Plantas do gênero Hypericum são bem conhecidas por sua utilização na medicina tradicional, sendo Hypericum perforatum a espécie mais estudada. No Sul do Brasil, esse gênero é representado por cerca de 20 espécies, entre elas, destaca-se H. polyanthemum, o qual apresenta em extrato lipofílico a presença de uliginosina B, um derivado de floroglucinol, e três benzopiranos: HP1, HP2 e HP3. Partes aéreas de H. polyanthemum foram submetidas à extração com fluido supercrítico (SFE), sendo realizadas extrações sucessivas com dióxido de carbono nas pressões de 90, 120, 150 e 200 bar, em diferentes temperaturas (40, 50 e 60 °C). Posteriormente, as frações obtidas foram comparadas com extrato n-hexano obtido por técnica convencional (ultra-som). SFE apresentou maior seletividade que a extração com nhexano, sendo a 50 °C a melhor condição para extrair os metabólitos bioativos. Para extração do composto com maior peso molecular, uliginosina B, pressões mais elevadas foram necessárias. Além disso, avaliou-se a atividade anti- Trichomonas vaginalis do extrato obtido por SFE a 50 °C/150 bar e dos compostos isolados. Os resultados indicam que todas as amostras testadas possuem atividade anti-T. vaginalis, porém, HP1 demonstrou melhor seletividade frente ao protozoário (isolado metronidazol-resistente e -suscetível), sem apresentar citotoxicidade contra células de mamíferos. Ainda, o HP1 apresentou satisfatória atividade contra isolado metronidazol-resistente (52% de trofozoítos viáveis), apresentando efeito sinérgico quando testado com baixa concentração de metronidazol (23% de trofozoítos viáveis). Todos os compostos isolados provocaram danos na membrana do parasito (liberação de LDH > 90%) e nenhuma das amostras apresentou efeito hemolítico importante, sendo que HP2 e uliginosina B apresentaram citotoxicidade frente a células de mamíferos. Portanto, benzopiranos e derivados de floroglucinol são moléculas promissoras como protótipos para novos fármacos tricomonicida, principalmente HP1, visto que corrobora com a ação do metronidazol em isolados de T. vaginalis resistentes. No entanto, mais estudos são necessários a fim de melhorar a atividade antiprotozoária das moléculas testadas, sem que as mesmas apresentem toxicidade para células de mamíferos. / Plants of the genus Hypericum are well known for their use in traditional medicine, being H. perforatum the most important species. In South Brazil, this genus is represented by approximately 20 species and among them, H. polyanthemum showed in the lipophilic extract the presence of uliginosin B, a phloroglucinol derivative, and three benzopyrans: HP1, HP2 and HP3. Aerial parts of H. polyanthemum were submitted a supercritical fluid extraction (SFE), being successively extracted with supercritical carbon dioxide under pressures of 90, 120, 150 and 200 bar at different temperatures (40, 50 and 60 ºC), and compared with the n-hexane extract obtained by ultrasound-assisted extraction. SFE presented higher selectivity than the n-hexane extration. The best condition to extract the target metabolites has been determined to be at 50 °C, being that for the high molecularweight compound, uliginosin B, higher pressures was required. Moreover, the anti- Trichomonas vaginalis activity of the extract obtained by SFE at 50 °C/150 bar and the isolated compounds was evaluated. The results showed that all samples have anti-T. vaginalis activity; however, HP1 demonstrated the best selectivity against this protozoa (metronidazole-resistant and -susceptible isolates), with no cytotoxicity against mammalian cells. In addition, HP1 has good activity against metronidazoleresistant isolate (52% of viable trophozoites), presenting synergic effect when tested with low concentration of metronidazole (23% of viable trophozoites). All isolated compounds caused damage in the parasites membrane, revealed by more than 90% of LDH release. None of the samples presented important hemolytic effect, and HP2 and uliginosin B presented cytotoxicity against mammalian cells. Therefore, benzopyrans and phloroglucinol derivative are promising molecules as prototypes for new antiprotozoal drugs, especially HP1, which improve metronidazole action against a resistant T. vaginalis isolate. Nevertheless, more studies are necessary in order to enhance their in vitro antiprotozoal activity without toxicity for mammalian cells.

O gênero Hypericum (Guttiferae = Clusiaceae) compreende 494 espécies acomodadas em 36 seções taxonômicas. Os representantes americanos pertencem, sobretudo, às seções Brathys e Trigynobrathys, as duas maiores com 87 e 52 espécies, respectivamente. Popularmente, estas plantas são utilizadas como antissépticos, diuréticos, digestivos e agentes de cicatrização. Quimicamente, apresentam tendência em acumular floroglucinóis diméricos, além de benzofenonas, benzopiranos, flavonoides e ácidos fenólicos, metabólitos cuja atividade antidepressiva, antinociceptiva, antimicrobiana, antiproliferativa e antioxidante são descritas. Considerando o potencial terapêutico, este trabalho objetivou a determinação dos principais compostos fenólicos presente nas flores de espécies Hypericum nativas do Sul do Brasil (H. campestre, H. caprifoliatum, H. carinatum, H. connatum, H. linoides, H. myrianthum, H. polyanthemum e H. salvadorense) e dos Páramos peruanos (H. andinum e H. laricifolium); a extração e análise dos compostos fenólicos de H. carinatum obtidos com CO2 supercrítico e a investigação da atividade antifúngica e antiquimiotática dos extratos lipofílicos de H. caprifoliatum, H. carinatum, H. linoides, H. myrianthum e H. polyanthemum. Para os experimentos, foram coletadas (2008 - 2010) as partes aéreas das plantas em floração. Todas as coletas foram autorizadas pelos órgãos de proteção ambiental. Os métodos extrativos incluem maceração estática, ultrassom e CO2 supercrítico (temperatura = 40, 50 ou 60ºC; pressão = 90, 120, 150 ou 200 bar). As análises por CLAE foram realizadas em coluna de fase reversa (C18), sistemas isocráticos compostos por acetonitrila, água e ácido trifluroacético e detecção ultravioleta (220, 270 ou 254 nm); Os picos foram identificados pela comparação dos tempos de retenção/co-injeção com padrões e quantificados pela curva de calibração dos compostos. Os ensaios antifúngico e antiquimiotático foram realizados pelo método de microdiluição em caldo e inibição da migração de neutrófilos, respectivamente. O floroglucinol dimérico uliginosina B (0,008 – 0,188%) e o flavonoide hiperosídeo (0,057 – 5,987%) foram os principais metabólitos detectados nas flores das espécies investigadas. Hypericum caprifoliatum e