Pilocarpus pennatifolius Lemmaire (Rutaceae) é uma espécie nativa que ocorre nas regiões Sul, Sudeste, Centro-Oeste e Nordeste do Brasil, e é popularmente conhecida por jaborandi. Essa e outras espécies de Pilocarpus encontram-se em risco de extinção devido ao extrativismo (uso como planta medicinal) e ao desmatamento. O cultivo in vitro de P. pennatifolius foi realizado como uma alternativa para a produção de pilocarpina (princípio ativo do jaborandi). A cultura de células foi obtida em meio MS semi-sólido, suplementado com sacarose, como fonte de carbono, e tendo como reguladores de crescimento BAP, IAA e NAA. O tempo de duplicação da cultura de calos foi de 22 dias. A concentração do alcalóide, determinada por técnicas cromatográficas, foi de aproximadamente 0,1 µg/ mg de biomassa. Os ensaios enzimáticos referentes à biossíntese da pilocarpina tiveram como objetivo elucidar a etapa inicial de formação do anel imidazólico, além da localização desta reação na planta. Os experimentos realizados indicaram a presença da enzima histidina amino-transferase (HAT, EC 2.6.1.38) cuja atividade catalítica foi de 46,09 nKat/ mg de proteína, apenas no extrato protéico das raízes de P. pennatifolius. A determinação da composição do óleo essencial por CG e CG/EM indicou como constituintes majoritários os hidrocarbonetos tridecano (56,8 %) e pentadecano (25,5 %). Os sesquiterpenos não oxigenados constituíram cerca de 15 % do óleo obtido. / Pilocarpus pennatifolius Lemmaire (Rutaceae) is a native Brazilian species which is commonly known as jaborandi. This species is endangered due to its exploitation as medicinal plant and the increasingly deforestation. A callus culture of P. pennatifolius was established as an alternative source for pilocarpine production (the active compound of jaborandi). The cell culture was obtained in a semi-solid media, supplemented with sucrose as carbon source and as growth regulators, BAP, IAA e NAA. The doubling time for the callus culture was determined as 22 days. The concentration of the alkaloid, obtained by chromatographic techniques was ca. 0.1 µg/ mg dry weight. The enzymatic assays related to pilocarpine biosynthesis were carried out with the aim to elucidate the imidazole ring formation beyond identify the site were this reaction takes place. The results indicated the presence of the enzyme histidine ammonia transferase (HAT, EC 2.6.1.38) only in the protein extract obtained from the roots of P. pennatifolius. The catalytic activity for this enzyme was 46.09 nKat/ mg protein. Volatile constituents from the leaves were analyzed by GC and GC/MS and the major compounds were determined as the hydrocarbons tridecane (56.8 %) and pentadecane (25.5 %). Almost 15 % of the total composition was constituted of non-oxygenated sesquiterpenes.

La recherche d'agents neuroprotecteurs dans le cadre d'un accident ou d'une maladie neurologique est une priorité des Neurosciences. Dans l'équipe, nous avons choisi d'étudier les effets neurobiologiques de l'érythropoïétine (Epo), « molécule phare » dans le domaine de la neuroprotection depuis une dizaine d'années. En analysant l'expression cérébrale de l'Epo et celle des constituants potentiels de son site de liaison (récepteur EpoR et chaîne β commune « βc ») au cours du développement postnatal et du vieillissement chez le rat, nous avons invalidé l'hypothèse selon laquelle la βc fait partie du récepteur de l'Epo. De plus, nous avons observé que divers stimuli environnementaux, tels que l'exposition hypoxique et l'enrichissement du milieu de vie, augmentent l'expression de l'EpoR dans des régions vulnérables du cerveau. Dans un modèle de status epilepticus chez le rat, cette augmentation est indispensable à l'amélioration des effets neuroprotecteurs de l'Epo, sans que la réponse inflammatoire précoce ne soit altérée.

