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Synthetic peptides derived from decorin as building blocks for biomaterials based on supramolecular interactionsFederico, Stefania January 2011 (has links)
In this work, the development of a new molecular building block, based on synthetic peptides derived from decorin, is presented. These peptides represent a promising basis for the design of polymer-based biomaterials that mimic the ECM on a molecular level and exploit specific biological recognition for technical applications.
Multiple sequence alignments of the internal repeats of decorin that formed the inner and outer surface of the arch-shaped protein were used to develop consensus sequences. These sequences contained conserved sequence motifs that are likely to be related to structural and functional features of the protein. Peptides representative for the consensus sequences were synthesized by microwave-assisted solid phase peptide synthesis and purified by RP-HPLC, with purities higher than 95 mol%. After confirming the desired masses by MALDI-TOF-MS, the primary structure of each peptide was investigated by 1H and 2D NMR, from which a full assignment of the chemical shifts was obtained. The characterization of the peptides conformation in solution was performed by CD spectroscopy, which demonstrated that using TFE, the peptides from the outer surface of decorin show a high propensity to fold into helical structures as observed in the original protein. To the contrary, the peptides from the inner surface did not show propensity to form stable secondary structure. The investigation of the binding capability of the peptides to Collagen I was performed by surface plasmon resonance analyses, from which all but one of the peptides representing the inner surface of decorin showed binding affinity to collagen with values of dissociation constant between 2•10-7 M and 2.3•10-4 M. On the other hand, the peptides representative for the outer surface of decorin did not show any significant interaction to collagen.
This information was then used to develop experimental demonstration for the binding capabilities of the peptides from the inner surface of decorin to collagen even when used in more complicated situations close to possible appications. With this purpose, the peptide (LRELHLNNN) which showed the highest binding affinity to collagen (2•10-7 M) was functionalized with an N-terminal triple bond in order to obtain a peptide dimer via copper(I)-catalyzed cycloaddition reaction with 4,4'-diazidostilbene-2,2'-disulfonic acid. Rheological measurements showed that the presence of the peptide dimer was able to enhance the elastic modulus (G') of a collagen gel from ~ 600 Pa (collagen alone) to ~ 2700 Pa (collagen and peptide dimer). Moreover, it was shown that the mechanical properties of a collagen gel can be tailored by using different molar ratios of peptide dimer respect to collagen.
The same peptide, functionalized with the triple bond, was used to obtain a peptide-dye conjugate by coupling it with N-(5'-azidopentanoyl)-5-aminofluorescein. An aqueous solution (5 vol% methanol) of the peptide dye conjugate was injected into a collagen and a hyaluronic acid (HA) gel and images of fluorescence detection showed that the diffusion of the peptide was slower in the collagen gel compared to the HA gel.
The third experimental demonstration was gained using the peptide (LSELRLHNN) which showed the lower binding affinity (2.3•10-4 M) to collagen. This peptide was grafted to hyaluronic acid via EDC-chemistry, with a degree of functionalization of 7 ± 2 mol% as calculated by 1H-NMR. The grafting was further confirmed by FTIR and TGA measurements, which showed that the onset of decomposition for the HA-g-peptide decreased by 10 °C compared to the native HA. Rheological measurements showed that the elastic modulus of a system based on collagen and HA-g-peptide increased by almost two order of magnitude (G' = 200 Pa) compared to a system based on collagen and HA (G' = 0.9 Pa).
Overall, this study showed that the synthetic peptides, which were identified from decorin, can be applied as potential building blocks for biomimetic materials that function via biological recognition. / In dieser Arbeit wird das Design, die Synthese und Analyse neuer molekularer Bausteine für Biomaterialien basierend auf synthetischen, von Decorin abgeleiteten Peptiden beschrieben. Diese Peptide sind deshalb als Baustein für polymer-basierte Biomaterialien von besonderem Interesse, da sie die extrazelluläre Matrix (ECM) auf molekularer Ebene nachempfinden und spezifische, biologische wichtige Interaktionen für technische Anwendungen nutzbar machen.