H. andinum apresentaram o maior rendimento destes compostos, respectivamente. Sete espécies apresentaram japonicina A em concentrações de 0,003 a 0,087% (H. myrianthum). O rendimento de hiperbrasilol B variou de 0,006% em H. laricifolium a 0,011% em H. caprifoliatum. Os benzopiranos (HP1 = 0,200%, HP2 = 0,225% e HP3 = 0,327%) e as benzofenonas (carifenona A = 0,309% e carifenona B = 0,062%) ocorreram exclusivamente em H. polyanthemum e H. carinatum. As máximas quantidades de ácido clorogênico, isoquercitrina, quercitrina e guaijaverina foram observadas, respectivamente, em H. campestre (1,458%), H. andinum (1,161%), H. carinatum (0,231%) e H. laricifolium (0,404%). Tais resultados fornecem suporte adicional para o significado quimiotaxonômico dos derivados diméricos de floroglucinol. Temperatura (40°C = 3,04%, 50°C = 2,21% e 60°C = 1,05%) e pressão (90 bar = 0,95%, 150 bar = 0,97% e 200 bar = 1,89%) afetaram de modo distinto o rendimento do extrato supercrítico de H. carinatum. Apesar do menor rendimento em comparação ao extrato n-hexano (6,09%), a extração com CO2 supercrítico provou ser mais seletiva que a maceração. Nas condições ideais (40°C, 90 bar e 180 minutos), a máxima recuperação de uliginosina B, carifenona A e carifenona B foi, respectivamente, 162,83, 376,33 e 48,79%. O modelo matemático empregado para simular o processo de extração foi apropriadamente correlacionado aos dados experimentais. Considerando as atividades biológicas, todas as espécies investigadas apresentaram um amplo espectro de ação antifúngica, assim como reduziram a migração dos neutrófilos. Os extratos de H. carinatum, H. linoides e H. myrianthum apresentaram os mais baixos valores de concentração inibitória mínima contra Cryptococcus neoformans (CIM £ 15,6 μg/mL), Rhodotorula mucilaginosa (CIM £ 62,5 μg/mL), Candida glabrata e C. tropicalis (CIM = 1,9-250 μg/mL). Para estas plantas, o efeito antiquimiotático variou entre 60 - 100% nas concentrações de 0,31 a 10 μg/mL. Os extratos mais ativos apresentaram elevada concentração de uliginosina B, japonicina A e hiperbrasilol B. Assim, as espécies de Hypericum nativas do sul do Brasil apresentam potencial como fonte de novos antifúngicos e anti-inflamatórios. / The genus Hypericum (Guttiferae = Clusiaceae) comprises 494 species placed in 36 taxonomic sections. The representatives of Central and South America belong primarily to sections Brathys and Trigynobrathys, the two largest sections with 87 and 52 species, respectively. In traditional medicine, these plants are used as antiseptic, diuretic, digestive and as healing agents. Such species have a strong tendency to accumulate dimeric phloroglucinol, besides benzophenones, benzopyrans, flavonoids and phenolic acids, metabolites whose antidepressant, antinociceptive, antimicrobial, antiproliferative and antioxidant activities are described. In view of the therapeutic potential, this work aimed to determine the main phenolic compounds present in flowers of Hypericum species native to southern Brazil (H. campestre, H. caprifoliatum, H. carinatum, H. connatum, H. linoides, H. myrianthum, H. polyanthemum and H. salvadorense) and to Peruvian Páramos (H. andinum and H. laricifolium); the supercritical CO2 extraction and analysis of the phenolic compounds of H. carinatum; the antifungal and antichemotactic activities of the lipophilic extracts from H. caprifoliatum, H. carinatum, H. linoides, H. myrianthum and H. polyanthemum. For the experiments, aerial parts in blossom were harvested (2008 - 2010). All collections were authorized by competent agencies of environmental protection. The extraction methods employed were static maceration, ultrasonic bath or supercritical CO2 (temperature = 40, 50 or 60ºC; pressure = 90, 120, 150 or 200 bar). HPLC analyses were carried out in reverse phase column (C18), isocratic system composed of acetonitrile, water and trifluoroacetic acid, and ultraviolet detection (220, 270 or 254 nm). Peaks were identified by comparison of retention times / co-injection with standards and quantified by calibration curve of the compounds. Antifungal and antichemotactic tests were performed using the broth microdilution assay and neutrophils migration inhibition method. The dimeric phloroglucinol uliginosin B (0.008 - 0.188%) and the flavonoid hyperoside (0.057 - 5.987%) were the main metabolite detected in flowers of the investigated species. Hypericum caprifoliatum and H. andinum displayed higher yields of these compounds, respectively. Japonicin A was found in seven species studied at concentrations that varied from 0.003 to 0.087% (H. myrianthum). The yield of hyperbrasilol B ranged from 0.006% in H. laricifolium to 0.011% in H. caprifoliatum. The benzopyrans (HP1 = 0.200%, HP2 = 0.225% and HP3 = 0.327%) and benzophenones (cariphenone A = 0.309% and cariphenone B = 0.062%) occurred exclusively in H. polyanthemum and H. carinatum. Maximum amounts of chlorogenic acid, isoquercitrin, quercitrin and guaijaverin were observed, respectively, in H. campestre (1.458%), H. andinum (1.161%), H. carinatum (0.231%) and H. laricifolium (0.404%). Such results provide a further support for the chemotaxonomic significance of the dimeric phloroglucinols. Temperature (40°C = 3.04%, 50°C = 2.21% and 60°C = 1.05%) and pressure (90 bar = 0.95%, 150 bar = 0.97% and 200 bar = 1.89%) critical did affect differently the yield of supercritical extract of H. carinatum. Despite lower yield in comparison to n-hexane extract (6.09%), supercritical CO2 extraction proved to be more selective than maceration. In optimal conditions (40°C, 90 bar and 180 minutes), the maximum amount of uliginosin B, cariphenone A and cariphenone B was, respectively, 162.83, 376.33 and 48.79%. Lastly, the mathematical model used in the process of supercritical extraction was properly correlated to the experimental data. Regarding the biological activities, all investigated species exhibited a broad spectrum of antifungal action as well as reduced neutrophils migration. Hypericum carinatum, H. linoides and H. myrianthum extracts presented the lowest value of minimum inhibitory concentration against Cryptococcus neoformans (MIC ≤ 15.6 μg/mL), Rhodotorula mucilaginosa (MIC ≤ 62.5 μg/mL), Candida glabrata and C. tropicalis (MIC range = 1.9 - 250 μg/mL). For these plants, the antichemotactic effect varied from 60-100% at concentrations of 0.31 to 10 μg/mL. The most active extracts were that presented high amounts of uliginosin B, japonicin A and hyperbrasilol B. Thus, the Hypericum species native to Southern Brazil show potential as source of new anti-infectives and anti-inflammatory drugs.

