La métabolomique a pour objet l’identification et la quantification de métabolites dans un échantillon biologique. Cette discipline s’inscrit dans une approche du vivant connue sous le terme de « biologie des systèmes ». La spectroscopie par résonance magnétique nucléaire haute résolution à l’angle magique (RMN HRMAS) est une méthode de choix pour l’obtention de ce type de profilage métabolique. L’épilepsie du lobe temporal (ELT) est une épilepsie focale fréquente associée le plus souvent à des pertes neuronales sélectives, une gliose réactionnelle et une plasticité cellulaire spécifique. Bien que restant débattue, une origine neurométabolique reste un axe de recherche majeur. A ce jour une caractérisation métabolomique des tissus épileptogènes par RMN HRMAS reste à effectuer. Notre travail a consisté dans un premier temps à caractériser, chez le rat, les effets des méthodes de prélèvement et de fixation sur le métabolome cérébral dans le cadre des acquisitions RMN HRMAS. Dans un second temps, nous avons travaillé sur le modèle animal lithium-pilocarpine d’ELT. Nous avons pu décrire le métabolome issu des données RMN 1H HRMAS de différentes structures cérébrales impliquéesdans l’épileptogénèse. Des analyses multivariées de type PLS-DA ont pu mettre en évidence des profils métaboliques pathologiques au sein du cortex entorhinal et de l’hippocampe. A l’aide de substrats marqués au carbone 13 ([1-13C]glucose et de [1,2-13C]acétate) nous avons étudié les voies métaboliques neuronales et gliales. Nos résultats suggèrent l’absence d’anomalies métaboliques au sein des astrocytes. Enfin dans un dernier temps, nous avons effectué des analyses RMN 1H HRMAS sur près de 200 échantillons cérébraux de patients atteints d’ELT. Une analyse multivariée a permis de distinguer les profils métaboliques des hippocampes sclérosés et non sclérosés. En revanche la construction de modèles sur la base d’hypothèses clinico métaboliques (durée de la maladie, fréquence de crises, antécédents de convulsions fébriles) n’a pas permis d’identifier de profils métaboliques spécifiques. L’ensemble de ces données suggère l’existence de profils métabolomiques distincts en fonction des caractéristiques neuropathologiques des patients atteints d’ELT. Notre travail confirme la nécessité d’une approche intégrée de type « biologie des systèmes » pour l’étude de l’ELT aussi bien chez l’homme que dans des modèles animaux. / Metabolomics relates to the identification and quantification of metabolites in biological samples. This discipline is part of an approach known under the term of "systems biology". High Resolution Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy at Magic Angle Spinning (HRMAS NMR) is a method for obtaining metabolic profiling in such sample. Temporal Lobe Epilepsy (TLE ) is a common focal epilepsy often associated with selective neuronal loss, reactive gliosis and specific cellular plasticity. A neurometabolic origin of this epilepsy is a major area of research. To date no characterization of human cerebral biopsy from TLE patients has been conducted using HRMAS NMR. In the present work we aimed first at characterizing, in rats, the effects of sampling methods and fixation on brain metabolome under HRMAS NMR acquisitions. In a second step, we studied the lithium-pilocarpine model of TLE. In this model, we could describe the metabolome from HRMAS 1H NMR data of different brain structures involved in epileptogenesis. Multivariate analysis could highlight pathological metabolic profiles in the entorhinal cortex and hippocampus. Using substrates labeled with carbon 13 ( [1 -13C ]-glucose and [1,2-13C ]-acetate) we studied neuronal and glial metabolic pathways. Our results suggest the absence of metabolic abnormalities in astrocytes metabolism as previously reported. Finally, we conducted HRMAS 1H NMR analysis in nearly 200 brain samples from TLEpatients. Multivariate analysis was able to distinguish metabolic profiles between sclerotic and non sclerotic hippocampi. However mutlivariate models based on clinico- metabolic assumptions (disease duration, frequency of seizures, history of febrile seizures ) did not identify specific metabolic profile. All these data suggest the existence of distinct metabolomic profile based on neuropathological features of patients with TLE. Our work confirm the need of an integrated approach such as " systems biology" for the study of TLE in humans as long as in animal models.