Das Alignment multipler Sequenzen der internen Repeats von Decorin, die jeweils die innere bzw. äußere Seite des sichelförmigen Decorins bilden, wurde genutzt, um Konsensus-Sequenzen zu definieren. Diese Sequenzen beinhalten stark konservierte Sequenzmotive, die wahrscheinlich wichtig für Struktur und Funktion des Proteins sind. Ausgewählte Peptide, die repräsentativ für die Konsensus-Sequenzen sind, wurden dann mittels Mikrowellen unterstützter Festphasensynthese synthetisiert und mit RP-HPLC aufgereinigt, so dass Peptide mit Reinheiten ≥ 95 mol% erhalten wurden. Die Peptide wurden per MALDI-TOF-MS sowie 1D und 2D NMR Spektroskopie charakterisiert, wobei die Zuordnung der chemischen Verschiebungen zu einzelnen Protonen und Kohlenstoffen aus den 2D NMR Experimenten erfolgte. In Lösung wurden die Peptide zudem mit CD Spektroskopie untersucht, wobei gezeigt werden konnte, dass nur Peptide, die von der äußeren Seite des Decorins abgeleitet wurden, sich durch Zugabe von 2,2,2-Trifluorethanol zu α-Helices falten. Diese Faltung ist auch in der Röntgenstruktur bei den korrespondierenden Abschnitten zu finden. Im Gegensatz dazu zeigten Peptide, die von der inneren Seite des Decorins abgeleitet wurden, keine stabilen Sekundärstrukturen in Lösung (β-Faltblattstruktur in der Röntgenstruktur). Bindungsstudien der Peptide zu Kollagen I wurden mit Oberflächenplasmonenresonanz durchgeführt, wobei gezeigt werden konnte, dass alle bis auf ein Peptid, die von der innneren Seite abgeleitet wurden, an Kollagen mit Dissoziationskonstanten von 2•10-7 M bis 2.3•10-4 M binden, während Peptide, die für die äußere Seite von Decorin repräsentativ sind, keine Bindung an Kollagen I zeigten.
Diese Information wurde genutzt, um experimentelle Demonstrationsobjekte dieser Interaktion in komplexeren, einer späteren Anwendung näheren Situation, zu entwickeln. Dazu wurde das Peptide LRELHLNNN, welches die stärkste Bindung zu Kollagen I zeigte (KD = 2•10-7 M), N-terminal mit einer Alkinbindung funktionalisiert, so dass durch Kupfer (I) katalysierte Reaktion mit 4,4'-Diazidostilben-2,2'-disulfonsäure ein Peptid-Dimer erhalten werden konnte. Rheologische Untersuchungen zeigten, dass durch Zugabe des Peptid-Dimers der Elastizitätsmodul G' von Kollagen-Gelen von ~ 600 Pa (nur Kollagen) auf ~ 2700 Pa (Kollagen und Peptide-Dimer) gesteigert werden konnte. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die Veränderung der mechanischen Eigenschaften der Gele durch Veränderung des Kollagen:Peptid-Dimer Verhältnisses angepasst werden konnten.
Das gleiche, mit einer Alkin-Bindung funktionaliserte Peptid wurde dann zur Darstellung eines Peptid-Fluorescein Konjugats genutzt, indem es mit N-(5'-azidopentanoyl)-5-aminofluorescein umgesetzt wurde. Eine wässrige Lösung des Peptid-Farbstoff-Konjugats wurde dann in Kollagen- bzw. Hyaluronsäuregele injiziert. Die Diffusion des Peptid-Farbstoff-Konjugats war in Kollagengelen im Vergleich zu Hyaluronsäuregelen deutlich verlangsamt.
Das dritte Demonstrationsobjekt wurde erhalten, indem das Peptid LSELRLHNN, welches die geringste Bindung an Kollagen zeigte (KD = 2.3•10-4 M), auf Hyaluronsäure (HA) gegrafted wurde. Die Reaktion wurde durch Carbodiimid-mediierte Kupplung erreicht, und ein Funktionalisierungsgrad von 7 ± 2 mol% wurde durch Integration der 1H-NMR Spektren bestimmt. Das erfolgreiche Grafting wurde durch FTIR- und TGA-Untersuchungen bestätigt. In letzteren wurde gezeigt, dass der thermische Abbau durch das Grafting bei etwas niedrigeren Temperaturen beginnt als der Abbau reiner Hyaluronsäure (ΔT = 10 °C). Rheologische Untersuchungen zeigten, dass ein System aus Kollagen und HA-g-Peptid ein um zwei Größenordnungen höheren Elastizitätsmodul G' hat (G' = 200 Pa) als Systeme, die aus einer physikalischen Mischung von Kollagen und HA bestehen (G' = 0.9 Pa).
Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass die Peptide, die von Decorin abgeleitet wurden, als Kollagen-bindende Bausteine für biomimetische Materialien genutzt werden können.