<p>Studies have been performed to evaluate the use of micellar electrokinetic chromatography (MEKC), one mode of capillary electrophoresis (CE), as an analytical technique in industrial pharmaceutical analysis. The potential for using chemometrics for the optimisation of MEKC methods has also been studied as well as the possibilities of coupling MEKC with mass spectrometry (MS). </p><p>Two methods were developed, one for the determination of ibuprofen and codeine and another for pilocarpine, together with their degradation products and impurities in both cases. MEKC was found to be the most suitable mode of CE for the methods. Both methods were optimised by means of experimental design. Valuable information was gathered and optimum conditions were defined which resulted in fast systems with baseline-separated peaks. The ibuprofen-codeine method was validated according to the recommended validation procedures of the International Conference of Harmonisation. The validation was performed on a commercially available tablet formulation to verify the suitability of the method, i.e. for quantification of the two main compounds and to determine the degradation products and impurities in area% of each main peak. The following parameters were determined: selectivity, linearity, accuracy, precision, detection limit, quantitation limit, robustness and range. The results confirm that the method is highly suitable for its intended purpose, i.e. as a routine method for assay and impurity determination. The MEKC method for ibuprofen-codeine was coupled to a mass spectrometer in order to evaluate the potential of partial filling (PF)-MEKC-MS for identification of impurities in pharmaceutical substances and products. The so-called partial-filling technique was used to prevent the non-volatile micelles from entering the MS and was shown to fulfil its purpose of providing detection limits of about 10 pg. </p><p>The study clearly shows that micellar electrokinetic chromatography is well-suited as an analytical technique in industrial pharmaceutical analysis. </p>

Studies have been performed to evaluate the use of micellar electrokinetic chromatography (MEKC), one mode of capillary electrophoresis (CE), as an analytical technique in industrial pharmaceutical analysis. The potential for using chemometrics for the optimisation of MEKC methods has also been studied as well as the possibilities of coupling MEKC with mass spectrometry (MS). Two methods were developed, one for the determination of ibuprofen and codeine and another for pilocarpine, together with their degradation products and impurities in both cases. MEKC was found to be the most suitable mode of CE for the methods. Both methods were optimised by means of experimental design. Valuable information was gathered and optimum conditions were defined which resulted in fast systems with baseline-separated peaks. The ibuprofen-codeine method was validated according to the recommended validation procedures of the International Conference of Harmonisation. The validation was performed on a commercially available tablet formulation to verify the suitability of the method, i.e. for quantification of the two main compounds and to determine the degradation products and impurities in area% of each main peak. The following parameters were determined: selectivity, linearity, accuracy, precision, detection limit, quantitation limit, robustness and range. The results confirm that the method is highly suitable for its intended purpose, i.e. as a routine method for assay and impurity determination. The MEKC method for ibuprofen-codeine was coupled to a mass spectrometer in order to evaluate the potential of partial filling (PF)-MEKC-MS for identification of impurities in pharmaceutical substances and products. The so-called partial-filling technique was used to prevent the non-volatile micelles from entering the MS and was shown to fulfil its purpose of providing detection limits of about 10 pg. The study clearly shows that micellar electrokinetic chromatography is well-suited as an analytical technique in industrial pharmaceutical analysis.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:05Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-06-29 / Introducao: A inflamacao tem sido relacionada a varias doencas neurodegenerativas e dados clinicos e experimentais sugerem uma funcao crucial nos processos inflamatorios no desenvolvimento da epilepsia, em particular, nos mecanismos geradores de crises (ictogenese) e na transformacao de uma rede neuronal normal a uma rede geradora de crises. A lovastatina, substancia usada na reducao da sintese do colesterol, tambem esta relacionada com a resposta inflamatoria, podendo modular a producao de citocinas e diminuir e o estresse oxidativo. Objetivos: O presente estudo teve como objetivo analisar a acao da lovastatina no desenvolvimento das diferentes fases do modelo de epilepsia, induzido por pilocarpina em ratos. Metodos: Ratos Wistar machos foram analisados nos 3 periodos do modelo da pilocarpina (350mg/kg) fases: aguda (24h), silenciosa (15 dias) e cronica (30 dias apos a 1.a crise espontanea) e para cada periodo do modelo usamos 4 grupos de animais: salina, lovastatina (Lova), pilocarpina (Pilo) e pilocarpina+lovastatina (Pilo+Lova). O tratamento com lovastatina (20 mg/kg) se iniciou 2 h apos o inicio do estado de mal epileptico e foi administrada por 15 dias, duas vezes ao dia nos animais do grupo silencioso e cronico. O cerebro foi processado para realizacao de PCR em tempo real e imuno-histoquimica de IL-1ƒÀ, IL-6, TNF-ƒ¿, IL-10, receptor B1 e B2 de cininas e quantificacao de aminoacidos no hipocampo. Alem disso, o tecido hipocampal foi processado para as tecnicas de Nissl e Neo-Timm modificado. Alem disso, foi medida a temperatura corporea na fase aguda, duracao do periodo silencioso e frequencia de crises na fase cronica. Resultados: O tratamento com a