Metabólitos secundários produzidos por espécies vegetais são, há tempos, reconhecidos como moléculas capazes de desempenhar ações farmacológicas. Entre as plantas medicinais mais utilizadas estão espécies do gênero Hypericum, pertencente à família Guttiferae, e que possui 494 espécies. Destas, aproximadamente 20 estão distribuídas no sul e sudeste do Brasil e apresentam o acúmulo de compostos fenólicos como flavonoides, xantonas, benzopiranos e floroglucinois. Como forma de garantia da qualidade e quantidade de plantas medicinais para consumo da indústria farmacêutica, bem como uma alternativa para preservação das espécies, o estabelecimento de protocolos de cultivo apresenta-se como uma opção vantajosa frente ao uso de plantas coletadas diretamente de seus locais de crescimento. Por este motivo, espécies nativas do sul do Brasil como H. polyanthemum, H. ternum, H. myrianthum, H. carinatum e H. campestre tiveram seus protocolos de cultivo in vitro e ex vitro (aclimatização) estabelecidos, verificando-se a possibilidade da produção de biomassa vegetal uniforme e de maneira otimizada, com a manutenção da síntese dos metabólitos de interesse. H. teretiusculum, espécie recém identificada na região central do estado, apresenta o acúmulo de metabólitos secundários e escassos relatos na literatura, focados em seus aspectos botânicos. Estes fatos levaram ao estabelecimento do protocolo de cultivo in vitro e aclimatização da espécie. As plântulas apresentaram crescimento satisfatório quando cultivadas in vitro em meio MΔ apenas ou suplementado com ácido indol butírico. Após 18 semanas de aclimatização, verificou-se o aumento da biomassa e o acúmulo dos derivados do floroglucinol uliginosina B e isohyperbrasilol B, verificados em traços na planta in natura, bem como hiperbrasilol B e japonicina A, não detectados nos extratos das plantas coletadas de seu habitat natural. Este resultado evidencia a relevância do cultivo in vitro como forma de otimização da produção de moléculas bioativas. Entre as espécies nativas estudadas, H. polyanthemum destaca-se por ser a única, até o momento, produtora dos três benzopiranos, HP1, HP2 e HP3. Além deles, a planta também produz o derivado do floroglucinol uliginosina B. A presença de HP1, com atividades analgésica e antidepressiva bem como de uliginosina B, que se classifica como novo protótipo para moléculas antidepressivas, levou ao desenvolvimento de um depósito de patente para o extrato n-hexano da espécie e requer estudos para a investigação da otimização em sua biossíntese. Neste sentido, a influência da imposição de estresse abiótico (ácido salicílico e dano mecânico, sozinhos ou combinados, fertilização e seca, sozinhos ou combinados) em plantas aclimatizadas de H. polyanthemum foi investigada na décima oitava semana de aclimatização. Embora HP2 não tenha apresentado aumento em nenhum dos tratamentos aplicados, o aumento de 40 e 6 vezes na produção de uliginosina B nas folhas e flores, respectivamente, destaca-se entre os resultados obtidos, bem como aumento significativo na síntese de HP1 nas folhas e flores e HP3 nas folhas após a aplicação de seca e seca com fertilização, respectivamente. Os resultados sugerem que a biossíntese dos principais metabólitos de H. polyanthemum pode ser consideravelmente incrementada com a exploração do recurso da imposição de estresse hídrico no mesmo. O estabelecimento do cultivo in vitro de raízes adventícias de H. polyanthemum foi realizado como alternativa de produção rápida e “limpa” dos metabólitos secundários de interesse. No entanto, embora apresentando crescimento satisfatório em meio líquido, a síntese de benzopiranos e floroglucinois não foi verificada, mas a produção de diversas xantonas. Interessante é ressaltar que apenas traços de uma xantona é relatado para plantas in natura da espécie, não sendo detectada em plântulas cultivadas in vitro. Com o objetivo de compreender a produção e regulação na síntese destes compostos, realizou-se a investigação de enzimas poliacetídeo sintases (PKS) do tipo III nos tecidos da espécie, com o objetivo principal da obtenção de uma isobutirofenona sintase, envolvida com a biossíntese de floroglucinois e benzopiranos. Dos screenings realizados com primers de expressão de algumas PKS do tipo III foi possível isolar uma benzofenona sintase (BPS) das culturas de células em suspensão e um fragmento 3’-terminal de uma ORF específica para PKS do tipo III, sem apresentar enzimas funcionalmente relacionadas à BPSs. Estes achados concordam com o perfil fitoquímico das culturas de células em suspensão, que apresentam no mínimo duas xantonas como componentes majoritários, e das plântulas in vitro, que apresentam majoritariamente benzopiranos e derivados do floroglucinol em seus extratos, sem detecção de estruturas relacionadas à xantonas. Considerados em seu conjunto, os resultados do presente trabalho contribuem para a preservação e manutenção da qualidade do material vegetal das espécies de Hypericum com potencial uso na terapêutica, bem como contribui para o entendimento da biosíntese dos principais metabólitos de H. polyanthemum que demonstram variar de acordo com o tecido vegetal. / Plant secondary metabolites are long ago known to be able to perform pharmacological effects. Hypericum genus possesses 494 species distributed around the world and approximately 20 grow in south Brazil and accumulate phenolic compounds such as flavonoids, xanthones, benzopyrans and phloroglucinol derivatives. Aiming plant quantity and quality for pharmaceutical industry purposes, as well as to avoid natural resource exploitation, in vitro and ex vitro (acclimatization) protocols were established for H. polyanthemum, H. ternum, H. myrianthum, H. carinatum e H. campestre, affording uniform and increased vegetal biomass. H. teretiusculum is a species recently found in the state center, demonstrating secondary metabolite accumulation and only few information in literature, most of them directed to botanical aspects. These data leaded to the establishment of in vitro and ex vitro propagation protocols for the species. Plants were successfully micropropagated in MΔ medium with or without IBA supplementation. After 18 weeks of field growth, vegetal biomass increase and phloroglucinol derivatives accumulation was verified, with uliginosin B and isohyperbrasilol B, just found as traces in in natura plants as well as hyperbrasilol B and japonicin A, not detected in plants harvested directly from the wild. These results attest the relevance of cultivation protocols establishment aiming to optimize bioactive molecules obtainment. Among the native studied species, H. polyanthemum is highlighted for HP1, HP2 and HP3 benzopyrans productions, described just for the species until now. Besides, the phloroglucinol uliginosin B is also produced. The presence of HP1, with antinociceptive and antidepressant activities and uliginosin B, classified as a novel prototype for antidepressant-like molecules, a patent was deposited for n-hexanic extract of the species, claiming for investigations focusing on biosynthesis increment. Guided for this objective, abiotic stresses (SA application and mechanical damage, alone or combined, mild fertilization and drough, alone or combined) was imposed to acclimatized plants of H. polyanthemum on eighteenth week of field growth. Although HP2 was not increased with any of the applied treatments, a 40-fold and 6-fold increase on uliginosin B production in leaves and reproductive parts, respectively are highlighted among the obtained results, as well as significant increase in HP1 in leaves and HP3 in reproductive parts after drought and drought + fertilization treatment, respectively. The data suggest that main H. polyanthemum metabolites might be strongly induced by drought stress modulation. The establishment of in vitro adventitious root cultures of H. polyanthemum was described as alternative for rapid and “clean” secondary metabolites obtainment. Nevertheless, even demonstrating ability for stable in vitro growth, benzopyrans and phloroglucinol derivatives were not detected in this tissue, but a wide array of xanthones was detected instead. It is interesting to point out that only traces of xanthone is related for in natura plants and such class of compounds was not detected in in vitro plants. Aiming to understand biosynthesis of these compound, type III polyketide synthases (type III PKS) were investigated in H. polyanthemum tissue, focusing mainly on BUS discovery, involved in benzopyrans and phloroglucinol biosynthesis. After screening cell suspension cultures cDNA, a benzophenone synthase (BPS) enzyme was isolated and biochemically characterized, while in vitro plants afforded a 3’-end fragment of a type III PKS specific ORF and neither other enzymes related with xanthone biosynthesis. These data are in accordance with phytochemical profile displayed by cells suspensions, presenting at least two xanthones as majoritarian compounds in the extracts, and plants, which just accumulate benzopyrans and uliginosin B. Considered compiled data, the present work direct medicinal plant studies into increment of valuable secondary metabolites.

