京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(理学) / 甲第18100号 / 理博第3978号 / 新制||理||1573(附属図書館) / 30958 / 京都大学大学院理学研究科化学専攻 / (主査)教授 丸岡 啓二, 教授 大須賀 篤弘, 教授 時任 宣博 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Science / Kyoto University / DGAM

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2012-09-04T17:42:37Z No. of bitstreams: 1 Vanessa Lima Souza Vilar Estudo da interaão de fisalina F....pdf: 1393743 bytes, checksum: 1dd12e24922cdabadb9ab093b671a667 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-09-04T17:42:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vanessa Lima Souza Vilar Estudo da interaão de fisalina F....pdf: 1393743 bytes, checksum: 1dd12e24922cdabadb9ab093b671a667 (MD5) Previous issue date: 2010 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, Bahia, Brasil / As fisalinas são seco-esteróides isolados de espécies do gênero Physalis que apresentam diversas atividades biológicas. Em estudos in vitro e em modelos de doenças mediadas pelo sistema imune, foi demonstrado que a fisalina F possui potente atividade imunossupressora, independente da ativação do receptor de glicocorticóide. Neste trabalho foi avaliado se a ação deste esteróide está relacionada à ativação do receptor de vitamina D (VDR), que é um fator de transcrição ativado pela vitamina D3. Inicialmente foi realizado um ensaio de translocação do VDR utilizando células COS-7 transfectadas com plasmídeo codificante para a proteína de fusão YFP-VDR, formada pelo VDR associado à proteína fluorescente amarela. As células transfectadas foram tratadas com 100 ηM da fisalina F e também da fisalina D, que não possui atividade imunossupressora, dexametasona e vitamina D3. Observou-se por microscopia de fluorescência o mesmo padrão de translocação do VDR do citoplasma para o núcleo em células tratadas com a fisalina F e com a vitamina D3, mas não com dexametasona ou fisalina D. Para comprovar a atividade do VDR como fator de transcrição sob ação da fisalina F, células COS-7 foram transfectadas com pTA-LUC (plasmídeo controle) ou pVDR-LUC que codifica a proteína luciferase sob o controle de elementos responsivos ao VDR. Após a transfecção, as células foram incubadas com os mesmos estímulos e na mesma concentração do ensaio de translocação ou apenas com veículo. As atividades da luciferase nos grupos tratados com fisalina F e vitamina D3 foram semelhantes e também superiores às do grupo tratado com veículo, fisalina D e dexametasona. Foi realizada a expressão do VDR em Escherichia coli BL21 (DE3) Rosetta utilizando o plasmídeo HS_VDR_EC1-pQE-T7, o qual codifica o VDR associado a uma cauda de 6 histidinas. Nas condições testadas, a proteína expressada encontrava-se em corpos de inclusão. Esta proteína purificada poderá ser utilizada em futuros estudos de interação entre VDR e fisalinas. Em conclusão, nossos resultados sugerem que a fisalina F interage com o VDR e que as atividades destas fisalinas podem ser atribuídas, ao menos em parte, à ativação deste receptor nuclear. / Physalins are secosteroids isolated from species of the genus Physalis endowed with several biological activities. Studies in vitro and in models of immune-mediated diseases have shown that physalin F has potent immunosuppressive activity independent of the glucocorticoid receptor. in this study we evaluated whether the action of this steroid is related to activation of the vitamin D receptor (VDR), which is a transcription factor activated by vitamin D3. Initially we evaluated the translocation of the VDR using COS-7 cells transfected with plasmid encoding a fusion protein YFP-VDR formed by VDR associated with yellow fluorescent protein. The transfected cells were treated with 100 ηM of physalins F and D, dexamethasone, and vitamin D3. We observed by fluorescence microscopy the translocation of VDR from the cytoplasm to the nucleus in cells treated with physalin F and with vitamin D3, but not with dexamethasone