lovastatina no grupo Pilo+Lova mostrou diminuicao da expressao de RNAm e das proteinas IL-1ƒÀ e TNF-ƒ¿ nas 3 fases do modelo Notamos tambem reducao nos niveis do receptor B1 e B2 de cininas na fase aguda e de IL-6 nas fases aguda e silenciosa do modelo. Houve um aumento da expressão de IL-10 na fase crônica e não houve alteração nos níveis dos aminoácidos no hipocampo dos animais desse grupo, quando comparado ao grupo Pilo. Foi observada uma normalização da temperatura corpórea dos ratos submetidos ao SE e tratados com lovastatina. Não houve diferença significativa entre o grupo Pilo e Pilo+Lova na duração da fase silenciosa e na freqüência de crises. Foi observada uma preservação de neurônios em CA1 e também uma diminuição no brotamento de fibras musgosas no grupo Pilo+Lova, quando comparado ao grupo Pilo, na fase crônica do modelo. Conclusão: O presente estudo demonstrou que o tratamento com a lovastatina diminuiu diversos parâmetros importantes relacionados com o dano neuronal induzido pelo SE, no hipocampo de ratos nas diferentes fases do modelo experimental de epilepsia induzido pela pilocarpina. / Introduction: Inflammation has been associated with several neurodegenerative diseases and experimental and clinical data suggest a crucial role in inflammatory processes in the development of epilepsy, particularly in seizure-generating mechanisms (ictogenesis) and transformation of a normal neuronal network into a network generating seizures. Lovastatin, a drug used in the reduction of cholesterol synthesis, is also related to the inflammatory response and can modulate cytokine production reducing the oxidative stress. Objectives: This study aimed to analyze the action of lovastatin in different stages of development model of epilepsy induced by pilocarpine in rats. Methods: Male Wistar rats were analyzed in three periods of the pilocarpine-induced epilepsy (350mg/kg) into phases: acute (24h), silent (15 days) and chronic (30 days after the 1st spontaneous seizure) and for each period of this model we used 4 groups of animals: saline-treated, lovastatin (Lova), pilocarpine (Pilo) and pilocarpine + lovastatin (Pilo+ Lova). Treatment with lovastatin (20 mg / kg) begun 2 h after the onset of status epilepticus (SE) and was administered for 15 days, twice a day the animals in the silent and chronic phases. The brain was processed for performing real-time PCR and immunohistochemistry of IL-1ƒÀ, IL-6, TNF-ƒ¿, IL-10 and kinin B1 and B2 receptors and quantification of amino acids in the hippocampus. Besides, the hippocampal tissue was processed for Nissl techniques and Neo-Timm. In addition, body temperature was measured in the acute phase and the duration of the silent period and seizure frequency in chronic phase was analyzed. Results: Treatment with lovastatin in Pilo + Lova group showed decreased expression of mRNA and proteins IL-1ƒÀ and TNF-ƒ¿ in the three phases of this model, We also noted reduction of kinin B1 and B2 receptor in the acute and IL-6 into acute and silent periods. There was an increased expression of IL-10 in the chronic phase of this model. There was no change in amino acids levels in the hippocampus of rats from Pilo+Lova group when compared to Pilo group. We observed a normalization of body temperature of rats subjected to SE and treated with lovastatin. There was no significant difference between the group Pilo and Pilo + Lova on the duration of the silent phase and in seizure frequency. We observed a preservation of neurons in CA1 and also a reduction of mossy fiber sprouting in Pilo+ Lova group as compared to the Pilo group in the chronic phase of the model. Conclusion: This study demonstrated that treatment with lovastatin decreased number of important parameters related to the neuronal damage induced by SE in the hippocampus of rats at different stages of the experimental model of epilepsy induced by pilocarpine. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Hipótese do estudo: O presente trabalho foi desenvolvido a partir da hipótese de que existe relação entre o órgão subfornicial de ratos (OSF) e o fluxo, conteúdo protéico e eletrolítico da saliva, pressão arterial e frequência cardíaca. Proposição: Objetivo deste estudo foi investigar a possível relação entre o órgão subfornicial (OSF) e o fluxo, conteúdo proteico e eletrolítico da saliva, pressão arterial e frequência cardíaca em ratos. Metodologia: Para o desenvolvimento do estudo, foram utilizados vinte ratos machos adultos da raça Wistar (Rattus norvegicus var. albinus), pesando entre duzentos e cinquenta e trezentas gramas por meio de experimentação progressiva da fase 0 (F0) até a fase III (FIII); Os vinte animais passaram pela estimulação salivar (F0 e FI), depois pela canulação do OSF- lesão fictícia(FII) e posteriormente pela lesão eletrolítica (FIII), Com a lesão no OSF, permitiu averiguar a participação dos corpos celulares e fibras de passagem presentes na região reguladora da secreção salivar, fluxo salivar, conteúdo proteico e eletrolítico da saliva e as alterações nos padrões cardiovasculares. Para efetivação da lesão no OSF,(FIII) um eletrodo de aço inoxidável com 0.5mm de diâmetro de ponta, sem isolamento, foi introduzido na área do OSF pela cânula previamente posicionada na (FII). No quinto dia do período pós-operatório, o fluxo salivar foi estimulado com uso da pilocarpina injetada intraperitonealmente (IP) em todas as fases e os animais da (FI) usados como referência em relação aos lesionados fictícios e eletrolíticos considerados Fase III. Em todas as fases do experimento, determinou-se o conteúdo protéico e eletrolítico da saliva, e os padrões cardiovasculares e pressóricos. Resultados: Os resultados foram apresentados como média e erro padrão médio. Para avaliação da interação entre fatores (lesão/droga/efeito) foi utilizada o teste de Newman post-hoc (p<0,05). Foi evidenciada relação da lesão do OSF (FIII) com os padrões