer als in Landpflanzen. In der Parasinophyte O. tauri scheint diese Familie verloren gegangen zu sein. Die Familien bHLH, SNF2, MADS, WRKY, HMG, AP2-EREBP und FHA expandierten präferenziell mit der Kolonialisation an Land. Sie könnten eine wichte Rolle während dieses einschneidenden Ereignisses der Evolution gespielt haben. Später, nach der Trennung von Bryophyten und Tracheophyten sind die Familien MADS, AP2-EREBP, NAC, AUX/IAA, PHD und HRT stärker in den Linien, die zu Samenpflanzen führten, gewachsen. 23 TF-Familien wurden identifiziert, die es nur in Landpflanzen gibt. Sie könnten eine besondere Rolle bei der Besiedelung des neuen Lebensraum gespielt haben. Aufbauend auf die Transkriptionsfaktordatensätze, die in dieser Arbeit erstellt wurden, wurde mittlerweile damit begonnen, experimentelle Hochdurchsatz-Plattformen zu entwickeln (für Reis und für C. reinhardtii), um Änderungen in der Genaktivität der TF-Gene unter verschiedenen genetischen, Entwicklungs- oder Umweltbedingungen zu untersuchen. In dieser Arbeit wird die Analyse von TFs aus A. thaliana im Verlauf der Seneszenz vorgestellt. Seneszenz ist ein Prozess, der zur Zell- und Gewebeauflösung führt, um Nährstoffe aus den Blättern für den Transport in reproduktive Organe freizusetzen. Es wird gezeigt, dass sich die Expression von 187 TF Gene verändert, wenn sich die Blätter voll entfalten und schließlich teilweise in den Prozess der Seneszenz eintreten. 76% der TFs waren runterreguliert, die übrigen waren hochreguliert.

Leaves are the main photosynthetic organs of vascular plants, and leaf development is dependent on a proper control of gene expression. Transcription factors (TFs) are global regulators of gene expression that play essential roles in almost all biological processes among eukaryotes. This PhD project focused on the characterization of the sink-to-source transition of Arabidopsis leaves and on the analysis of TFs that play a role in early leaf development. The sink-to-source transition occurs when the young emerging leaves (net carbon importers) acquire a positive photosynthetic balance and start exporting photoassimilates. We have established molecular and physiological markers (i.e., CAB1 and CAB2 expression levels, AtSUC2 and AtCHoR expression patterns, chlorophyll and starch levels, and photosynthetic electron transport rates) to identify the starting point of the transition, especially because the sink-to-source is not accompanied by a visual phenotype in contrast to other developmental transitions, such as the mature-to-senescent transition of leaves. The sink-to-source transition can be divided into two different processes: one light dependent, related to photosynthesis and light responses; and one light independent or impaired, related to the changes in the vascular tissue that occur when leaves change from an import to an export mode. Furthermore, starch, but not sucrose, has been identified as one of the potential signalling molecules for this transition. The expression level of 1880 TFs during early leaf development was assessed by qRTPCR, and 153 TFs were found to exhibit differential expression levels of at least 5-fold. GRF, MYB and SRS are TF families, which are overrepresented among the differentially expressed TFs. Additionally, processes like cell identity acquisition, formation of the epidermis and leaf development are overrepresented among the differentially expressed TFs, which helps to validate the results obtained. Two of these TFs were further characterized. bZIP21 is a gene up-regulated during the sink-to-source and mature-to-senescent transitions. Its expression pattern in leaves overlaps with the one observed for AtCHoR, therefore it constitutes a good marker for the sink-to-source transition. Homozygous null mutants of bZIP21 could not be obtained, indicating that the total absence of bZIP21 function may be lethal to the plant. Phylogenetic analyses indicate that bZIP21 is an orthologue of Liguleless2 from maize. In these analyses, we identified that the whole set of bZIPs in plants originated from four founder genes, and that all bZIPs from angiosperms can be classified into 13 groups of homologues and 34 Possible Groups of Orthologues (PoGOs). bHLH64 is a gene highly expressed in early sink leaves, its expression is downregulated during the mature-to-senescent transition. Null mutants of bHLH64 are characterized by delayed bolting when compared to the wild-type; this indicates a possible delay in the sink-to-source