Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2018-06-28T12:59:05Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1975487 bytes, checksum: b9aa66d7efaefa5e006f60d3dea374a3 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-28T12:59:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1975487 bytes, checksum: b9aa66d7efaefa5e006f60d3dea374a3 (MD5) Previous issue date: 2018-02-21 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Neste trabalho, fizemos experimentos de estiramentos em moléculas únicas com pinça óptica e apoiamos nossas análises e conclusões nas técnicas de Eletroforese em Gel, Microscopia de Força Atômica e Espalhamento Dinâmico de Luz. Usamos este aparato para estudarmos inte- rações do DNA com alguns ligantes, incluindo proteína, surfactante, fármaco antitumoral (do- xorrubicina) e complexos formados com a união de dois destes ligantes e o DNA. Os ligantes, proteína e surfactante, foram escolhidos devido a suas possíveis funcionalizações como trans- portadores de fármacos ou material genético para o interior celular (carreadores). Estes dois são agentes condensantes do DNA e a condensação é um processo de fundamental importância na formação de carreadores. O fármaco antitumoral foi estudado por ser um material interessante a ser transportado para o interior celular. As propriedades mecânicas dos complexos em função da concentração do ligante foram diretamente determinadas a partir das medidas de estiramento, através do ajuste de curvas de força por extensão, no qual empregamos o modelo da cadeia ver- miforme (WLC) para polímeros semiflexíveis. Além disso, os parâmetros físico-químicos da interação DNA-doxorrubicina foram extraídos a partir de dados do comprimento de contorno, usando o modelo estatístico de ajuste pelo comprimento de contorno, previamente desenvol- vido pelo grupo de Física Biológica da UFV. Este modelo nos permitiu a obtenção da isoterma de ligação e particularmente, detectamos a interação típica de intercalantes para o fármaco do- xorrubicina, desvendando peculiaridades dessa interação a partir da autoagregação da droga em diferentes condições iônicas. Também coletamos dados da interação da proteína C 4 S 10 K 12 com o DNA que ajudam a evidenciar o processo de ação pelo qual a proteína C 4 S 10 K 12 condensa o DNA. Estudamos também a interação do surfactante catiônico DTAB com o DNA, como outro agente condensante do DNA, observando alguns aspectos importantes deste processo de condensação. / In this work, we performed single molecules stretching experiments with optical tweezers, and we supported our analysis and conclusions with the techniques of Gel Electrophoresis, Atomic Force Microscopy and Dynamic Light Scattering. We used these apparatus to study interactions of DNA with various ligands, including: protein, surfactant, an antitumoral drug (doxorubicin) and complexes formed from the link-up of two of these substances and DNA. The binders, pro- tein and surfactant, were chosen because of their possible functionalisations as drug or genetic material carriers for the cellular interior (carriers). These two are DNA-condensing agents and the DNA condensation is a fundamental process in carriers formation. The antitumor drug was studied because it is an interesting material to be transported into cells. The complexes’ mecha- nical properties as a function of ligand concentration were directly determined from stretching measurements by fitting the force extension curves to the worm-like chain model (WLC) of semi-flexible polymers. In addition, the physicochemical parameters of the DNA-doxorubicin interaction were extracted using a statistical model-fitting approaches by the contour length previously developed by the group of Biological Physics of UFV. These models allowed us to obtain the binding isotherms and particularly we detected the typical interaction of intercalators for the doxorubicin drug, unraveling peculiarities of this interaction, from drug self-aggregation, in different ionic conditions. Also, we collected data of the C 4 S 10 K 12 -DN A interaction that help to evidence the action process throughout which the protein C 4 S 10 K 12 condenses DNA. We also have studied the interaction between DNA and the cationic surfactant DTAB, as another DNA condensing agent, in which we observed some important aspects from this condensation process.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2018-07-09T18:20:53Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 4630685 bytes, checksum: a420e25091cd9c312ab493f5e2bf056f (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-09T18:20:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 4630685 bytes, checksum: a420e25091cd9c312ab493f5e2bf056f (MD5) Previous issue date: 2018-04-06 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Iniciamos este trabalho estudando o pinçamento óptico que foi a técnica experimental fundamental para realização desse projeto. A pinça Optica Trata-se de uma técnica de micromanipulação bastante utilizada para estudar partículas e sistemas biológicos com tamanho na escala de micrômetro. Através da técnica caracterizamos via espec- troscopia de força as interações do DNA e albumina do soro bovino (BSA) mostramos o processo de compactação do DNA por interação de depleção, em seguida estudamos interações DNA-ligantes que constitui um campo interdisciplinar de conhecimento, com importância fundamental tanto no entendimento de vários processos intracelulares ba- sicos (divisão celular, transcrição, tradução) bem como na aplicação em tratamento de doenças humanas (quimioterapias, terapias gênicas). Neste sentido, farmacos intercalantes desempenham papel central devido a sua larga aplicação em diversos tipos de quimioterapias. Os intercalantes modificam a estrutura mecânica da dupla hélice da molécula de DNA ao interagirem com o mesmo, de forma que as características físico- químicas da interação podem ser estudadas via ensaios mecânicos, como por exemplo em experimentos de estiramento de moléculas únicas de DNA realizados por pinças óticas ou magnéticas. Entretanto, quase totalidade dos trabalhos disponíveis na literatura a respeito das interações de intercalantes com o DNA foram realizados com este último disperso em solução, numa conformação muito diferente da encontrada no interior das células, onde o DNA está fortemente compactado formando a cromatina. Na segunda parte do trabalho estudamos a influência da histona linker H1 para dinâmica da cromatina e sua importância para regulação da cromatina ao interagir com fármaco doxorrubicina. / The study of optical tweezers technique initiates this thesis work on account of being underlying to this project accomplishment. The optical tweezer is a technique of micro- manipulation very useful to work with biological systems and particles in the microme- ter size scale. By using this technique we characterized per force spectroscopy the DNA and bovine sorum albumin (BSA) interactions, featuring the process of DNA compac- tation by depletion interaction, then the DNA-binders interactions were studied, this last concerns an interdisciplinary field of knowledge being fundamental to understand a lot of basic intracellular processes (cell division, transcription, translation) as well as the treatment of human diseases (chemotherapies, gene therapies). In this sense, DNA intercalator drugs play the main role owing to its large application in many kinds of chemotherapies, this drugs modify the mechanical structure of the double helix in the DNA molecule during the interaction, so the physicochemical features of this interac- tions can be studied by mechanical essays as in the single molecule DNA stretching realized by optical or magnetic tweezers. However, almost every available work in the literature about the interactions between DNA and intercalators were done with the suspended molecule wich differs a lot from the intracellular medium, were there are found tightly compacted forming the chromatin. In the second part of this work the H1 histone linker influence for the chromatin dynamics were studied and its importance to regulate the chromatin during the interaction with the doxorrubicin were discussed.