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Filmes sólidos de PVA eluidores de GSNO para aplicações tópicas e para o revestimento de stents / GSNO-eluting PVA solid films for topical application and for stents coatingSimões, Maira Martins de Souza Godoy 19 August 2018 (has links)
Orientador: Marcelo Ganzarolli de Oliveira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-19T16:07:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1
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Previous issue date: 2011 / Resumo: O Poli(álcool vinílico) (PVA) é polímero biocompatível que pode ser usado como matriz para a incorporação de S-nitrosoglutationa (GSNO), que é uma molécula endógena que exerce todas as funções bioquímicas do óxido nítrico (NO). Os principais objetivos deste trabalho foram a obtenção de filmes sólidos de PVA capazes de eluir GSNO localmente, que pudessem ser utilizados para aplicações tópicas e para o recobrimento de stents. Os filmes de PVA foram reticulados fisicamente através de ciclos de congelamento/descongelamento (C/D). Verificou-se que a aplicação de 1 a 5 ciclos C/D leva a um aumento da cristalinidade dos filmes comparada aos filmes não submetidos a C/D. Este efeito está associado ao aumento do raio de giro de estruturas espalhadoras de raios X e com a redução do coeficiente de difusão da GSNO. A liberação tópica de GSNO a partir de filmes de PVA na pele de voluntários levou a um aumento significativo do fluxo sanguíneo dérmico, medido por fluxometria com laser Doppler. Demonstrou-se que a aplicação de ciclos C/D pode ser usada para controlar a velocidade e a intensidade de aumento de fluxo sanguíneo. Filmes de PVA/GSNO aplicados como revestimentos de poços de placas de cultura de células mostraram atividade bactericida dose e tempo-dependentes contra cepas de S. aureus e P. aeruginosa, sendo capazes de esterilizar completamente estas duas bactérias multi-resistentes após 6 h de incubação. Filmes de PVA/GSNO permitiram a obtenção de revestimentos aderentes sobre a superfície de stents intracoronários de aço inox levando a uma redução significativa da adesão plaquetária após incubação com sangue total. Estes resultados permitem propor o uso de filmes de PVA/GSNO fisicamente reticulados para aplicações tópicas no tratamento de lesões infectadas, para promover a vasodilatação de tecidos isquêmicos e para a melhoria das propriedades hemocompatíveis de dispositivos de contato sanguíneo / Abstract: Poly(vinyl alcohol) (PVA) is a biocompatible polymer that can be used as a matrix for incorporation of S-nitrosoglutathione (GSNO), an endogenous molecule that exerts all the biochemical functions of nitric oxide (NO). The main objectives of this work were to obtain solid PVA films capable of releasing GSNO locally, which could be used in topical applications and for the coating for stents. PVA films were physically crosslinked through freezing-thawing cycles (F/T).It was observed that films subjected to 1 to 5 cycles shows higher crystallinity than films not subjected to F/T. This effect is associated with an increase in the gyration radius of the X-ray scattering structures an with a decrease in the GSNO diffusion coefficient. Topical GSNO release from PVA films on the skin of volunteers led to a significant increase of dermal blood flow, measured by laser Doppler flowmetry. It was shown that F/T cycles can be used to control the rate and intensity of blood flow increase. PVA/GSNO films applied as coatings of cell-culture plate wells showed dose and time-dependent bactericidal activities against S. aureus and P. aeruginosa, being able of completely sterilizing these mult-resistant bacteria after 6 h of incubation. PVA/GSNO films allowed the formation of adherent coatings on the surface of intracoronary stainless steel stents, and lead to a significant reduction of platelet adhesion after incubation with whole blood. These results allow suggesting the use of physically crosslinked PVA/GSNO films in topical applications for the treatment of infected lesions, for promoting the vasodilation of ischemic tissues and for improving the hemocompatible properties of blood contact devices / Doutorado / Físico-Química / Doutor em Ciências
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A Novel Approach to Cellulose Hydrogels Physically Crosslinked by GlycinePalantöken, Sinem 14 February 2022 (has links)
Diese Arbeit liefert Informationen über die neuartige Synthese von physikalischen durch Glycin vernetzten Cellulosehydrogelen. Ihre Herstellung, Morphologie, Wasseraufnahmevermögen, mechanische und thermische Eigenschaften, Wiederverwendbarkeit und Stabilität werden detailliert beschrieben. Die Arbeit präsentiert eine umfassende Studie über die Herstellung, Charakterisierung, Morphologie und thermischen Eigenschaften von Hydrogelen und validiert die Verwendung von Cellulose-Glycin-Hydrogelen für Anwendungen mit abgeschiedenen Goldnanopartikeln. / This thesis provides information about the novel synthesis of cellulose hydrogels physically crosslinked by glycine; their fabrication, morphology, water absorption capacity, mechanical properties, thermal properties, reusability, stability and gold nanoparticle deposition. The work validates also the use of cellulose–glycine hydrogels for gold nanoparticle deposition applications and presents a comprehensive study of gold nanoparticle deposited hydrogels about their fabrication, characterization, morphology and thermal properties.