O gênero Hypericum (Guttiferae = Clusiaceae) compreende 494 espécies acomodadas em 36 seções taxonômicas. Os representantes americanos pertencem, sobretudo, às seções Brathys e Trigynobrathys, as duas maiores com 87 e 52 espécies, respectivamente. Popularmente, estas plantas são utilizadas como antissépticos, diuréticos, digestivos e agentes de cicatrização. Quimicamente, apresentam tendência em acumular floroglucinóis diméricos, além de benzofenonas, benzopiranos, flavonoides e ácidos fenólicos, metabólitos cuja atividade antidepressiva, antinociceptiva, antimicrobiana, antiproliferativa e antioxidante são descritas. Considerando o potencial terapêutico, este trabalho objetivou a determinação dos principais compostos fenólicos presente nas flores de espécies Hypericum nativas do Sul do Brasil (H. campestre, H. caprifoliatum, H. carinatum, H. connatum, H. linoides, H. myrianthum, H. polyanthemum e H. salvadorense) e dos Páramos peruanos (H. andinum e H. laricifolium); a extração e análise dos compostos fenólicos de H. carinatum obtidos com CO2 supercrítico e a investigação da atividade antifúngica e antiquimiotática dos extratos lipofílicos de H. caprifoliatum, H. carinatum, H. linoides, H. myrianthum e H. polyanthemum. Para os experimentos, foram coletadas (2008 - 2010) as partes aéreas das plantas em floração. Todas as coletas foram autorizadas pelos órgãos de proteção ambiental. Os métodos extrativos incluem maceração estática, ultrassom e CO2 supercrítico (temperatura = 40, 50 ou 60ºC; pressão = 90, 120, 150 ou 200 bar). As análises por CLAE foram realizadas em coluna de fase reversa (C18), sistemas isocráticos compostos por acetonitrila, água e ácido trifluroacético e detecção ultravioleta (220, 270 ou 254 nm); Os picos foram identificados pela comparação dos tempos de retenção/co-injeção com padrões e quantificados pela curva de calibração dos compostos. Os ensaios antifúngico e antiquimiotático foram realizados pelo método de microdiluição em caldo e inibição da migração de neutrófilos, respectivamente. O floroglucinol dimérico uliginosina B (0,008 – 0,188%) e o flavonoide hiperosídeo (0,057 – 5,987%) foram os principais metabólitos detectados nas flores das espécies investigadas. Hypericum caprifoliatum e H. andinum apresentaram o maior rendimento destes compostos, respectivamente. Sete espécies apresentaram japonicina A em concentrações de 0,003 a 0,087% (H. myrianthum). O rendimento de hiperbrasilol B variou de 0,006% em H. laricifolium a 0,011% em H. caprifoliatum. Os benzopiranos (HP1 = 0,200%, HP2 = 0,225% e HP3 = 0,327%) e as benzofenonas (carifenona A = 0,309% e carifenona B = 0,062%) ocorreram exclusivamente em H. polyanthemum e H. carinatum. As máximas quantidades de ácido clorogênico, isoquercitrina, quercitrina e guaijaverina foram observadas, respectivamente, em H. campestre (1,458%), H. andinum (1,161%), H. carinatum (0,231%) e H. laricifolium (0,404%). Tais resultados fornecem suporte adicional para o significado quimiotaxonômico dos derivados diméricos de floroglucinol. Temperatura (40°C = 3,04%, 50°C = 2,21% e 60°C = 1,05%) e pressão (90 bar = 0,95%, 150 bar = 0,97% e 200 bar = 1,89%) afetaram de modo distinto o rendimento do extrato supercrítico de H. carinatum. Apesar do menor rendimento em comparação ao extrato n-hexano (6,09%), a extração com CO2 supercrítico provou ser mais seletiva que a maceração. Nas condições ideais (40°C, 90 bar e 180 minutos), a máxima recuperação de uliginosina B, carifenona A e carifenona B foi, respectivamente, 162,83, 376,33 e 48,79%. O modelo matemático empregado para simular o processo de extração foi apropriadamente correlacionado aos dados experimentais. Considerando as atividades biológicas, todas as espécies investigadas apresentaram um amplo espectro de ação antifúngica, assim como reduziram a migração dos neutrófilos. Os extratos de H. carinatum, H. linoides e H. myrianthum apresentaram os mais baixos valores de concentração inibitória mínima contra Cryptococcus neoformans (CIM £ 15,6 μg/mL), Rhodotorula mucilaginosa (CIM £ 62,5 μg/mL), Candida glabrata e C. tropicalis (CIM = 1,9-250 μg/mL). Para estas plantas, o efeito antiquimiotático variou entre 60 - 100% nas concentrações de 0,31 a 10 μg/mL. Os extratos mais ativos apresentaram elevada concentração de uliginosina B, japonicina A e hiperbrasilol B. Assim, as espécies de Hypericum nativas do sul do Brasil apresentam potencial como fonte de novos antifúngicos e anti-inflamatórios. / The genus Hypericum (Guttiferae = Clusiaceae) comprises 494 species placed in 36 taxonomic sections. The representatives of Central and South America belong primarily to sections Brathys and Trigynobrathys, the two largest sections with 87 and 52 species, respectively. In traditional medicine, these plants are used as antiseptic, diuretic, digestive and as healing agents. Such species have a strong tendency to accumulate dimeric phloroglucinol, besides benzophenones, benzopyrans, flavonoids and phenolic acids, metabolites whose antidepressant, antinociceptive, antimicrobial, antiproliferative and antioxidant activities are described. In view of the therapeutic potential, this work aimed to determine the main phenolic compounds present in flowers of Hypericum species native to southern Brazil (H. campestre, H. caprifoliatum, H. carinatum, H. connatum, H. linoides, H. myrianthum, H. polyanthemum and H. salvadorense) and to Peruvian Páramos (H. andinum and H. laricifolium); the supercritical CO2 extraction and analysis of the phenolic compounds of H. carinatum; the antifungal and antichemotactic activities of the lipophilic extracts from H. caprifoliatum, H. carinatum, H. linoides, H. myrianthum and H. polyanthemum. For the experiments, aerial parts in blossom were harvested (2008 - 2010). All collections were authorized by competent agencies of environmental protection. The extraction methods employed were static maceration, ultrasonic bath or supercritical CO2 (temperature = 40, 50 or 60ºC; pressure = 90, 120, 150 or 200 bar). HPLC analyses were carried out in reverse phase column (C18), isocratic system composed of acetonitrile, water and trifluoroacetic acid, and ultraviolet detection (220, 270 or 254 nm). Peaks were identified by comparison of retention times / co-injection with standards and quantified by calibration curve of the compounds. Antifungal and antichemotactic tests were performed using the broth microdilution assay and neutrophils migration inhibition method. The dimeric phloroglucinol uliginosin B (0.008 - 0.188%) and the flavonoid hyperoside (0.057 - 5.987%) were the main metabolite detected in flowers of the investigated species. Hypericum caprifoliatum and H. andinum displayed higher yields of these compounds, respectively. Japonicin A was found in seven species studied at concentrations that varied from 0.003 to 0.087% (H. myrianthum). The yield of hyperbrasilol B ranged from 0.006% in H. laricifolium to 0.011% in H. caprifoliatum. The benzopyrans (HP1 = 0.200%, HP2 = 0.225% and HP3 = 0.327%) and benzophenones (cariphenone A = 0.309% and cariphenone B = 0.062%) occurred exclusively in H. polyanthemum and H. carinatum. Maximum amounts of chlorogenic acid, isoquercitrin, quercitrin and guaijaverin were observed, respectively, in H. campestre (1.458%), H. andinum (1.161%), H. carinatum (0.231%) and H. laricifolium (0.404%). Such results provide a further support for the chemotaxonomic significance of the dimeric phloroglucinols. Temperature (40°C = 3.04%, 50°C = 2.21% and 60°C = 1.05%) and pressure (90 bar = 0.95%, 150 bar = 0.97% and 200 bar = 1.89%) critical did affect differently the yield of supercritical extract of H. carinatum. Despite lower yield in comparison to n-hexane extract (6.09%), supercritical CO2 extraction proved to be more selective than maceration. In optimal conditions (40°C, 90 bar and 180 minutes), the maximum amount of uliginosin B, cariphenone A and cariphenone B was, respectively, 162.83, 376.33 and 48.79%. Lastly, the mathematical model used in the process of supercritical extraction was properly correlated to the experimental data. Regarding the biological activities, all investigated species exhibited a broad spectrum of antifungal action as well as reduced neutrophils migration. Hypericum carinatum, H. linoides and H. myrianthum extracts presented the lowest value of minimum inhibitory concentration against Cryptococcus neoformans (MIC ≤ 15.6 μg/mL), Rhodotorula mucilaginosa (MIC ≤ 62.5 μg/mL), Candida glabrata and C. tropicalis (MIC range = 1.9 - 250 μg/mL). For these plants, the antichemotactic effect varied from 60-100% at concentrations of 0.31 to 10 μg/mL. The most active extracts were that presented high amounts of uliginosin B, japonicin A and hyperbrasilol B. Thus, the Hypericum species native to Southern Brazil show potential as source of new anti-infectives and anti-inflammatory drugs.