transition or the retention of a juvenile identity. A third TF, Dof4, was also characterized. Dof4 is neither differentially expressed during the sink-to-source nor during the senescent-to-mature transition, but a null mutant of Dof4 develops bigger leaves than the wild-type and forms a greater number of siliques. The Dof4 null mutant has proven to be a good background for biomass accumulation analysis. Though not overrepresented during the sink-to-source transition, NAC transcription factors seem to contribute significantly to the mature-to-senescent transition. Twenty two NACs from Arabidopsis and 44 from rice are differentially expressed during late stages of leaf development. Phylogenetic analyses revealed that most of these NACs cluster into three big groups of homologues, indicating functional conservation between eudicots and monocots. To prove functional conservation of orthologues, the expression of ten NAC genes of barley was analysed. Eight of the ten NAC genes were found to be differentially expressed during senescence. The use of evolutionary approaches combined with functional studies is thus expected to support the transfer of current knowledge of gene control gained in model species to crops. / Das Blatt ist das wichtigste photosynthetische Organ von Gefäßpflanzen und die Blattentwicklung ist von einer exakten Genexpression abhängig. Transkriptionsfaktoren (TFs) sind globale Regulatoren der Genexpression. Diese sind, in fast allen biologischen Vorgängen der Eukaryoten, von grundlegender Bedeutung. Das Promotionsarbeit legte den Schwerpunkt auf den sogenannten Sink-source-Übergang in Blättern der Modellpflanze Arabidopsis thaliana, zu deutsch Ackerschmalwand. Ein besonderer Fokus lag dabei auf der Analyse von TFs, welche eine wichtige Rolle in der frühen Blattentwicklung spielen. Sehr junge Blätter befinden sich im sogenannten Sink-Status, sie müssen Photoassimilate aus älteren, sogenannten Source-Blättern importieren, da sie selbst noch nicht in der Lage sind, hinreichend viel Kohlendioxid über die Photosynthese zu binden. Der Übergang vom Sink- in den Source-Zustand eines Blattes ist ein hoch komplizierter biologischer Prozess, der bisher nur in Ansätzen verstanden ist. Im Rahmen der Doktorarbeit wurden molekulare und physiologische Marker identifiziert, die es erlauben, den für das bloße Auge nicht ohne weiteres sichtbaren Sink-Source-Übergang zu erkennen. Dazu wurde beispielsweise die Aktivität bestimmter Gene, unter anderem der Gene AtSUC2 und AtCHoR, mittels molekularer Techniken verfolgt. Um den Über zwischen den beiden Entwicklungszuständen eingehend zu charakterisieren wurde die Aktivität von etwa 1900 Regulatorgenen mittels eines multiparallelen Verfahrens - der sogenannten quantitativen RT-PCR - untersucht. Bei den Regulatoren handelt es sich um Transkriptionsfaktoren, die die Aktivität anderer Gene der Pflanzen steuern. Von allen untersuchten Genen zeigten 153 ein vom Blattstadium abhängiges Aktivitätsmuster. Dabei waren Mitglieder der GRF, MYB und SRS Familien überrepräsentiert. Für die gefundenen Transkriptionsfaktoren zeigte sich besonders häufig eine Assoziation zu Prozessen wie Spezialisierung von Zellen, Entwicklung der Epidermis sowie der Blattentwicklung. Zwei ausgewählte Regulatorproteine - bZIP21 und bHLH64 - wurden detaillierter charakterisiert. Das bZIP21-Gen zeigte eine starke Aktivität whrend des Sink-Source-Übergangs. Sein Expressionsmuster in Blättern deckt sich mit dem für AtCHoR beobachteten Expressionsmuster, so dass bZIP21 als ein neuer Marker für die Sink-Source- Transition dienen kann. Es konnten keine homozygoten Null-Mutanten des Gens erhalten werden, was die Vermutung nahelegt, dass gänzliche Abwesenheit von bZIP21 letal fr die Pflanze sein kann. Phylogenetische Analysen ergaben, dass bZIP21 ortholog zum Gen Liguleless2 aus Mais ist. In diesen Analysen konnte gezeigt werden, dass alle pflanzlichen bZIP Transkriptionsfaktoren von vier Gründergenen abstammen und alle bZIPs der Angiospermen in 13 homologe Klassen und 34 mögliche orthologe Klassen (Possible Groups of Orthologues, PoGOs) eingeordnet werden können. Das bHLH64 Gen ist im unreifen Blatt stark aktiv und während des Alterungsprozesses herunterreguliert. Null-Mutationen von bHLH64 zeigen eine verzögerte Blütenbildung im Vergleich zum Wildtyp; dies weist auf eine mögliche Verzögerung in des Sink-SourceÜbergangs oder Aufrechterhaltung der jugendlichen Identität hin. Ein dritter Transkriptionsfaktor, Dof4, wurde