O núcleo talâmico mediodorsal (Tmd) e o córtex pré-frontal (CPF) comunicam-se mutuamente, formando um circuito envolvido em funções executivas e transtornos psiquiátricos. As funções executivas estão sujeitas aos níveis de alerta gerados pela atividade oscilatória talamocortical, que por sua vez é controlada pela transmissão colinérgica. Possivelmente, a plasticidade sináptica do circuito Tmd-CPF é sensível tanto aos padrões oscilatórios do próprio circuito quanto à modulação colinérgica. Porém, esta possibilidade ainda não foi testada, muito menos dissociando-se a participação dos receptores muscarínicos e nicotínicos. Assim, nosso objetivo foi examinar como a plasticidade Tmd-CPF é modulada sob estados oscilatórios globais mediados pelo sistema colinérgico, e se esta modulação varia com os tipos de receptores recrutados. Anestesiamos ratos com uretana e implantamos um eletrodo de estimulação no Tmd, um eletrodo de registro no CPF e uma cânula de microinjeção acima do ventrículo. Emitimos 90 pulsos elétricos no Tmd (0,05 Hz) para evocação de potenciais pós-sinápticos de campo (PPSCs) basais no CPF por 30 min. Em seguida, aplicamos injeção intraventricular do agonista muscarínico pilocarpina (PILO), do agonista nicotínico nicotina (NIC), ou veículo-controle (VEIC). Os efeitos das substâncias sobre potenciais de campo locais (eletrencefalograma) foram monitorados através dos mesmos eletrodos. PILO e NIC induziram aumento das oscilações rápidas (4-80 Hz) e proporcional redução das oscilações lentas mantidas pela anestesia (0,5-4 Hz) e tais efeitos duraram ~10-15 min, conforme padronização prévia das concentrações das drogas. Justamente durante este período, aplicamos estimulação em alta frequência (EAF) ou baixa frequência (EBF) para indução de, respectivamente, potencialização (PLD) ou depressão (DLD) de longa duração, que são modelos bem conhecidos de plasticidade sináptica. Em grupos-controle, a injeção de PILO, NIC ou VEIC foi desacompanhada de EAF/EBF. Por fim, retomamos a coleta de PPSCs a 0,05 Hz por 240 min. Os resultados mostraram que a EAF não afetou os PPSCs quando aplicada após VEIC. Porém, nos ratos PILO e NIC, os PPSCs tiveram amplitude aumentada a partir de 150 min após EAF, indicando que a pré-ativação colinérgica foi necessária à indução de uma PLD tardia. Inversamente, quando a EBF foi aplicada após VEIC, a amplitude dos PPSCs foi reduzida de modo estável por 240 min. Isto não ocorreu quando a EBF foi aplicada após PILO e NIC, sugerindo que a modulação colinérgica suprimiu a DLD. Nos grupos-controle, PILO, NIC e VEIC sozinhos não afetaram os PPSCs em longo prazo, confirmando que os resultados de PLD e DLD são devidos a uma interação entre a pré-ativação colinérgica e mecanismos sinápticos desencadeados pela EAF/EBF.Portanto,as oscilações rápidas induzidas pela transmissão colinérgica favorecem a PLD no circuito Tmd-CPF, enquanto dificultam sua DLD. Além disto, os efeitos muscarínicos e nicotínicos sobre a plasticidade de longo prazo são iguais, apesar de os mecanismos celulares destes receptores serem diferentes. Nossos achados ajudam a esclarecer a regulação do sinal talâmico no CPF sob modulação colinérgica fisiológica (atenção e sono paradoxal) e disfuncional (esquizofrenias e doença de Alzheimer). / The mediodorsal thalamic nucleus (MD) and the prefrontal cortex (PFC) communicate with each other, constituting a circuit involved in executive functions and psychiatric disorders. Executive functions are subject to arousal levels driven& by the thalamocortical oscillatory activity, which in turn is controlled by the cholinergic neurotransmission. Possibly, the MD-PFC synaptic plasticity is susceptible to both the oscillatory patterns within the MD-PFC circuit and the cholinergic modulation. However, this likelihood is still untested, as well as the specific roles of muscarinic and nicotinic receptors. Thus, our aim was to evaluate whether and how the MD-PFC plasticity is modulated under cholinergic system-dependent oscillatory states of the forebrain, and if