Metabólitos secundários produzidos por espécies vegetais são, há tempos, reconhecidos como moléculas capazes de desempenhar ações farmacológicas. Entre as plantas medicinais mais utilizadas estão espécies do gênero Hypericum, pertencente à família Guttiferae, e que possui 494 espécies. Destas, aproximadamente 20 estão distribuídas no sul e sudeste do Brasil e apresentam o acúmulo de compostos fenólicos como flavonoides, xantonas, benzopiranos e floroglucinois. Como forma de garantia da qualidade e quantidade de plantas medicinais para consumo da indústria farmacêutica, bem como uma alternativa para preservação das espécies, o estabelecimento de protocolos de cultivo apresenta-se como uma opção vantajosa frente ao uso de plantas coletadas diretamente de seus locais de crescimento. Por este motivo, espécies nativas do sul do Brasil como H. polyanthemum, H. ternum, H. myrianthum, H. carinatum e H. campestre tiveram seus protocolos de cultivo in vitro e ex vitro (aclimatização) estabelecidos, verificando-se a possibilidade da produção de biomassa vegetal uniforme e de maneira otimizada, com a manutenção da síntese dos metabólitos de interesse. H. teretiusculum, espécie recém identificada na região central do estado, apresenta o acúmulo de metabólitos secundários e escassos relatos na literatura, focados em seus aspectos botânicos. Estes fatos levaram ao estabelecimento do protocolo de cultivo in vitro e aclimatização da espécie. As plântulas apresentaram crescimento satisfatório quando cultivadas in vitro em meio MΔ apenas ou suplementado com ácido indol butírico. Após 18 semanas de aclimatização, verificou-se o aumento da biomassa e o acúmulo dos derivados do floroglucinol uliginosina B e isohyperbrasilol B, verificados em traços na planta in natura, bem como hiperbrasilol B e japonicina A, não detectados nos extratos das plantas coletadas de seu habitat natural. Este resultado evidencia a relevância do cultivo in vitro como forma de otimização da produção de moléculas bioativas. Entre as espécies nativas estudadas, H. polyanthemum destaca-se por ser a única, até o momento, produtora dos três benzopiranos, HP1, HP2 e HP3. Além deles, a planta também produz o derivado do floroglucinol uliginosina B. A presença de HP1, com atividades analgésica e antidepressiva bem como de uliginosina B, que se classifica como novo protótipo para moléculas antidepressivas, levou ao desenvolvimento de um depósito de patente para o extrato n-hexano da espécie e requer estudos para a investigação da otimização em sua biossíntese. Neste sentido, a influência da imposição de estresse abiótico (ácido salicílico e dano mecânico, sozinhos ou combinados, fertilização e seca, sozinhos ou combinados) em plantas aclimatizadas de H. polyanthemum foi investigada na décima oitava semana de aclimatização. Embora HP2 não tenha apresentado aumento em nenhum dos tratamentos aplicados, o aumento de 40 e 6 vezes na produção de uliginosina B nas folhas e flores, respectivamente, destaca-se entre os resultados obtidos, bem como aumento significativo na síntese de HP1 nas folhas e flores e HP3 nas folhas após a aplicação de seca e seca com fertilização, respectivamente. Os resultados sugerem que a biossíntese dos principais metabólitos de H. polyanthemum pode ser consideravelmente incrementada com a exploração do recurso da imposição de estresse hídrico no mesmo. O estabelecimento do cultivo in vitro de raízes adventícias de H. polyanthemum foi realizado como alternativa de produção rápida e “limpa” dos metabólitos secundários de interesse. No entanto, embora apresentando crescimento satisfatório em meio líquido, a síntese de benzopiranos e floroglucinois não foi verificada, mas a produção de diversas xantonas. Interessante é ressaltar que apenas traços de uma xantona é relatado para plantas in natura da espécie, não sendo detectada em plântulas cultivadas in vitro. Com o objetivo de compreender a produção e regulação na síntese destes compostos, realizou-se a investigação de enzimas poliacetídeo sintases (PKS) do tipo III nos tecidos da espécie, com o objetivo principal da obtenção de uma isobutirofenona sintase, envolvida com a biossíntese de floroglucinois e benzopiranos. Dos screenings realizados com primers de expressão de algumas PKS do tipo III foi possível isolar uma benzofenona sintase (BPS) das culturas de células em suspensão e um fragmento 3’-terminal de uma ORF específica para PKS do tipo III, sem apresentar enzimas funcionalmente relacionadas à BPSs. Estes achados concordam com o perfil fitoquímico das culturas de células em suspensão, que apresentam no mínimo duas xantonas como componentes majoritários, e das plântulas in vitro, que apresentam majoritariamente benzopiranos e derivados do floroglucinol em seus extratos, sem detecção de estruturas relacionadas à xantonas. Considerados em seu conjunto, os resultados do presente trabalho contribuem para a preservação e manutenção da qualidade do material vegetal das espécies de Hypericum com potencial uso na terapêutica, bem como contribui para o entendimento da biosíntese dos principais metabólitos de H. polyanthemum que demonstram variar de acordo com o tecido vegetal. / Plant secondary metabolites are long ago known to be able to perform pharmacological effects. Hypericum genus possesses 494 species distributed around the world and approximately 20 grow in south Brazil and accumulate phenolic compounds such as flavonoids, xanthones, benzopyrans and phloroglucinol derivatives. Aiming plant quantity and quality for pharmaceutical industry purposes, as well as to avoid natural resource exploitation, in vitro and ex vitro (acclimatization) protocols were established for H. polyanthemum, H. ternum, H. myrianthum, H. carinatum e H. campestre, affording uniform and increased vegetal biomass. H. teretiusculum is a species recently found in the state center, demonstrating secondary metabolite accumulation and only few information in literature, most of them directed to botanical aspects. These data leaded to the establishment of in vitro and ex vitro propagation protocols for the species. Plants were successfully micropropagated in MΔ medium with or without IBA supplementation. After 18 weeks of field growth, vegetal biomass increase and phloroglucinol derivatives accumulation was verified, with uliginosin B and isohyperbrasilol B, just found as traces in in natura plants as well as hyperbrasilol B and japonicin A, not detected in plants harvested directly from the wild. These results attest the relevance of cultivation protocols establishment aiming to optimize bioactive molecules obtainment. Among the native studied species, H. polyanthemum is highlighted for HP1, HP2 and HP3 benzopyrans productions, described just for the species until now. Besides, the phloroglucinol uliginosin B is also produced. The presence of HP1, with antinociceptive and antidepressant activities and uliginosin B, classified as a novel prototype for antidepressant-like molecules, a patent was deposited for n-hexanic extract of the species, claiming for investigations focusing on biosynthesis increment. Guided for this objective, abiotic stresses (SA application and mechanical damage, alone or combined, mild fertilization and drough, alone or combined) was imposed to acclimatized plants of H. polyanthemum on eighteenth week of field growth. Although HP2 was not increased with any of the applied treatments, a 40-fold and 6-fold increase on uliginosin B production in leaves and reproductive parts, respectively are highlighted among the obtained results, as well as significant increase in HP1 in leaves and HP3 in reproductive parts after drought and drought + fertilization treatment, respectively. The data suggest that main H. polyanthemum metabolites might be strongly induced by drought stress modulation. The establishment of in vitro adventitious root cultures of H. polyanthemum was described as alternative for rapid and “clean” secondary metabolites obtainment. Nevertheless, even demonstrating ability for stable in vitro growth, benzopyrans and phloroglucinol derivatives were not detected in this tissue, but a wide array of xanthones was detected instead. It is interesting to point out that only traces of xanthone is related for in natura plants and such class of compounds was not detected in in vitro plants. Aiming to understand biosynthesis of these compound, type III polyketide synthases (type III PKS) were investigated in H. polyanthemum tissue, focusing mainly on BUS discovery, involved in benzopyrans and phloroglucinol biosynthesis. After screening cell suspension cultures cDNA, a benzophenone synthase (BPS) enzyme was isolated and biochemically characterized, while in vitro plants afforded a 3’-end fragment of a type III PKS specific ORF and neither other enzymes related with xanthone biosynthesis. These data are in accordance with phytochemical profile displayed by cells suspensions, presenting at least two xanthones as majoritarian compounds in the extracts, and plants, which just accumulate benzopyrans and uliginosin B. Considered compiled data, the present work direct medicinal plant studies into increment of valuable secondary metabolites.