cardiovasculares, demonstrando efeito hipertensor da pilocarpina (FII) (326mmHg) em relação à (FIII) (94mmHg), aumento da Freqüência Cardíaca (F0 e FII) (31018bpm) e redução significativa da FC em (FIII) (23323bpm) (p<0,05) Com relação ao Fluxo salivar houve redução em (FIII) em relação à (FI e FII) (177 17mg/7min), (50124mg/7min) respectivamente. Conclusões: O OSF está intimamente relacionado com as alterações do fluxo salivar, secreção, conteúdo protéico e eletrolítico da saliva e alterações cardiovasculares em ratos. / Hypothesis of the study: Hypothesis of the study: The present work was developed from the hypothesis that exists a relation enters the subfornical agency of rats (OSF) and the flow, protein and electrolyte content of the saliva, blood pressure and heart rate. Proposition: Objective of this study was to investigate the possible relation between the subfornical agency (OSF) and the flow, content protein and electrolyte of the saliva, blood pressure and heart rate in rats.Methodology: For the development of the study, (20) twenty adult male rats of the race Wistar (Rattus norvegicus var. albinus), weighing between two hundred and fifty and three hundred grams by means of gradual experimentation of phase 0 (F0) until the III phase (FIII); The twenty animals had passed for the salivary stimulation (F0 and FI), later for the cannulation of the OSF- fictitious injury (FII) and later for the electrolyte injury (FIII), With the injury in the OSF, allowed to inquire the participation of the cellular bodies and staple fibres present in the regulatory region of the salivary secretion , salivary flow , protein and electrolyte content of the saliva and the changes in the cardiovascular standards. For efficacy of the injury in the OSF, (FIII) a stainless steel electrode with 0.5mm of tip diameter, without isolation, was introduced in the area of the OSF for the cannula previously located in (FII). In the fifth day of the postoperative period, the salivary flow was stimulated with use of the pilocarpine injected intraperitoneally (IP) in all the phases and the animals of (FI) used ones as reference in relation to the fictitious and electrolyte injured ones considered Phase III. At all stages of the experiment, we determined the protein and electrolyte content of saliva, and blood pressure patterns and cardiovascular. Results: The results had been presented as average and error average standard. For evaluation of the interaction between factors (injury/drug/effect) the test of Newman was used posthoc (p< 0,05). Was evidenced relation of injury of OSF (FIII) with cardiovascular standards , demonstrating effect hypertensive of pilocarpine (FII) (32 (6mmHg) in relation to (FIII) (9 (4mmHg), increase of Heart Rate(F0 and FII) (310 (18bpm) and significant reduction of the FC in (FIII) (233 (23bpm) (p< 0,05) With regard to the salivary flow had reduction in (FIII) in relation to (FI and FII) (177 (17mg/7min), (501 (24mg/7min) respectively.Conclusions: The OSF is closely related to changes in salivary flow, secretion, protein and electrolyte content of saliva and cardiovascular changes in rats.

Pilocarpus pennatifolius Lemmaire (Rutaceae) é uma espécie nativa que ocorre nas regiões Sul, Sudeste, Centro-Oeste e Nordeste do Brasil, e é popularmente conhecida por jaborandi. Essa e outras espécies de Pilocarpus encontram-se em risco de extinção devido ao extrativismo (uso como planta medicinal) e ao desmatamento. O cultivo in vitro de P. pennatifolius foi realizado como uma alternativa para a produção de pilocarpina (princípio ativo do jaborandi). A cultura de células foi obtida em meio MS semi-sólido, suplementado com sacarose, como fonte de carbono, e tendo como reguladores de crescimento BAP, IAA e NAA. O tempo de duplicação da cultura de calos foi de 22 dias. A concentração do alcalóide, determinada por técnicas cromatográficas, foi de aproximadamente 0,1 &#181;g/ mg de biomassa. Os ensaios enzimáticos referentes à biossíntese da pilocarpina tiveram como objetivo elucidar a etapa inicial de formação do anel imidazólico, além da localização desta reação na planta. Os experimentos realizados indicaram a presença da enzima histidina amino-transferase (HAT, EC 2.6.1.38) cuja atividade catalítica foi de 46,09 nKat/ mg de proteína, apenas no extrato protéico das raízes de P. pennatifolius. A determinação da composição do óleo essencial por CG e CG/EM indicou como constituintes majoritários os hidrocarbonetos tridecano (56,8 %) e pentadecano (25,5 %). Os sesquiterpenos não oxigenados constituíram cerca de 15 % do óleo obtido. / Pilocarpus pennatifolius Lemmaire (Rutaceae) is a native Brazilian species which is commonly known as jaborandi. This species is endangered due to its exploitation as medicinal plant and the increasingly deforestation. A callus culture of P. pennatifolius was established as an alternative source for pilocarpine production (the active compound of jaborandi). The cell culture was obtained in a semi-solid media, supplemented with sucrose as carbon source and as growth regulators, BAP, IAA e NAA. The doubling time for the callus culture was determined as 22 days. The concentration of the alkaloid, obtained by chromatographic techniques was ca. 0.1 &#181;g/ mg dry weight. The enzymatic assays related to pilocarpine biosynthesis were carried out with the aim to elucidate the imidazole ring formation beyond identify the site were this reaction takes place. The results indicated the presence of the enzyme histidine ammonia transferase (HAT, EC 2.6.1.38) only in the protein extract obtained from the roots of P. pennatifolius. The catalytic activity for this enzyme was 46.09 nKat/ mg protein. Volatile constituents from the leaves were analyzed by GC and GC/MS and the major compounds were determined as the hydrocarbons tridecane (56.8 %) and pentadecane (25.5 %). Almost 15 % of the total composition was constituted of non-oxygenated sesquiterpenes.