ebenfalls charakterisiert. Dof4 wird weder während des Sink-Source-Übergangs noch während des Alterungsprozesses unterschiedlich exprimiert. Eine Null-Mutante von Dof4 besaß größere Blätter und eine höhere Anzahl an Schoten in Vergleich zum Wildtyp. Diese Mutanten erwiesen sich als gut geeignet fr die Analyse der Akkumulation pflanzlicher Biomasse. Obwohl während der Sink-Source Transition nicht überrepräsentiert, scheinen NAC Transkriptionsfaktoren eine große Rolle während des Alterungsprozesses zu spielen. Zweiundzwanzig NAC-Gene von Arabidopsis und 44 von Reis sind in der späten Phase der Blattentwicklung verändert exprimiert. Phylogenetische Analysen erlaubten die Einordnung der meisten dieser NACs in vier homologe Gruppen, was auf einen funktionellen Erhalt zwischen einkeimblättrigen und zweikeimblättrigen Pflanzen hinweist. Um den funktionellen Erhalt von Orthologen zu untersuchen, wurde die Expression von zehn NAC-Genen aus Gerste analysiert. Acht dieser Gene zeigten eine von der Blattalterung abhängige Expression. Die Kombination von evolutionären Analysen und funktionellen Studien könnte den Wissenstransfer von Modellpflanzen auf Getreidepflanzen in Zukunft vereinfachen.

The transcriptional regulation of the cellular mechanisms involves many different components and different levels of control which together contribute to fine tune the response of cells to different environmental stimuli. In some responses, diverse signaling pathways can be controlled simultaneously. One of the most important cellular processes that seem to possess multiple levels of regulation is photosynthesis. A model organism for studying photosynthesis-related processes is the unicellular green algae Chlamydomonas reinhardtii, due to advantages related to culturing, genetic manipulation and availability of genome sequence. In the present study, we were interested in understanding the regulatory mechanisms underlying photosynthesis-related processes. To achieve this goal different molecular approaches were followed. In order to indentify protein transcriptional regulators we optimized a method for isolation of nuclei and performed nuclear proteome analysis using shotgun proteomics. This analysis permitted us to improve the genome annotation previously published and to discover conserved and enriched protein motifs among the nuclear proteins. In another approach, a quantitative RT-PCR platform was established for the analysis of gene expression of predicted transcription factor (TF) and other transcriptional regulator (TR) coding genes by transcript profiling. The gene expression profiles for more than one hundred genes were monitored in time series experiments under conditions of changes in light intensity (200 µE m-2 s-1 to 700 µE m-2 s-1), and changes in concentration of carbon dioxide (5% CO2 to 0.04% CO2). The results indicate that many TF and TR genes are regulated in both environmental conditions and groups of co-regulated genes were found. Our findings also suggest that some genes can be common intermediates of light and carbon responsive regulatory pathways. These approaches together gave us new insights about the regulation of photosynthesis and revealed new candidate regulatory genes, helping to decipher the gene regulatory networks in Chlamydomonas. Further experimental studies are necessary to clarify the function of the candidate regulatory genes and to elucidate how cells coordinately regulate the assimilation of carbon and light responses. / Pflanzen nutzen das Sonnenlicht um Substanzen, sogenannte Kohlenhydrate, zu synthetisieren. Diese können anschließend als Energielieferant für das eigene Wachstum genutzt werden. Der aufbauende Prozess wird als Photosynthese bezeichnet. Ein wichtiges Anliegen ist deshalb zu verstehen, wie Pflanzen äußere Einflüsse wahrnehmen und die Photosynthese dementsprechend regulieren. Ihre Zellen tragen diese Informationen in den Genen. Die Pflanzen nutzen aber in der Regel nicht alle ihre Gene gleichzeitig, die sie zur Anpassung an Umwelteinflüsse besitzen. Zu meist wird nur eine Teilfraktion der gesamten Information benötigt. Wir wollten der Frage nachgehen, welche Gene die Zellen für welche Situation regulieren. Im Zellkern gibt es Proteine, sogenannte Transkriptionsfaktoren, die spezifische Gene finden können und deren Transkription modulieren. Wenn ein Gen gebraucht wird, wird seine Information in andere Moleküle übersetzt (transkribiert), sogenannte Transkripte. Die Information dieser