Plantas do gênero Hypericum são bem conhecidas por sua utilização na medicina tradicional, sendo Hypericum perforatum a espécie mais estudada. No Sul do Brasil, esse gênero é representado por cerca de 20 espécies, entre elas, destaca-se H. polyanthemum, o qual apresenta em extrato lipofílico a presença de uliginosina B, um derivado de floroglucinol, e três benzopiranos: HP1, HP2 e HP3. Partes aéreas de H. polyanthemum foram submetidas à extração com fluido supercrítico (SFE), sendo realizadas extrações sucessivas com dióxido de carbono nas pressões de 90, 120, 150 e 200 bar, em diferentes temperaturas (40, 50 e 60 °C). Posteriormente, as frações obtidas foram comparadas com extrato n-hexano obtido por técnica convencional (ultra-som). SFE apresentou maior seletividade que a extração com nhexano, sendo a 50 °C a melhor condição para extrair os metabólitos bioativos. Para extração do composto com maior peso molecular, uliginosina B, pressões mais elevadas foram necessárias. Além disso, avaliou-se a atividade anti- Trichomonas vaginalis do extrato obtido por SFE a 50 °C/150 bar e dos compostos isolados. Os resultados indicam que todas as amostras testadas possuem atividade anti-T. vaginalis, porém, HP1 demonstrou melhor seletividade frente ao protozoário (isolado metronidazol-resistente e -suscetível), sem apresentar citotoxicidade contra células de mamíferos. Ainda, o HP1 apresentou satisfatória atividade contra isolado metronidazol-resistente (52% de trofozoítos viáveis), apresentando efeito sinérgico quando testado com baixa concentração de metronidazol (23% de trofozoítos viáveis). Todos os compostos isolados provocaram danos na membrana do parasito (liberação de LDH > 90%) e nenhuma das amostras apresentou efeito hemolítico importante, sendo que HP2 e uliginosina B apresentaram citotoxicidade frente a células de mamíferos. Portanto, benzopiranos e derivados de floroglucinol são moléculas promissoras como protótipos para novos fármacos tricomonicida, principalmente HP1, visto que corrobora com a ação do metronidazol em isolados de T. vaginalis resistentes. No entanto, mais estudos são necessários a fim de melhorar a atividade antiprotozoária das moléculas testadas, sem que as mesmas apresentem toxicidade para células de mamíferos. / Plants of the genus Hypericum are well known for their use in traditional medicine, being H. perforatum the most important species. In South Brazil, this genus is represented by approximately 20 species and among them, H. polyanthemum showed in the lipophilic extract the presence of uliginosin B, a phloroglucinol derivative, and three benzopyrans: HP1, HP2 and HP3. Aerial parts of H. polyanthemum were submitted a supercritical fluid extraction (SFE), being successively extracted with supercritical carbon dioxide under pressures of 90, 120, 150 and 200 bar at different temperatures (40, 50 and 60 ºC), and compared with the n-hexane extract obtained by ultrasound-assisted extraction. SFE presented higher selectivity than the n-hexane extration. The best condition to extract the target metabolites has been determined to be at 50 °C, being that for the high molecularweight compound, uliginosin B, higher pressures was required. Moreover, the anti- Trichomonas vaginalis activity of the extract obtained by SFE at 50 °C/150 bar and the isolated compounds was evaluated. The results showed that all samples have anti-T. vaginalis activity; however, HP1 demonstrated the best selectivity against this protozoa (metronidazole-resistant and -susceptible isolates), with no cytotoxicity against mammalian cells. In addition, HP1 has good activity against metronidazoleresistant isolate (52% of viable trophozoites), presenting synergic effect when tested with low concentration of metronidazole (23% of viable trophozoites). All isolated compounds caused damage in the parasites membrane, revealed by more than 90% of LDH release. None of the samples presented important hemolytic effect, and HP2 and uliginosin B presented cytotoxicity against mammalian cells. Therefore, benzopyrans and phloroglucinol derivative are promising molecules as prototypes for new antiprotozoal drugs, especially HP1, which improve metronidazole action against a resistant T. vaginalis isolate. Nevertheless, more studies are necessary in order to enhance their in vitro antiprotozoal activity without toxicity for mammalian cells.

Metabólitos secundários produzidos por espécies vegetais são, há tempos, reconhecidos como moléculas capazes de desempenhar ações farmacológicas. Entre as plantas medicinais mais utilizadas estão espécies do gênero Hypericum, pertencente à família Guttiferae, e que possui 494 espécies. Destas, aproximadamente 20 estão distribuídas no sul e sudeste do Brasil e apresentam o acúmulo de compostos fenólicos como flavonoides, xantonas, benzopiranos e floroglucinois. Como forma de garantia da qualidade e quantidade de plantas medicinais para consumo da indústria farmacêutica, bem como uma alternativa para preservação das espécies, o estabelecimento de protocolos de cultivo apresenta-se como uma opção vantajosa frente ao uso de plantas coletadas diretamente de seus locais de crescimento. Por este motivo, espécies nativas do sul do Brasil como H. polyanthemum, H. ternum, H. myrianthum, H. carinatum e H. campestre tiveram seus protocolos de cultivo in vitro e ex vitro (aclimatização) estabelecidos, verificando-se a possibilidade da produção de biomassa vegetal uniforme e de maneira otimizada, com a manutenção da síntese dos metabólitos de interesse. H. teretiusculum, espécie recém identificada na região central do estado, apresenta o acúmulo de metabólitos secundários e escassos relatos na literatura, focados em seus aspectos botânicos. Estes fatos levaram ao estabelecimento do protocolo de cultivo in vitro e aclimatização da espécie. As plântulas apresentaram crescimento satisfatório quando cultivadas in vitro em meio MΔ apenas ou suplementado com ácido indol butírico. Após 18 semanas de aclimatização, verificou-se o aumento da biomassa e o acúmulo dos derivados do floroglucinol uliginosina B e isohyperbrasilol B, verificados em traços na planta in natura, bem como hiperbrasilol B e japonicina A, não detectados nos extratos das plantas coletadas de seu habitat natural. Este resultado evidencia a relevância do cultivo in vitro como forma de otimização da produção de moléculas bioativas. Entre as espécies nativas estudadas, H. polyanthemum destaca-se por ser a única, até o momento, produtora dos três benzopiranos, HP1, HP2 e HP3. Além deles, a planta também produz o derivado do floroglucinol uliginosina B. A presença de HP1, com atividades analgésica e antidepressiva bem como de uliginosina B, que se classifica como novo protótipo para moléculas antidepressivas, levou ao desenvolvimento de um depósito de patente para o extrato n-hexano da espécie e requer estudos para a investigação da otimização em sua biossíntese. Neste sentido, a influência da imposição de estresse abiótico (ácido salicílico e dano mecânico, sozinhos ou combinados, fertilização e seca, sozinhos ou combinados) em plantas aclimatizadas de H. polyanthemum foi investigada na décima oitava semana de aclimatização. Embora HP2 não tenha apresentado aumento em nenhum dos tratamentos aplicados, o aumento de 40 e 6 vezes na produção de uliginosina B nas folhas e flores, respectivamente, destaca-se entre os resultados obtidos, bem como aumento significativo na síntese de HP1 nas folhas e flores e HP3 nas folhas após a aplicação de seca e seca com fertilização, respectivamente. Os resultados sugerem que a biossíntese dos principais metabólitos de H. polyanthemum pode ser consideravelmente incrementada com a exploração do recurso da imposição de estresse hídrico no mesmo. O estabelecimento do cultivo in vitro de raízes adventícias de H. polyanthemum foi realizado como alternativa de produção rápida e “limpa” dos metabólitos secundários de interesse. No entanto, embora apresentando crescimento satisfatório em meio líquido, a síntese de benzopiranos e floroglucinois não foi verificada, mas a produção de diversas xantonas. Interessante é ressaltar que apenas traços de uma xantona é relatado para plantas in natura da espécie, não sendo detectada em plântulas cultivadas in vitro. Com o objetivo de compreender a produção e regulação na síntese destes compostos, realizou-se a investigação de enzimas poliacetídeo sintases (PKS) do tipo III nos tecidos da espécie, com o objetivo principal da obtenção de uma isobutirofenona sintase, envolvida com a biossíntese de floroglucinois e benzopiranos. Dos screenings realizados com primers de expressão de algumas PKS do tipo III foi possível isolar uma benzofenona sintase (BPS) das culturas de células em suspensão e um fragmento 3’-terminal de uma ORF específica para PKS do tipo III, sem apresentar enzimas funcionalmente relacionadas à BPSs. Estes achados concordam com o perfil fitoquímico das culturas de células em suspensão, que apresentam