or physalin D. To prove the transcription factor activity of VDR under the action of physalin F, COS-7 cells were transfected with PTA-LUC (plasmid control) or pVDR-LUC that encodes the protein luciferase under de control of VDR responsive elements. After transfection, cells were incubated with vehicle or physalins F and D, dexamethasone and vitamin D3 at the same concentration of translocation test. The luciferase activity of cells treated with vitamin D3 and physalin F were similar, and higher than group treated with vehicle, dexamethasone or physalin D. The VDR expression was done in Escherichia coli BL21 (DE3) Rosetta. For this, we used the plasmid PQE-HS_VDR_EC1-T7, which encodes the VDR protein associated with a tail of 6 histidines. Under the conditions tested, the expressed protein was in inclusion bodies. This purified protein can be used in future studies of interaction between VDR and physalins. Our results suggest that physalin F interacts with the VDR and the activities of this physalin can be attributed at least in part to activation of this nuclear receptor.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / A Fisalina E (FIS E), isolada das partes aÃreas da Physalis angulata (Solanaceae), foi avaliada em modelos de dermatite de contato induzida por 12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato (TPA) e por oxazolona (OXA) em camundongos. A dermatite de contato irritativa aguda foi induzida pela administraÃÃo tÃpica de TPA (2,5μg/orelha) e avaliada apÃs 4h. A FIS E(0,125;0,25 e 0,5 mg/orelha,por via tÃpica) reduziu de forma significativa o edema de orelha induzido por TPA em 33,1; 38,7; 39%, respectivamente, e dexametasona(0,05 mg/orelha,por via tÃpica) reduziu em 95,2%. Nas mesmas doses, a FIS E assim como a Dexa, reduziram em 45,7; 52,5; 67,6 e 83,4 %, respectivamente, a atividade da mieloperoxidase (MPO) tecidual. FIS E (3, 10 e 30 mg/kg,por via oral) e Dexa (1mg/kg,por via oral) reduziram o edema de orelha em 34,8; 40,7, 47,3 e 46,6% respectivamente. Nas mesmas doses, a FIS E assim como a Dexa, reduziram em 39,3; 46,7 e 54,3 e 81,7 %, respectivamente, a atividade da mieloperoxidase (MPO) tecidual. A FIS E (0.5 mg/orelha) foi capaz de reduzir os nÃveis teciduais de TNF-α de 8,711.18 pg/ml (veÃculo) para 2,950.81 pg/ml e a dexametasona (0,05 mg/orelha) para 2,350.94 pg/ml, representando uma reduÃÃo de 66,2 e de 73 %, respectivamente. A administraÃÃo de Mifepristone (25 mg/kg,s.c), antagonista esteroidal, reverteu os efeitos da FIS E e da Dexa, por via oral e tÃpica, sobre a reduÃÃo do edema, atividade da mieloperoxidase e nÃveis de TNF-α. Na marcaÃÃo imunohistoquÃmica para TNF-α e NF-κB, a FIS E (0,5 mg/orelha) e a dexametasona (0,05 mg/orelha) reduziram a intensidade de marcaÃÃo do TNF-α e NF-κB, e o Mifepristone, reverteu esse efeito. A aÃÃo antiinflamatÃria da FIS E no modelo da dermatite aguda induzida por TPA foi confirmada pelos achados histopatolÃgicos, com a reduÃÃo do edema, infiltrado inflamatÃrio de mono e polimorfonucleares. Na dermatite crÃnica foi induzida pela aplicaÃÃo tÃpica de 20 Âl de uma soluÃÃo de TPA (2,5Âg/orelha) em dias alternados durante 10 dias, a FIS E, por via tÃpica, nas doses 0,125; 0,25 e 0,5 mg/orelha, reduziu, de forma significativa, o edema de orelha, em 19, 23 e 30,3%, respectivamente, enquanto a Dexa (0,05mg/orelha) reduziu em 32,6 %. FIS E (0,125;0,25 e 0,5 mg/orelha,por via tÃpica) e a Dexa(0,05mg/orelha) reduziram a atividade tecidual da MPO em 30; 38,8; 50,8 e 56,6%, respectivamente. A administraÃÃo oral da FIS E (3, 10 e 30 mg/kg), reduziu, de forma significativa, o edema de orelha crÃnico, em 8; 14,8; 17 %, respectivamente, e a Dexa (1 mg/kg) reduziu em 20,7 %.Nas mesmas doses, a FIS E e a Dexa reduziram a atividade da MPO em 43,1; 54,5 ;59,3 e 65 %,respectivamente. O modelo de dermatite de contato induzida por oxazolona (OXA, 1%/orelha), provocou uma hiperplasia epidÃrmica onde o INF-γ teve papel