INTRODUÇÃO: As relações entre sono e epilepsia são complexas e de grande importância clínica. A melhor compreensão das inúmeras lacunas que permeiam essa relação reforçaria os alicerces para o desenvolvimento de abordagens terapêuticas mais eficazes que pudessem contribuir para o bem-estar do paciente portador de epilepsia e transtornos do sono. OBJETIVO: O presente estudo teve como principal objetivo o estudo comportamental e a caracterização eletrofisiológica do ciclo vigília-sono (CVS) de ratos adultos tornados epilépticos por pilocarpina. MÉTODO: Ratos Wistar machos (N=6), tornados epilépticos após status epilepticus (SE) induzido por pilocarpina e não epilépticos (N=6) foram submetidos à cirurgia extereotáxica para implante de elétrodos bipolares nas áreas corticais (A3, somatosensorial) e hipocampais (CA1) de ambos os hemisférios. Registros contínuos de 24 horas foram submetidos à minuciosa análise visual e os seguintes parâmetros foram analisados: identificação e quantificação dos padrões eletrofisiológicos das fases do ciclo CVS; duração dos episódios oníricos ocorridos durante o sono dessincronizado (SD); padrão de ocorrência do CVS assim como do ciclo de sono (CS), e análise do volume do núcleo supraquiasmático. Os estudos da distribuição do CVS e comportamento onírico foram submetidos à Análise de Variância Multivariada - MANOVA, ao passo que as análises da ocorrência dos ciclos (CVS e CS) e volume do núcleo supraquiasmático foram submetidas ao teste da Análise de Variância (ANOVA) de dois fatores e ao teste de Mann- Whitney, respectivamente. RESULTADOS: Todas as fases do CVS foram identificadas nos ratos epilépticos. As fases da vigília e do sono eram permeadas por espículas e outros grafoelementos epileptiformes, como ondas delta espiculadas no SS e potenciais de alta frequência e baixa voltagem durante VA e o SD. Ao contrário do padrão de ocorrência típico das fases de vigília e sono em ratos não epilépticos, o grupo epiléptico apresentou diferenças significativas quanto à distribuição dessas fases em função do período. Foi observada redução significativa de VA (p<0,002) com concomitante aumento de SS (p<0,005) e vigília relaxada (VR) (p=0,021) no escuro, sendo que a VR era preponderante apenas na primeira metade da noite. Durante o dia, a quantidade de SS era maior no período da manhã (p<0,001), ao passo que houve redução do SD (p=0,002) concomitante com aumento de VA (p<0,001) no período da tarde.Os animais tornados epilépticos por pilocarpina apresentaram redução no padrão de ocorrência do CVS e CS (p=0,004 e p=0,003, respectivamente). Não houve diferença estatística na duração dos episódios oníricos, assim como no volume do núcleo supraquiasmático entre os grupos analisados (p>0,63 e p=0,47, respectivamente). CONCLUSÃO: Os animais epilépticos apresentaram alterações na arquitetura do CVS, bem como nos padrões de ciclicidade evidenciado pelas alterações de comportamento, especialmente no ciclo escuro. Esses fatos sugerem possível comprometimento estrutural e/ou funcional das circuitarias responsáveis pela geração e manutenção das fases de vigília e sono, assim como dos sistemas de temporização do CVS. Tomados em conjunto, os dados reproduziram anormalidades do CVS observadas em pacientes epilépticos, sugerindo que o presente modelo pode ser uma importante ferramenta para o estudo de mecanismos subjacentes à epilepsia do lobo temporal e sono. / INTRODUCTION: Relationships between sleep and epilepsy are complex and have great clinical importance as well. The full understanding of the various gaps present in this relationship would pave the ground for new studies that could generate new clinical approaches aiming to contribute to the well-being of the patient suffering from epilepsy and sleep disorders. OBJECTIVE: The present study aimed to carry out a behavioral analysis and electro-oscillographic characterization of the phases of sleep-wake cycle (SWC) of pilocarpine- induced epilepsy in adult rats. METHODS: Male Wistar rats that became epileptic after 60 days of pilocarpine-induced status epilepticus (SE) (N=6) and non epileptic ones (N=6) were submitted to extereotaxic surgery for implantation of bipolar electrodes in cortical (A3, somestesic) and hippocampal (CA1) areas in both hemispheres. Twenty-four hour continuous registers were submitted to detailed visual analysis and the following parameters were studied: identification and quantification of electrophysiological parameters of phases of SWC, duration of oniric episodes during desynchronized sleep (DS), the pattern of occurrence of SWC and cycles of sleep (CS). In addition, the volume of suprachiasmatic nuclei was investigated. To analyze the architecture of sleep-wake phases and oniric behavior, Multivariate Analysis of Variance-MANOVA was utilized, whereas the pattern of cycles (SWC and CS) and volume of suprachiasmatic were submitted to Analysis of Variance with 2 factors-Two-way ANOVA and Mann-Whitney test, respectively. RESULTS: In the epileptic rats all phases of SWC were identified. The phases of wake and sleep were permeated by spikes and graph elements epileptiforms such as spiked delta waves in SS and low frequency waves with high voltage during AW and SD phases. In contrast to the pattern of normal rhythmic activity evident in non-epileptic rats the epileptic group presented significant differences concerning distribution of the phases of SWC according to the period. In the dark cycle significant reduction of AW (p<0.002) was observed concomitantly with an increase of SS (p<0.005), while the relaxed wakefulness (RW) showed an increase during the first half of the night (p=0.021). In the light cycle, the SS was more prominent in the morning period (p<0.001), following by a reduction of DS (p=0.002) concomitantly with an increase of AW (p<0.001) during the afternoon in the epileptic group. The number of cycles with a regular sequence of each phase from awake to sleep (SWC) was significantly decreased (p=0.004), as was the number of cycles of sleep (p=0.003) in epileptic rats. No significant differences were found in duration of oniric episodes and volume of suprachiasmastic nuclei (p>0.63 e p=0.47, respectively) between non epileptic and epileptic groups. CONCLUSION: The data obtained revealed that after SE the epileptic animals presented some alterations in the SWC architecture as well as in the cyclicity patterns mainly in dark cycle. Such facts suggest a possible functional and/or structural impairment in the circuitry responsible for the generation of sleep and wake phases and in the SWC timing system. Taken together the data reproduced the abnormalities observed in patients, suggesting that the pilocarpine model is a suitable one to study sleep dysfunctions in temporal lobe epilepsy.