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Syntéza a charakterizace multifunkcionalizovaných biodegradabilních kopolymerů / Synthesis and Characterization of Multifunctionalized Biodegradable CopolymersMichlovská, Lenka January 2014 (has links)
Předložená disertační práce shrnuje současné poznatky v oblasti termosenzitivních biodegradabilních kopolymerů, které ve formě vodného solu gelují při teplotě lidského těla. Tyto polymerní materiály jsou použitelné v medicíně pro injekční aplikace jako nosiče léčiv či resorbovatelné implantáty pro regeneraci tkání. V experimentální práci byly pomocí vakuové linky syntetizovány termosenzitivní amfifilní triblokové kopolymery na bázi biodegradabilního hydrofobního polylaktidu a polyglykolidu a biokompatibilního hydrofilního polyethylenglykolu (PLGA–PEG–PLGA). Připravený PLGA–PEG–PLGA kopolymer se dvěma fázovými přechody sol-gel a gel-suspenze byl následně modifikován anhydridem kyseliny itakonové. Výsledný funkcionalizovaný ITA/PLGA–PEG–PLGA/ITA kopolymer obsahuje na koncích řetězců reaktivní dvojné vazby vhodné k další polymeraci či síťování a karboxylové skupiny pro případné modifikace biologicky aktivními látkami. Fyzikální i chemické síťování bylo dále sledováno jak z hlediska poměrů hydrofilního a hydrofobního řetězce, tak i z hlediska množství navázané kyseliny itakonové. Vodné roztoky syntetizovaného ITA/PLGA–PEG–PLGA/ITA kopolymeru gelují v rozmezí teplot 33 - 43 °C. Kritická gelační koncentrace byla 6 % a kritická gelační teplota 34 °C pro kopolymer s poměrem PLGA/PEG = 2,5. Čím je kopolymer více hydrofobní, tím geluje dříve a je více hydrolyticky stabilní. Tuhost gelu stoupá se zvyšujícím se poměrem PLGA/PEG a je závislá na typu rozpouštědla použitého při přečišťování kopolymeru. Připravené ITA/PLGA–PEG–PLGA/ITA makomonomerů byly síťovány pomocí modrého světla bez dalšího síťovadla. Hydrolytická stabilita vzorků modifikovaných pomocí ITA se výrazně zlepšila a zvýšila v přímé úměře jak s rostoucí dobou síťování, tak s množstvím dvojných vazeb na koncích řetězců. Vzorek s 63 mol% ITA síťovaný 40 minut ve vodě zcela zdegradoval po 32 dnech. Protonovou NMR relaxometrií bylo zjištěno, že když vzorek ve vodě nabotnal (po cca 12 hodinách), množství nevázané vody se začalo snižovat a postupně difundovat do kavit na povrchu vzorku a pomalu se měnit na slabě a pevně vázanou vodu na polymerní řetězce. Nicméně, termální stabilita chemicky síťovaných vzorků vzrůstala pouze do 20 minut síťování. Pomocí ATR-FTIR bylo prokázáno, že se přibližně 57 % dvojných vazeb kyseliny itakonové (při vlnové délce 1640 cm-1) přeměnilo na nové jednoduché RR'C-CHR'' vazby při vlnové délce 795 cm-1. Delší čas síťování (nad 30 minut) vedl ke změnám v chemické struktuře pomocí beta-štěpení řetězců a částečné rekombinaci dvojných vazeb. Díky vzniku nových dvojných vazeb v jiných částech řetězce se snížila termální stabilita z 242 °C na 237° C a teplota skelného přechodu z -2,2 na -5.8 °C. Předložená práce popisuje, jak složení polymeru, modifikace funkčními skupinami a fyzikální podmínky ovlivňují fyzikální a chemické síťování připravených amfifilních kopolymerů. Kontrola hydrolytické a termální stability hydrogelů je zapotřebí zejména při uvolňování léčiv a regeneraci tkání.
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