crucial. A FIS E, por via oral e tÃpica, reduziu de forma significativa, a hiperplasia epidÃrmica do 7Â ao 19Â dia de observaÃÃo. A FIS E (0.5 mg/orelha, por via tÃpica) diminuiu os nÃveis de IFN-γ em 43,5% e a Dexa (0.05 mg/orelha, via tÃpica) em 37,5%.Os resultados encontrados, comprovados pelo estudo histolÃgico, demonstram o efeito antiinflamatÃrio da Fisalina no modelo de dermatite de contato alÃrgica crÃnica. ConcluÃmos que a Fisalina E demonstrou atividade antiinflamatÃria, por via tÃpica e oral, nos modelos de dermatite de contato induzida por TPA e oxazolona em camundongos, possivelmente atravÃs da interaÃÃo com receptores de glicocorticÃides. / The physalin E (PHY E), isolated from the aerial parts of Physalis angulata (Solanaceae), was assessed in models of contact dermatitis induced by 13-acetate-12-o-tetradecanoyl-phorbol (TPA) and oxazolone (OXA) in mice. The irritant contact dermatitis was induced by acute topical administration of TPA (2,5 mg/ear) and evaluated after 4h. The PHY E topically applied to ear at 0,125;0,25 and 0,5 mg/ear and dexamethasone (Dexa), topically, a dose of 0,05 mg/ear, reduced significantly the edema ear induced by TPA in 33,1; 38,7; 39 and 95,2%, respectively. In the same doses, PHY E as well as Dexa, reduced by 45,7; 52,5; 67,6 and 83,4%, respectively, the activity of myeloperoxidase (MPO) in tissue. Oral administration of PHY E (3,10 and 30 mg/kg) and DEXA (1 mg/kg) decreased the ear edema by 34,8; 40,7;47,3 and 46,6% respectively. The same doses, PHY E as well as Dexa, reduced by 39,3; 46,7;54,3% and 81,7%, respectively, the activity of myeloperoxidase (MPO) tissue. The PHY E (0,5 mg/ear) was able to reduce the tissue levels of TNF-α of 8,711.18 pg/ml (vehicle) to 2,950.81 pg/ml and dexamethasone (0,05 mg/ear) to 2,350.94 pg/ml, showing a reduction of 66.2 and 73%, respectively.The administration of mifepristone (25 mg/kg,sc),a steroid antagonist, reversed the effects of PHY E and Dexa, orally and topically, on reducing the edema,myeloperoxidase activity and levels of TNF-α. In the immunohistochemical analysis for TNF-α and NF-κB, PHY E (0,5 mg/ear) and dexamethasone (0,05 mg/ear) reduced the intensity of marking the TNF-α and NF-κB, and mifepristone reversed this effect. The anti-inflammatory action of the PHY E in the model of the dermatitis TPA-induced were confirmed by histopathological findings, with the reduction of edema and inflammatory infiltration of mono and polymorphonuclear. The chronic dermatitis was induced by application of 20 Âl solution of TPA (2,5 mg/ear) was applied topically every other day for 10 days, PHY E topically applied (0,125, 0,25 and 0,5 mg/ear) reduced significantly the edema of the ear, 19; 23; 30,3%,and Dexa (0,05 mg/ear) decreased by 32,6%.In the same doses, PHY E and Dexa reduced tissue activity of MPO in 30; 38,8;50,8 and 56,6%, respectively. Oral administration. PHY E (3, 10 and 30 mg/kg) reduced significantly the ear edema chronic in 8, 14,8 and 17%, respectively, and Dexa (1 mg/kg) reduced in 20.7%. In the same doses,PHY E and Dexa reduced activity of MPO in 43.1, 54.5, 59.3 and 65% respectively The model of contact dermatitis induced by oxazolone (OXA, 1%/ear) caused an epidermal hyperplasia where the INF-γ played crucial role. PHY E oral and topical, has significantly reduced the epidermal hyperplasia of 7 th to 19 th day of observation Physalin E (0,5 mg/ear topically) decreased levels of IFN-γ in 43,5% and Dexa (0,05 mg/ear topically) to 37,5% when compared to vehicle. Our results, as evidenced by histological study, demonstrate the anti-inflammatory effect of physalin in the model of contact dermatitis allergic. In conclusion, the results obtained showed that PHY E presented anti-inflammatory activity either when was used by oral and topical route in the models of contact dermatitis TPA and Oxazolone-induced in mice, possible trought the interaction with glucocorticoids receptors.