Introdução: A epilepsia do lobo temporal mesial (ELTM) é a forma mais comum de epilepsia na população adulta, tendo a esclerose hipocampal como principal substrato neuropatológico. Uma elevada proporção dos pacientes com ELTM apresentam história familiar positiva para a epilepsia, sugerindo a participação de fatores genéticos nesta síndrome. O citoesqueleto neuronal é essencial para os processos fisiológicos das células nervosas e crises epilépticas parecem afetar esta estrutura. O citoesqueleto neuronal possui importantes componentes regulatórios, dentre eles as proteínas associadas aos microtúbulos do tipo 2 (MAP2) e tau. Objetivos: Avaliar a densidade neuronal (células imunomarcadas com NeuN), neobrotamento das fibras musgosas (por histoquímica de neo-Timm) e a expressão imunohistoquímica das proteínas MAP2 e tau no hipocampo de casos cirúrgicos de ELTM (subtipos familiar e esporádico) e controles. As mesmas análises foram conduzidas no modelo animal de lítiopilocarpina. Métodos: Casos ELTM (n=38) foram divididos em ELTM familiar (n=20) e ETLM esporádica (n=18). Hipocampos controles (n=10) foram provenientes de necrópsias de sujeitos sem histórico de problemas neurológicos. No modelo animal de lítio-pilocarpina, animais submetidos ao status epilepticus (SE) foram sacrificados nos seguintes tempos pós-SE: 1, 7, 15 e 60 dias e classificados como grupos SE1, SE7, SE15 e SE60. Animais controle foram injetados com salina. Resultados: O grupo ELTM apresentou menor densidade neuronal que o controle nas regiões da camada granular, hilo, CA4, CA3, CA1 e prosubículo. O grupo ELTM mostrou maior valor de cinza da histoquímica de neo-Timm na camada granular, molecular interna e molecular externa e maior espessura do neobrotamento axonal na camada molecular interna em relação ao grupo controle. O grupo ELTM esporádica teve maior valor de cinza da histoquímica de neo-Timm e tendência à maior espessura do neobrotamento que o grupo ELTM familiar na camada molecular interna. O grupo ELTM apresentou menor expressão de MAP2 que o grupo controle no hilo, CA4, CA3, CA1 e prosubículo e maior expressão que o controle na camada granular, CA2 e parasubículo. O grupo ELTM esporádica teve maior expressão de MAP2 que o grupo ELTM familiar em CA1 e córtex entorrinal. O grupo ELTM apresentou maior expressão de tau que o grupo controle nas regiões da camada granular, hilo, CA3, CA2 e córtex entorrinal. O grupo ELTM esporádica demonstrou menor imunorreatividade para tau que o grupo ELTM familiar no córtex entorrinal. No modelo de lítio-pilocarpina, os grupos submetidos ao SE apresentaram menor densidade neuronal e maior neobrotamento que o grupo salina. Quanto à expressão de MAP2, os grupos SE60 e SE15 apresentaram maiores valores de expressão que os demais grupos em todas as regiões analisadas. A expressão de tau em CA3 não foi diferente entre os grupos animais analisados. Conclusão: Nossos resultados existem perda neuronal, reorganização sináptica das fibras musgosas e alterações na expressão de proteínas MAP2 e tau no hipocampo de pacientes com ELTM. Dentre os casos ELTM, encontramos diferenças no neobrotamento de fibras musgosas e na expressão de MAP2 e tau entre os grupos ELTM familiar e esporádica, indicando que estes grupos se apresentam de forma distinta em relação à epilepsia. Encontramos resultados II semelhantes em relação à densidade neuronal e o neobrotamento de fibras musgosas entre pacientes com ELTM e no modelo experimental. Porém, em relação à expressão das proteínas MAP2 e tau, encontramos algumas diferenças entre humanos e animais com ELTM. Nossos resultados sugerem que apesar do modelo de epilepsia induzida por lítio-pilocarpina ser relevante para o estudo da ELTM humana e mimetizar importantes aspectos neuropatológicos, a correspondência quanto à expressão de algumas proteínas estruturais não é completa. Estudos adicionais de expressão de proteínas do citoesqueleto em outros