no mínimo duas xantonas como componentes majoritários, e das plântulas in vitro, que apresentam majoritariamente benzopiranos e derivados do floroglucinol em seus extratos, sem detecção de estruturas relacionadas à xantonas. Considerados em seu conjunto, os resultados do presente trabalho contribuem para a preservação e manutenção da qualidade do material vegetal das espécies de Hypericum com potencial uso na terapêutica, bem como contribui para o entendimento da biosíntese dos principais metabólitos de H. polyanthemum que demonstram variar de acordo com o tecido vegetal. / Plant secondary metabolites are long ago known to be able to perform pharmacological effects. Hypericum genus possesses 494 species distributed around the world and approximately 20 grow in south Brazil and accumulate phenolic compounds such as flavonoids, xanthones, benzopyrans and phloroglucinol derivatives. Aiming plant quantity and quality for pharmaceutical industry purposes, as well as to avoid natural resource exploitation, in vitro and ex vitro (acclimatization) protocols were established for H. polyanthemum, H. ternum, H. myrianthum, H. carinatum e H. campestre, affording uniform and increased vegetal biomass. H. teretiusculum is a species recently found in the state center, demonstrating secondary metabolite accumulation and only few information in literature, most of them directed to botanical aspects. These data leaded to the establishment of in vitro and ex vitro propagation protocols for the species. Plants were successfully micropropagated in MΔ medium with or without IBA supplementation. After 18 weeks of field growth, vegetal biomass increase and phloroglucinol derivatives accumulation was verified, with uliginosin B and isohyperbrasilol B, just found as traces in in natura plants as well as hyperbrasilol B and japonicin A, not detected in plants harvested directly from the wild. These results attest the relevance of cultivation protocols establishment aiming to optimize bioactive molecules obtainment. Among the native studied species, H. polyanthemum is highlighted for HP1, HP2 and HP3 benzopyrans productions, described just for the species until now. Besides, the phloroglucinol uliginosin B is also produced. The presence of HP1, with antinociceptive and antidepressant activities and uliginosin B, classified as a novel prototype for antidepressant-like molecules, a patent was deposited for n-hexanic extract of the species, claiming for investigations focusing on biosynthesis increment. Guided for this objective, abiotic stresses (SA application and mechanical damage, alone or combined, mild fertilization and drough, alone or combined) was imposed to acclimatized plants of H. polyanthemum on eighteenth week of field growth. Although HP2 was not increased with any of the applied treatments, a 40-fold and 6-fold increase on uliginosin B production in leaves and reproductive parts, respectively are highlighted among the obtained results, as well as significant increase in HP1 in leaves and HP3 in reproductive parts after drought and drought + fertilization treatment, respectively. The data suggest that main H. polyanthemum metabolites might be strongly induced by drought stress modulation. The establishment of in vitro adventitious root cultures of H. polyanthemum was described as alternative for rapid and “clean” secondary metabolites obtainment. Nevertheless, even demonstrating ability for stable in vitro growth, benzopyrans and phloroglucinol derivatives were not detected in this tissue, but a wide array of xanthones was detected instead. It is interesting to point out that only traces of xanthone is related for in natura plants and such class of compounds was not detected in in vitro plants. Aiming to understand biosynthesis of these compound, type III polyketide synthases (type III PKS) were investigated in H. polyanthemum tissue, focusing mainly on BUS discovery, involved in benzopyrans and phloroglucinol biosynthesis. After screening cell suspension cultures cDNA, a benzophenone synthase (BPS) enzyme was isolated and biochemically characterized, while in vitro plants afforded a 3’-end fragment of a type III PKS specific ORF and neither other enzymes related with xanthone biosynthesis. These data are in accordance with phytochemical profile displayed by cells suspensions, presenting at least two xanthones as majoritarian compounds in the extracts, and plants, which just accumulate benzopyrans and uliginosin B. Considered compiled data, the present work direct medicinal plant studies into increment of valuable secondary metabolites.

Plantas do gênero Hypericum são bem conhecidas por sua utilização na medicina tradicional, sendo Hypericum perforatum a espécie mais estudada. No Sul do Brasil, esse gênero é representado por cerca de 20 espécies, entre elas, destaca-se H. polyanthemum, o qual apresenta em extrato lipofílico a presença de uliginosina B, um derivado de floroglucinol, e três benzopiranos: HP1, HP2 e HP3. Partes aéreas de H. polyanthemum foram submetidas à extração com fluido supercrítico (SFE), sendo realizadas extrações sucessivas com dióxido de carbono nas pressões de 90, 120, 150 e 200 bar, em diferentes temperaturas (40, 50 e 60 °C). Posteriormente, as frações obtidas foram comparadas com extrato n-hexano obtido por técnica convencional (ultra-som). SFE apresentou maior seletividade que a extração com nhexano, sendo a 50 °C a melhor condição para extrair os metabólitos bioativos. Para extração do composto com maior peso molecular, uliginosina B, pressões mais elevadas foram necessárias. Além disso, avaliou-se a atividade anti- Trichomonas vaginalis do extrato obtido por SFE a 50 °C/150 bar e dos compostos isolados. Os resultados indicam que todas as amostras testadas possuem atividade anti-T. vaginalis, porém, HP1 demonstrou melhor seletividade frente ao protozoário (isolado metronidazol-resistente e -suscetível), sem apresentar citotoxicidade contra células de mamíferos. Ainda, o HP1 apresentou satisfatória atividade contra isolado metronidazol-resistente (52% de trofozoítos viáveis), apresentando efeito sinérgico quando testado com baixa concentração de metronidazol (23% de trofozoítos viáveis). Todos os compostos isolados provocaram danos na membrana do parasito (liberação de LDH > 90%) e nenhuma das amostras apresentou efeito hemolítico importante, sendo que HP2 e uliginosina B apresentaram citotoxicidade frente a células de mamíferos. Portanto, benzopiranos e derivados de floroglucinol são moléculas promissoras como protótipos para novos fármacos tricomonicida, principalmente HP1, visto que corrobora com a ação do metronidazol em isolados de T. vaginalis resistentes. No entanto, mais estudos são necessários a fim de melhorar a atividade antiprotozoária das moléculas testadas, sem que as mesmas apresentem toxicidade para células de mamíferos. / Plants of the genus Hypericum are well known for their use in traditional medicine, being H. perforatum the most important species. In South Brazil, this genus is represented by approximately 20 species and among them, H. polyanthemum showed in the lipophilic extract the presence of uliginosin B, a phloroglucinol derivative, and three benzopyrans: HP1, HP2 and HP3. Aerial parts of H. polyanthemum were submitted a supercritical fluid extraction (SFE), being successively extracted with supercritical carbon dioxide under pressures of 90, 120, 150 and 200 bar at different temperatures (40, 50 and 60 ºC), and compared with the n-hexane extract obtained by ultrasound-assisted extraction. SFE presented higher selectivity than the n-hexane extration. The best condition to extract the target metabolites has been determined to be at 50 °C, being that for the high molecularweight compound, uliginosin B, higher pressures was required. Moreover, the anti- Trichomonas vaginalis activity of the extract obtained by SFE at 50 °C/150 bar and the isolated compounds was evaluated. The results showed that all samples have anti-T. vaginalis activity; however, HP1 demonstrated the best selectivity against this protozoa (metronidazole-resistant and -susceptible isolates), with no cytotoxicity against mammalian cells. In addition, HP1 has good activity against metronidazoleresistant isolate (52% of viable trophozoites), presenting synergic effect when tested with low concentration of metronidazole (23% of viable trophozoites). All isolated compounds caused damage in the parasites membrane, revealed by more than 90% of LDH release. None of the samples presented important hemolytic effect, and HP2 and uliginosin B presented cytotoxicity against mammalian cells. Therefore, benzopyrans and phloroglucinol derivative are promising molecules as prototypes for new antiprotozoal drugs, especially HP1, which improve metronidazole action against a resistant T. vaginalis isolate. Nevertheless, more studies are necessary in order to enhance their in vitro antiprotozoal activity without toxicity for mammalian cells.