Transkripte wird benutzt um Proteine, Makromoleküle aus Aminsäuren, zu synthetisieren. Aus der Transkription eines Gens kann eine große Zahl des Transkripts entstehen. Es ist wahrscheinlich, dass ein Gen, dass gerade gebraucht wird, mehr Transkriptmoleküle hat als andere Gene. Da die Transkriptionsfaktoren mit der Transkription der Gene interferieren können, entwickelten wir in der vorliegenden Arbeit Strategien zur Identifikation dieser im Zellkern zu findenden Proteine mittels eines „Proteomics“-Ansatzes. Wir entwickelten weiterhin eine Strategie zur Identififikation von Transkripten Transkriptionsfaktor-codierender Gene in der Zelle und in welche Menge sie vorkommen. Dieser Ansatz wird als „Transcript-Profiling“ bezeichnet. Wir fanden Zellkern-lokalisierte Proteine, die als Signalmoleküle funktionieren könnten und Transkripte, die bei unterschiedlichen Umweltbedingungen in der Zelle vorhanden waren. Wir benutzten, die oben genannten Ansätze um die einzellige Grünalge Chlamydomonas zu untersuchen. Die Informationen, die wir erhielten, halfen zu verstehen welche Transkriptionsfaktoren notwendig sind, damit Chlamydomonas bei unterschiedlichen Umweltbedingungen, wie z.B. unterschiedliche Lichtintensitäten und unterschiedlicher Konzentration von Kohlenstoffdioxid, überlebt.

Thesis (doctoral)--Swedish University of Agricultural Sciences, 2000. / Thesis based on 5 papers, which are included in the volume. Includes bibliographical references.

Untersuchungen zur Arsenbelastung von Grünland in Abhängigkeit der Arsenkonzentration in Böden. Darstellung der Einflussfaktoren und Handlungsempfehlungen zur Arsenreduzierung.

Auxin ist eines der wichtigsten Phytohormone für das pflanzliche Wachstum und die Entwicklung und ein entscheidender Regulator des Gravitropismus. Für alle auxinvermittelten Prozesse ist die spezifische Verteilung des Hormons innerhalb der Gewebe relevant. Diese wird durch spezialisierte Auxintransporter umgesetzt, von denen besonders die PIN-Auxinexporter entscheidend sind. PINs lokalisieren in einer Zelle in den meisten Fällen polar an einer Seite der Plasmamembran um einen strikten Auxinfluss in das Zielgewebe zu erzeugen. Diese PIN-Verteilung muss dynamisch sein, damit der Auxinfluss zum Beispiel im Falle gravitroper Stimulation zügig in ein anderes Gewebe umgeleitet werden kann. Die schnelle Umverteilung der PINs hängt unter anderem von der Zusammensetzung und Funktionalität der Plasmamembran ab. In früheren Arbeiten konnte gezeigt werden, dass PIs eine wichtige Funktion bei der Vesikelbildung und der Rekrutierung der dafür nötigen Proteinmaschinerie einnehmen. In dieser Arbeit wurde getestet, ob PIs eine Rolle bei der PIN-Verteilung spielen. Pflanzen mit Störungen im PI-Syntheseweg wurden auf ihre gravitropen Krümmungseigenschaften und ihre PIN- und Auxinverteilung untersucht. Eine pip5k1 pip5k2-Doppelmutante zeigte neben verminderter gravitroper Krümmung auch eine gestörte PIN-Lokalisation als Defekt bei der Auxinverteilung, da sich Auxin mittels eines DR5::GUS-Reporters in der Wurzelspitze der Mutanten nicht nachweisen ließ. Diese Experimente lieferten daher wichtige Hinweise darauf, dass PtdIns(4,5)P2 eine Rolle bei der Lokalisierung und Umverteilung und damit der Regulierung des Auxinflusses spielen. PtdIns(4,5)P2 ist nicht nur als intaktes Lipid für viele Signalwege in der Pflanze relevant. Auch die abgeleiteten IPPs spielen eine wichtige Rolle. In der Kristallstruktur des Auxinrezeptors TIR1 wurde ein InsP6-Kofaktor beschrieben, dessen Funktion aber bisher unklar blieb. Im Rahmen dieser Arbeit wurden ipk1-1-Mutanten und InsP 5-Ptase-Pflanzen mit verminderten Gehalten an InsP6 auf Auxin-vermittelte Prozesse wie gravitrope Krümmung und die Verteilung von Auxin und dessen Transporter untersucht. Weiterhin wurde die Transkription auxinabhängiger Gene getestet. Dazu wurden diese Pflanzenlinien gravitrop stimuliert und die Transkriptgehalte in der Wurzelspitze nach dieser Stimulation mittels einer Transkript-Arrayanalyse mit Pflanzen des Wildtyps verglichen. Die Ergebnisse zeigten, dass die gravitrope Stimulation in Wildtyppflanzen eine deutliche Veränderung der Genexpression hervorruft, die sich in ipk1-1-Mutanten und die InsP 5-Ptase-Pflanzen nicht beobachten ließ. Verifizierungen ausgewählter Gene mittels qPCR bestätigten die Befunde. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass sowohl PIs, als auch abgeleitete IPPs, im besonderen InsP6, eine Rolle bei auxinvermittelten Prozessen spielen.