modelos animais de ELTM serão de grande importância para o melhor entendimento do processo epileptogênco. / Introduction: Mesial temporal lobe epilepsy (MTLE) is the most common form of epilepsy in adults and has hippocampal sclerosis as the main pathological substrate. A high proportion of patients with MTLE have positive familial history for epilepsy, suggesting the involvement of genetic factors in this syndrome. Seizures may affect the neuronal cytoskeleton, an structure that is essential in the physiological processes of nerve cells. Components of the neuronal cytoskeleton include microtubule-associated protein type 2 (MAP2) and tau. Objectives: Our aim was to evaluate neuronal density, mossy fiber sprouting and immunohistochemical expression of MAP2 and tau in the hippocampus of surgical cases of MTLE (familial and sporadic subtypes) and controls. The same analysis were conducted in the MTLE lithiumpilocarpine animal model.Methods: MTLE cases (n = 38) were divided into familial MTLE (n = 20) and sporadic MTLE (n = 18). Control hippocampi (n = 10) were obtained from autopsies of subjects without history of epilepsy. In the lithium-pilocarpine animal model, male Wistar rats were submitted to status epilepticus (SE) and were killed at the following post-SE days: 1, 7, 15 and 60, and were further classified SE1, SE7, SE15 and SE60. Control animals were injected with saline. Results: MTLE showed decreased neuronal density than controls in the granular layer, hilus, CA4, CA3, CA1 and prosubiculum. MTLE group showed increased neo-Timm gray value in the granular layer, inner and outer molecular layer, as well as increased mossy fiber length of mossy fiber in the inner molecular layer when compared to controls. Sporadic MTLE specimens exhibited increased inner molecular layer gray value than familial MTLE. MTLE hihppocampi showed decreased MAP2 expression in the hilus, CA4, CA3, CA1 and prosubiculum. In the granular layer, CA2 and parasubiculum, MAP2 expression was higher in MTLE specimens than in controls. CA1 and entorhinal cortex from sporadic MTLE hippocampi showed increased MAP2 expression than familial MTLE. Tau expression was increased in the granular layer, hilus, CA3, CA2 and entorhinal cortex of MTLE specimens. Sporadic MTLE exhibited lower tau immunoreactivity in the entorhinal cortex than familial MTLE. In the lithiumpilocarpine animal model, rats submitted to SE presented lower values of neuronal density and mossy fiber sprouting than controls. SE15 and SE60 showed increased MAP2 expression in all hippocampal subfields. Tau expression in CA3 was not different among the groups. Conclusion: Our results indicate that besides neuronal loss and axonal sprouting, MTLE specimens also exhibit dendritic abnormalities related to MAP2 expression. Increased tau immunoreactivity in epileptogenic hippocampi indicates possible abnormal expression related to mossy fiber sprouting in chronic MTLE. We found differential sprouting, MAP2 and tau expression between sporadic and familial MTLE. It is possible that different genetic background might result in somehow distinct neuropathological substrates between the two MTLE subtypes, although their clinical manifestation is quite similar. While neuronal loss and axonal sprouting profiles in human MTLE and chronic phase of the lithium-pilocarpine animal model are comparable, we could not find corresponding results regarding MAP2 and tau expression. IV Several studies have shown that chemo-convulsant as pilocarpine and kainic acid result in widespread brain epileptic discharges, which are different from the more focal hippocampal discharges seen in human MTLE. Despite its limitations, the lithium-pilocarpine model stands as an important and widely used animal model of epilepsy. Besides that, other animal models in which ictal discharges and lesions are more limited to the hippocampal formation might better mimic what we see in human MTLE.