The base-catalysed reaction of 4H-pyran-4-one with a range of nucleophiles, namely diethyl malonate, ethyl acetoacetate, nitromethane, acetylacetone and ethyl cyanoacetate, was developed as a reliable, high yielding method for the preparation of para-substituted phenols. The methodology was extended to include the use of the substituted pyranones, maltol, 2,6-dimethyl-4H-pyran-4-one and diethyl chelidonate. Reactions were studied using conventional heating methods and microwave irradiation. Microwave irradiation had definite beneficial effects, with improved yields, reduced reaction times and cleaner reaction profiles. The potential of this methodology was examined for the regioselective placement of ¹³C-atoms into benzene rings using ¹³C-labelled nucleophiles or ¹³C-labelled 4H-pyran-4-ones. [3,5-13C₂]4H-Pyran-4-one and [2,6-13C₂]4H-pyran-4-one were prepared from various ¹³C-labelled versions of triethyl orthoformate and acetone. This methodology was applied to the synthesis of [1,3,5-¹³C₃]gallic acid, via the base-catalysed reaction of [3,5-¹³C₂]4H-pyran-4-one with diethyl [2-¹³C]malonate, followed by subsequent transformations to yield [1,3,5-¹³C₃]gallic acid. The preparation of [2-¹³C]phloroglucinol was carried out via [2-¹³C]resorcinol, with regioselective placement of a single ¹³C-atom into the aromatic ring. This was accomplished from non-aromatic precursors, with the source of the ¹³C-atom being [¹³C]methyl iodide. The key step in this synthesis was the introduction of the third hydroxyl group, which was achieved using a modified iridium-catalysed C-H activation/borylation/oxidation procedure. The scope of an existing C-H activation/borylation reaction was modified and expanded to include a range of protected resorcinol derivatives. A catalyst system was developed which allowed high conversion to the intermediate arylboronic acids, followed by oxidation using aqueous Oxone® to yield the corresponding phenols. Finally, to demonstrate the potential of these new methods for application in the synthesis of isotopically labelled natural products and polyphenols, the syntheses of ¹³C-labelled anthocyanins were studied. A route was developed that could be applied to the synthesis of either cyanidin-3-glucoside or delphinidin-3-glucoside. Only the final coupling/cyclisation step to yield the desired anthocyanin targets remains to be carried out.

Les plantes médicinales constituent une source inexhaustible de composés (des produits naturels - PN) utilisé en médecine pour la prévention et le traitement de diverses maladies. L'introduction de nouvelles technologies et méthodes dans le domaine de la chimie des produits naturels a permis le développement de méthodes ‘high throughput’ pour la détermination de la composition chimique des extraits de plantes, l'évaluation de leurs propriétés et l'exploration de leur potentiel en tant que candidats médicaments. Dernièrement, la métabolomique, une approche intégrée incorporant les avantages des technologies d'analyse moderne et la puissance de la bioinformatique s’est révélé un outil efficace dans la biologie des systèmes. En particulier, l'application de la métabolomique pour la découverte de nouveaux composés bioactifs constitue un domaine émergent dans la chimie des produits naturels. Dans ce contexte, le genre Acronychia de la famille des Rutaceae a été choisi sur la base de son usage en médecine traditionnelle pour ses propriétés antimicrobienne, antipyrétique, antispasmodique et anti-inflammatoire. Nombre de méthodes chromatographiques modernes, spectrométriques et spectroscopiques sont utilisées pour l'exploration de leur contenu en métabolites suivant trois axes principaux constituant les trois chapitres de cette thèse. En bref, le premier chapitre décrit l’étude phytochimique d’Acronychia pedunculata, l’identification des métabolites secondaires contenus dans cette espèce et l'évaluation de leurs propriétés biologiques. Le deuxième chapitre vise au développement de méthodes analytiques pour l'identification des dimères d’acétophénones (marqueurs chimiotaxonomiques du genre) et aux stratégies utilisées pour la déréplication de ces différents extraits et la caractérisation chimique des composés par UHPLC-HRMSn. Le troisième chapitre se concentre sur l'application de méthodologies métabolomique (RMN et LC-MS) pour l'analyse comparative (entre les différentes espèces, origines, organes), pour des études chimiotaxonomiques (entre les espèces) et pour la corrélation des composés contenus avec une activité pharmacologique. / Medicinal plants constitute an unfailing source of compounds (natural products – NPs) utilised in medicine for the prevention and treatment of various deceases. The introduction of new technologies and methods in the field of natural products chemistry enabled the development of high throughput methodologies for the chemical composition determination of plant extracts, evaluation of their properties and the exploration of their potentials as drug candidates. Lately, metabolomics, an integrated approach incorporating the advantages of modern analytical technologies and the power of bioinformatics has been proven an efficient tool in systems biology. In particular, the application of metabolomics for the discovery of new bioactive compounds constitutes an emerging field in natural products chemistry. In this context, Acronychia genus of Rutaceae family was selected based on its well-known traditional use as antimicrobial, antipyretic, antispasmodic and anti-inflammatory therapeutic agent. Modern chromatographic, spectrometric and spectroscopic methods were utilised for the exploration of their metabolite content following three basic axes constituting the three chapters of this thesis. Briefly, the first chapter describes the phytochemical investigation of Acronychia pedunculata, the identification of secondary metabolites contained in this species and evaluation of their biological properties. The second chapter refers to the development of analytical methods for the identification of acetophenones (chemotaxonomic markers of the genus) and to the dereplication strategies for the chemical characterisation of extracts by UHPLC-HRMSn. The third chapter focuses on the application of metabolomic methodologies (LC-MS & NMR) for comparative analysis (between different species, origins, organs), chemotaxonomic studies (between species) and compound-activity correlations.