such modulation varies with the subtypes of activated cholinergic receptors. For that, we anesthetized rats with urethane to implant a stimulating electrode into the MD, a recording electrode into the PFC, and a microinjection cannula above the ventricle. We applied 90 monophasic square pulses into the MD (0.05 Hz) for recording of basal field postsynaptic potentials (fPSPs) in the PFC for 30 min. Then, we did an intraventricular injection of either the muscarinic agonist pilocarpine (PILO), the nicotinic agonist nicotine (NIC), or a control vehicle (Veh). The drug effects on local field potentials (electroencephalogram) were monitored through the same electrodes. PILO and NIC induced an increase in theta, beta and gamma oscillations (4-80 Hz) with proportional reduction of urethane-driven delta waves (0.5-4 Hz), and these effects survived approximately 10-15 min according to pilot-experiments on PILO and NIC concentrations. During this period, we applied either high-frequency (HFS) or low-frequency stimulation (LFS) for induction of respectively long-term potentiation (LTP) or depression (LTD), which are well-known synaptic plasticity models. In control groups, the injection of PILO, NIC or Veh was not followed by the HFS/LFS. Lastly, we resumed the evoking of fPSP at 0.05 Hz for an additional 240 min. The results showed that the HFS did not affect the fPSPs when applied after the Veh. However, in PILO and NIC rats the fPSP had their amplitudes increased from 150 min after HFS, indicating that the cholinergic pre-activation was required for the induction of a late-phase LTP. On the other hand, when the LFS was applied after the Veh, the fPSP amplitudes were stably decreased for 240 min, which did not occur when the LFS was applied after PILO and NIC, suggesting that the cholinergic modulation suppressed the LTD. In the control groups, PILO, NIC, and Veh by themselves did not change fPSPs in the long term, reinforcing that the LTP and LTD were due to an interaction between the cholinergic pre-activation and synaptic mechanisms triggered by the HFS/LFS. Therefore, the rapid oscillations induced by the cholinergic transmission favor LTP in the MD-PFC loop, while occlude its LTD. Moreover, the muscarinic and nicotinic effects on long-term plasticity were equal, although their quite distinct cell mechanisms. Our findings might help clarify the regulation of thalamic signals on the PFC both under physiological (attention and rapid-eye-movement sleep) and dysfunctional (schizophrenia symptoms and Alzheimer\'s) cholinergic drive.

Made available in DSpace on 2016-01-26T18:55:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DANIELLE_ANTONELLI_DISSERTACAO_29_02_2012.pdf: 1089336 bytes, checksum: 8928daa398867b4ca23818551957243d (MD5) Previous issue date: 2011-12-13 / The objective of this study was to evaluate the effectiveness of two protocols of treatment of keratoconjunctivitis sicca (CCS) experimentally induced in rabbits, a topical ophthalmic formulation consisting of 1.4% alcohol povinílico, added with acetylcysteine 10% and 1% pilocarpine (AAP) and another protocol with the use of flaxseed oil (OL) topic in the form of eye drops. A total of 15 white rabbits, male New Zeland. These animals were divided into three groups with five animals each: Group C (control), healthy animals; Group AAP (formula for topical ophthalmic) and Group L (flaxseed oil topically). The rabbits were evaluated weekly by the Schirmer test Lacrimal (TLS), Rose Bengal test (TRB) and Fluorescein test (TF). Monthly tests were performed cytology (EC) and the end of the experiment was carried out euthanasia of animals for histopathological examination of the eyes. There was significant clinical improvement in the parameters analyzed (TLS, TRB and TF) in both groups (AAP, L). However, the AAP group, showed a better effect on the production of tears from the moment 2 (M2), when compared to L. Both groups had values higher than in Group C, and remained superior to the M12. The group L, showed a better effect