Introduction Since its development by Al Wolf and colleagues in the 1970s1, [11C]cyanide has been a useful synthon for a wide variety of reactions, most notably those producing [1-11C]-labeled amino acids2. However, despite its position as rote gas-phase product, the catalytic synthesis is difficult to optimize and often only perfunctorily dis-cussed in the radiochemical literature. Recently, [11C]CN– has been used in the synthesis of indole-3-[1-11C]acetic acid ([11C]IAA), the principal phytohormone responsible for a wide variety of growth and development functions in plants3. The University of Wisconsin has expertise in cyclotron production and radiochemistry of 11C and previous experience in the PET imaging of plants4,5. In this abstract, we present work on optimizing [11C]CN– production for the synthesis of [11C]IAA and the PET imaging of auxin transport in living plants. Material and Methods [11C]CH4 was produced by irradiating 270 psi of 90% N2, 10% H2 with 30 µA of 16.1 MeV protons from a GE PETtrace cyclotron. After irradiation, the [11C]CH4 was converted to [11C]CN– by passing through a quartz tube containing 3.0 g of Pt wire and powder between quartz wool frits inside a 800–1000 ˚C Carbolite tube furnace. The constituents and flow rate of the [11C]CH4 carrier gas were varied in an effort to optimize the oven\'s catalytic production of [11C]CN– from CH4 and NH3. The following conditions were investigated: i. Directly flowing irradiated target gas versus trapping, purging and releasing [11C]CH4 from a −178 ˚C HayeSep D column in He through the Pt furnace. ii. Varying the amount of anhydrous NH3 (99.995%) mixed with the [11C]CH4 carrier gas prior to the Pt furnace. Amounts varied from zero to 35 % of gas flow. iii. Varying the purity of the added NH3 gas with the addition of a hydride gas purifier (Entegris model 35KF), reducing O2 and H2O impurities to < 12 ppb. iv. Varying the flow rate of He gas carrying trapped, purged and released [11C]CH4. After flowing through the Pt furnace, the gas stream was bubbled through 300 µL of DMSO containing IAA precursor gramine (1 mg), then passed through a 60×5 cm column containing ascarite to absorb [11C]CO2, followed by a −178˚C Porapak Q column to trap [11C]CH4 and [11C]CO. After bubbling, the DMSO/gramine vial was heated to 140 ˚C to react the gramine with [11C]CN–, forming the intermediate indole-3-[1-11C]acetonitrile ([11C]IAN), which was subsequently purified by solid phase extraction (SPE). The reaction mixture was diluted into 20 mL water and loaded onto a Waters Sep-Pak light C18 cartridge, followed by rinsing with 5 mL of 0.1% HCl : acetonitrile (99 : 1) and 10 mL of the same mixture in ratio 95 : 5, and finally eluted with 0.5 mL of diethyl ether. The ether was subsequently evaporated under argon flow, followed by the hydrolysis of [11C]IAN to [11C]IAA with the addition of 300 µL 1 M NaOH and heating to 140 ˚C for 5 minutes. After hydrolysis, the solution was neutralized with 300 µL 1 M HCl and purified using preparative high-performance liquid chromatography (HPLC) using a Phenomenex Luna C18 (10μ, 250×10mm) column with a mobile phase acetonitrile : 0.1% formic acid in H2O (35 : 65) at flow rate of 3 mL/min. The [11C]IAA peak, eluting at 12 minutes, was collected and rotary evaporated to dryness, then again after the addition of 5 mL acetonitrile, followed by its reconstitution in 50 µL of water. Analytical HPLC was performed on the [11C]IAA before and after this evaporation procedure using a Phenomenex Kinetex C18 (2.6μ, 75× 4.6 mm) column with a linear gradient elution over 20 minutes of 10 : 90–30 : 70 (acetonitrile : 0.1% formic acid) at a 1 mL/min flow rate, eluting at 7.6 minutes. The transport of [11C]IAA was monitored following administration through the severed petiole of rapid cycling Brassica