O núcleo talâmico mediodorsal (Tmd) e o córtex pré-frontal (CPF) comunicam-se mutuamente, formando um circuito envolvido em funções executivas e transtornos psiquiátricos. As funções executivas estão sujeitas aos níveis de alerta gerados pela atividade oscilatória talamocortical, que por sua vez é controlada pela transmissão colinérgica. Possivelmente, a plasticidade sináptica do circuito Tmd-CPF é sensível tanto aos padrões oscilatórios do próprio circuito quanto à modulação colinérgica. Porém, esta possibilidade ainda não foi testada, muito menos dissociando-se a participação dos receptores muscarínicos e nicotínicos. Assim, nosso objetivo foi examinar como a plasticidade Tmd-CPF é modulada sob estados oscilatórios globais mediados pelo sistema colinérgico, e se esta modulação varia com os tipos de receptores recrutados. Anestesiamos ratos com uretana e implantamos um eletrodo de estimulação no Tmd, um eletrodo de registro no CPF e uma cânula de microinjeção acima do ventrículo. Emitimos 90 pulsos elétricos no Tmd (0,05 Hz) para evocação de potenciais pós-sinápticos de campo (PPSCs) basais no CPF por 30 min. Em seguida, aplicamos injeção intraventricular do agonista muscarínico pilocarpina (PILO), do agonista nicotínico nicotina (NIC), ou veículo-controle (VEIC). Os efeitos das substâncias sobre potenciais de campo locais (eletrencefalograma) foram monitorados através dos mesmos eletrodos. PILO e NIC induziram aumento das oscilações rápidas (4-80 Hz) e proporcional redução das oscilações lentas mantidas pela anestesia (0,5-4 Hz) e tais efeitos duraram ~10-15 min, conforme padronização prévia das concentrações das drogas. Justamente durante este período, aplicamos estimulação em alta frequência (EAF) ou baixa frequência (EBF) para indução de, respectivamente, potencialização (PLD) ou depressão (DLD) de longa duração, que são modelos bem conhecidos de plasticidade sináptica. Em grupos-controle, a injeção de PILO, NIC ou VEIC foi desacompanhada de EAF/EBF. Por fim, retomamos a coleta de PPSCs a 0,05 Hz por 240 min. Os resultados mostraram que a EAF não afetou os PPSCs quando aplicada após VEIC. Porém, nos ratos PILO e NIC, os PPSCs tiveram amplitude aumentada a partir de 150 min após EAF, indicando que a pré-ativação colinérgica foi necessária à indução de uma PLD tardia. Inversamente, quando a EBF foi aplicada após VEIC, a amplitude dos PPSCs foi reduzida de modo estável por 240 min. Isto não ocorreu quando a EBF foi aplicada após PILO e NIC, sugerindo que a modulação colinérgica suprimiu a DLD. Nos grupos-controle, PILO, NIC e VEIC sozinhos não afetaram os PPSCs em longo prazo, confirmando que os resultados de PLD e DLD são devidos a uma interação entre a pré-ativação colinérgica e mecanismos sinápticos desencadeados pela EAF/EBF.Portanto,as oscilações rápidas induzidas pela transmissão colinérgica favorecem a PLD no circuito Tmd-CPF, enquanto dificultam sua DLD. Além disto, os efeitos muscarínicos e nicotínicos sobre a plasticidade de longo prazo são iguais, apesar de os mecanismos celulares destes receptores serem diferentes. Nossos achados ajudam a esclarecer a regulação do sinal talâmico no CPF sob modulação colinérgica fisiológica (atenção e sono paradoxal) e disfuncional (esquizofrenias e doença de Alzheimer). / The mediodorsal thalamic nucleus (MD) and the prefrontal cortex (PFC) communicate with each other, constituting a circuit involved in executive functions and psychiatric disorders. Executive functions are subject to arousal levels driven& by the thalamocortical oscillatory activity, which in turn is controlled by the cholinergic neurotransmission. Possibly, the MD-PFC synaptic plasticity is susceptible to both the oscillatory patterns within the MD-PFC circuit and the cholinergic modulation. However, this likelihood is still untested, as well as the specific roles of muscarinic and nicotinic receptors. Thus, our aim was to evaluate whether and how the MD-PFC plasticity is modulated under cholinergic system-dependent oscillatory states of the forebrain, and if such modulation varies with the subtypes of activated cholinergic receptors. For that, we anesthetized rats with urethane to implant a stimulating electrode into the MD, a recording electrode into the PFC, and a microinjection cannula above the ventricle. We applied 90 monophasic square pulses into the MD (0.05 Hz) for recording of basal field postsynaptic potentials (fPSPs) in the PFC for 30 min. Then, we did an intraventricular injection of either the muscarinic agonist pilocarpine (PILO), the nicotinic agonist nicotine (NIC), or a control vehicle (Veh). The drug effects on local field potentials (electroencephalogram) were monitored through the same electrodes. PILO and NIC induced an increase in theta, beta and gamma oscillations (4-80 Hz) with proportional reduction of urethane-driven delta waves (0.5-4 Hz), and these effects survived approximately 10-15 min according to pilot-experiments on PILO and NIC concentrations. During this period, we applied either high-frequency (HFS) or low-frequency stimulation (LFS) for induction of respectively long-term potentiation (LTP) or depression (LTD), which are well-known synaptic plasticity models. In control groups, the injection of PILO, NIC or Veh was not followed by the HFS/LFS. Lastly, we resumed the evoking of fPSP at 0.05 Hz for an additional 240 min. The results showed that the HFS did not affect the fPSPs when applied after the Veh. However, in PILO and NIC rats the fPSP had their amplitudes increased from 150 min after HFS, indicating that the cholinergic pre-activation was required for the induction of a late-phase LTP. On the other hand, when the LFS was applied after the Veh, the fPSP amplitudes were stably decreased for 240 min, which did not occur when the LFS was applied after PILO and NIC, suggesting that the cholinergic modulation suppressed the LTD. In the control groups, PILO, NIC, and Veh by themselves did not change fPSPs in the long term, reinforcing that the LTP and LTD were due to an interaction between the cholinergic pre-activation and synaptic mechanisms triggered by the HFS/LFS. Therefore, the rapid oscillations induced by the cholinergic transmission favor LTP in the MD-PFC loop, while occlude its LTD. Moreover, the muscarinic and nicotinic effects on long-term plasticity were equal, although their quite distinct cell mechanisms. Our findings might help clarify the regulation of thalamic signals on the PFC both under physiological (attention and rapid-eye-movement sleep) and dysfunctional (schizophrenia symptoms and Alzheimer\'s) cholinergic drive.