for the presence of corneal ulcers, which remained negative at all times, while the AAP group was positive from the M3 to M9. Regarding the presence of devitalized cells, the group L showed a better performance, and 100% of their animals from the negative to the M7, while the AAP group animals showed negative for devitalized cells from the M10. In cytology was not observed significant differences between groups. In histopathology of the cornea and conjunctiva, there was edema and degeneration in both groups, but necrosis was observed only in the conjunctiva in the group L. There was a significant increase in goblet cells, especially in the AAP group. Considering the results analyzed, both the formula ophthalmic and flaxseed oil are effective in the treatment of CCS, however, the ophthalmic formulation is more effective to increase the tear, while linseed oil was more effective in resolving ulcers corneal cells and devitalized. / O objetivo deste estudo foi avaliar a eficácia de dois protocolos de tratamento da ceratoconjuntivite seca (CCS) experimentalmente induzida em coelhos, uma formulação oftálmica tópica composta por álcool povinílico 1,4%, adicionado com acetilcisteína 10% e pilocarpina 1% (AAP), e outro protocolo com o uso do óleo de semente de linhaça (OL) tópico em forma de colírio. Foram utilizados 15 coelhos brancos, machos da raça Nova Zelândia. Esses animais foram divididos em 3 grupos com 5 animais cada: Grupo C (controle), animais sadios; Grupo AAP (fórmula oftálmica por via tópica) e Grupo L (óleo de linhaça por via tópica). Os coelhos foram avaliados semanalmente pelo Teste Lacrimal de Schirmer (TLS), Teste de Rosa Bengala (TRB) e Teste de Fluoresceína (TF). Mensalmente foram realizados testes de citologia esfoliativa (CE) e ao final do experimento foi realizado eutanásia dos animais para obtenção do exame histopatológico dos olhos. Houve melhora clínica significativa nos parâmetros analisados (TLS, TRB e TF) em ambos os grupo (AAP e L). Porém, o grupo AAP, apresentou um melhor efeito em relação à produção de lágrima a partir do momento 2 (M2), quando comparado ao grupo L. Ambos os grupos apresentaram valores superiores ao grupo C, e permaneceram superiores até o M12. Já o grupo L, apresentou um melhor efeito em relação à presença de úlceras de córnea, onde permaneceu negativo em todos os momentos, enquanto que o grupo AAP apresentou-se positivo desde o M3 até o M9. Em relação à presença de células desvitalizadas, o grupo L apresentou um melhor desempenho, tendo 100% de seus animais negativos à partir do M7, enquanto que o grupo AAP apresentou animais negativos para células desvitalizadas à partir do M10. Na citologia esfoliativa não foi observado diferenças importantes entre os grupos. No histopatológico da córnea e conjuntiva, houve presença de edema e degeneração em ambos os grupos, porém necrose foi observado apenas na conjuntiva no grupo L. Houve um aumento significativo das células caliciformes, principalmente no grupo AAP. Diante dos resultados analisados, tanto a fórmula oftálmica quanto o óleo de linhaça são eficientes no tratamento da CCS, porém, a fórmula oftálmica é mais eficaz para o incremento da lágrima, enquanto que o óleo de linhaça mostrou-se mais efetivo na resolução das úlceras de córnea e células desvitalizadas

Made available in DSpace on 2016-07-18T17:53:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DANIELLE_ANTONELLI_DISSERTACAO_29_02_2012.pdf: 1089336 bytes, checksum: 8928daa398867b4ca23818551957243d (MD5) Previous issue date: 2011-12-13 / The objective of this study was to evaluate the effectiveness of two protocols of treatment of keratoconjunctivitis sicca (CCS) experimentally induced in rabbits, a topical ophthalmic formulation consisting of 1.4% alcohol povinílico, added with acetylcysteine 10% and 1% pilocarpine (AAP) and another protocol with the use of flaxseed oil (OL) topic in the form of eye drops. A total of 15 white rabbits, male New Zeland. These animals were divided into three groups with five animals each: Group C (control), healthy animals; Group AAP (formula for topical ophthalmic) and Group L (flaxseed oil topically). The rabbits were evaluated weekly by the Schirmer test Lacrimal (TLS), Rose Bengal test (TRB) and Fluorescein test (TF). Monthly tests were performed cytology (EC) and the end of the experiment was carried out euthanasia of animals for histopathological examination of the eyes. There was significant clinical improvement in the parameters analyzed (TLS, TRB and TF) in both groups (AAP, L). However, the AAP group, showed a better effect on the production of tears from the moment 2 (M2), when compared to L. Both groups had values higher than in Group C, and remained superior to the M12. The group L, showed a better effect for the presence of corneal ulcers, which remained negative at all times, while the AAP group was positive from the M3 to M9. Regarding the presence of devitalized cells, the group L showed a better performance, and 100% of their animals from the negative to the M7, while the AAP group animals showed negative for devitalized cells from the M10. In cytology was not observed significant differences between groups. In histopathology of the cornea and conjunctiva, there was edema and degeneration in both groups, but necrosis was observed only in the conjunctiva in the group L. There was a significant increase in goblet cells, especially in the AAP group. Considering the results analyzed, both the formula ophthalmic and flaxseed oil are effective in the treatment of CCS, however, the ophthalmic formulation is more effective to increase the tear, while linseed oil was more effective in resolving ulcers corneal cells and devitalized. / O objetivo deste estudo foi avaliar a eficácia de dois protocolos de tratamento da ceratoconjuntivite seca (CCS) experimentalmente induzida em coelhos, uma formulação oftálmica tópica composta por álcool povinílico 1,4%, adicionado com acetilcisteína 10% e pilocarpina 1% (AAP), e outro protocolo com o uso do óleo de semente de linhaça (OL) tópico em forma de colírio. Foram utilizados 15 coelhos brancos, machos da raça Nova Zelândia. Esses animais foram divididos em 3 grupos com 5 animais cada: Grupo C (controle), animais sadios; Grupo AAP (fórmula oftálmica por via tópica) e Grupo L (óleo de linhaça por via tópica). Os coelhos foram avaliados semanalmente pelo Teste Lacrimal de Schirmer (TLS), Teste de Rosa Bengala (TRB) e Teste de Fluoresceína (TF). Mensalmente foram realizados testes de citologia esfoliativa (CE) e ao final do experimento foi realizado eutanásia dos animais para obtenção do exame histopatológico dos olhos. Houve melhora clínica significativa nos parâmetros analisados (TLS, TRB e TF) em ambos os grupo (AAP e L). Porém, o grupo AAP, apresentou um melhor efeito em relação à produção de lágrima a partir do momento 2 (M2), quando comparado ao grupo L. Ambos os grupos apresentaram valores superiores ao grupo C, e permaneceram superiores até o M12. Já o grupo L, apresentou um melhor efeito em relação à presença de úlceras de córnea, onde permaneceu negativo em todos os momentos, enquanto que o grupo AAP apresentou-se positivo desde o M3 até o M9. Em relação à presença de células desvitalizadas, o grupo L apresentou um melhor desempenho, tendo 100% de seus animais negativos à partir do M7, enquanto que o grupo AAP apresentou animais negativos para células desvitalizadas à partir do M10. Na citologia esfoliativa não foi observado diferenças importantes entre os grupos. No histopatológico da córnea e conjuntiva, houve presença de edema e degeneração em ambos os grupos, porém necrose foi observado apenas na conjuntiva no grupo L. Houve um aumento significativo das células caliciformes, principalmente no grupo AAP. Diante dos resultados analisados, tanto a fórmula oftálmica quanto o óleo de linhaça são eficientes no tratamento da CCS, porém, a fórmula oftálmica é mais eficaz para o incremento da lágrima, enquanto que o óleo de linhaça mostrou-se mais efetivo na resolução das úlceras de córnea e células desvitalizadas