oleracea (rcBo) using a Siemens microPET P4 scanner. Transport was compared following administration to the first true leaf versus the final fully formed leaf in plants with and without exposure to the polar auxin transport inhibitor naphthylphthalamic acid (NPA). Results and Conclusion Optimization of the [11C]CN– gas phase chemistry was performed using two key metrics for measuring conversion yield. First is the fraction of total produced radioactivity that trapped in the DMSO/gramine solution (denoted %DMSO), and second, the fraction of DMSO/gramine-trapped activity that was able to react with gramine to form [11C]IAN (denoted %CN–). Under certain conditions, the former of these metrics experienced significant losses due to unconverted [11C]CH4 or through combustion, forming [11C]CO2 or [11C]CO. The latter metric experienced losses due to production of incomplete oxidation products of the CH4-NH3 reaction, such as methylamine. Total [11C]CH4 to [11C]CN– con-version yields is reported by the product of the two metrics. It was initially hypothesized that the irradiation of a 90% N2, 10% H2 target gas would produce sufficient in-target-hot-atom-produced NH3 to convert [11C]CH4 to [11C]CN– in the Pt furnace. However, conversion yields were found to be low and highly variable, with 13 ± 8 % trapping in DMSO/gramine, 9 ± 9 % of which reacted as CN– (n = 15). While in disagreement with previous reports1, this is likely as a result the batch irradiation conditions resulting ammonia losses in the target chamber and along the tubing walls. Yields and reproducibility were improved when combining the target gas with a stream of anhydrous NH3 gas flow with conversion yields reported in TABLE 1. However, these yields remained undesirably low, potentially as a result of the 10% H2 carrier gas having an adverse effect on the oxidative conversion of [11C]CH4 to [11C]CN–. To remedy this, the irradiated target gas was trapped, purged, released in He and combined with NH3 gas before flowing through the Pt furnace. Initial experiments using 99.995% anhydrous NH3 gas resulted in very poor (< 0.1%) [11C]CN– yields as a result of nearly quantitative combustion forming [11C]CO2. Installation of a hydride gas purifier to reduce O2 and H2O impurities in NH3 improved yields for CH4 in He, but did not significantly affect those from [11C]CH4 in N2/H2 target gas. In disagreement with previous reports2, conversion yields were found to be highly sensitive to overall carrier gas flow rate, with lower flow rates giving the best yields, as shown in TABLE 1. Optimization experiments are continuing. The total decay-corrected yield for the 1 hour synthesis of [11C]IAA in 50 µL of water is 2.3 ± 0.7 %, based on the total produced [11C]CH4 with a specific activity ranging from 1–100 GBq/µmol. The principal radiochemical impurity was determined to be indole-3-carboxylic acid. The SPE procedure isolating the [11C]IAN intermediate product was optimized to minimize this impurity in the final sample. After a rapid distribution of the administered [11C]IAA through the cut petiole and throughout the rcBO plant, upward vascular transport of auxin and downward polar auxin transport was visualized through time-activity curves (TACs) of regions of interest along the shoot. Comparison of these TACS with and without exposure to NPA yields insight into the fundamental physiological process of polar auxin transport in plants. In conclusion, the Pt-catalyzed oxidative conversion of [11C]CH4 and NH3 to [11C]CN– is a challenging process to optimize and highly sensitive to carrier gas composition and flow rate. Optimization for our experimental conditions yielded several results which disagreed with previous reports. [11C]IAA produced using [11C]CN– is well suited for PET imaging of polar auxin transport in living plants.