Um sistema multi-feixe de pinças ópticas baseado na técnica de contraste de fase da ordem zero pode apresentar vantagens significativas sobre sistemas mecanicamente complexos e sensíveis ao alinhamento, e sobre tecnologias que, apesar de serem similares, requerem a customização de componentes ópticos. Porém, ao nosso conhecimento, este sistema até agora não tem sido implementado experimentalmente. Neste trabalho tem-se desenvolvido, como prova de princípio, o primeiro sistema baseado na técnica de contraste de fase da ordem zero gerador de múltiplas pinças ópticas. Esta técnica da óptica de Fourier utiliza conceitos do contraste de fase de Zernike e técnicas de codificação de dois pixels para gerar padrões de intensidade no plano da imagem que são diretamente relacionados a distribuições de fase no plano de entrada do sistema, o qual é formado por um modulador espacial de luz (SLM). Esta dissertação de mestrado descreve detalhadamente os passos tomados com o propósito de utilizar os campos estruturados de luz gerados pelo sistema de contraste de fase da ordem zero para aprisionar esferas de 2 µm de diâmetro de sílica fundida. Neste trabalho apresentamos os fundamentos teóricos do aprisionamento óptico e da técnica de contraste de fase da ordem zero, seguidos pela implementação de experimentos independentes em cada modalidade, e finalmente apresentamos a integração de ambos os sistemas dentro um sistema único de pinças ópticas multi-feixe. Apesar da baixa eficiência óptica do sistema, foi possível implementar um sistema de pinças ópticas duplas. Finalizamos o nosso trabalho na discussão detalhada das limitações do nosso arranjo óptico e comentamos sobre potenciais melhorias para aumentar a rigidez das pinças ópticas e a qualidade geral do sistema. / A multi-beam optical trapping system based on the zero order phase contrast technique may offer significant advantages over mechanically-complex, alignment-sensitive optical trapping systems, and over technologies that, though similar, require the customization of optics components. However, to our knowledge, such a system has not been yet implemented experimentally. We have developed, as a proof of principle, what we think is the first system based on the zero order phase contrast technique to successfully generate multiple optical traps. This Fourier optics technique makes use of existing concepts of Zernike phase contrast and two-pixel encoding techniques to generate intensity patterns in the image plane that are directly related to phase distributions in the input plane, which is comprised by a spatial light modulator (SLM). This master\'s dissertation describes in detail the steps taken towards using the structured light fields generated by a zero order phase contrast system to trap 2 µm diameter fused silica beads. We present the theoretical foundations of optical trapping and the zero order phase contrast technique, followed by the implementation of independent laboratory experiments in each modality, and finally integrate both systems into a single optical setup for multi-beam trapping. In spite of the low optical efficiency of the system, we were able to implement dual optical traps. We finalize by discussing in detail the limitations of our experimental setup in and comment on potential improvements to increase the stiffness of the optical traps and the overall quality of the system.

Este trabalho é uma contribuição às análises de forças de aprisionamento óptico exercidas sobre partículas esféricas por superposições discretas de feixes de Bessel. Um estudo teórico-numérico foi realizado no regime de óptica geométrica, completando as pesquisas já realizadas com tais feixes e no caso escalar, tanto no regime de Rayleigh quanto através de um formalismo eletromagnético completo. Investigam-se padrões longitudinais de intensidade de possível interesse prático, com potenciais de fornecer múltiplas armadilhas ópticas simultâneas utilizando dois métodos de análise. O primeiro parte da observação de que no regime paraxial todos os raios associados aos feixes se encontram quase paralelos entre si quando se toma como aproximação uma superposição de raios paralelos que incidem completamente sobre um hemisfério do espalhador. Tal método, entretanto, é naturalmente restrito pelas forças transversais. O segundo, que torna mais confiáveis e precisas as predições acerca da componente longitudinal de força, adota procedimentos mais robustos que levam em consideração tanto a contribuição da pressão de radiação (força de espalhamento) quanto a força gradiente devido a gradientes locais de intensidade associados a raios não-paralelos. Assim, acredita-se que este trabalho traz como contribuição um reforço a esta classe específica e promissora de feixes não difrativos como feixes de luz interessantes para aplicações em aprisionamento e micromanipulação óptica. / This work is a contribution to the analyses of optical trapping forces exerted on spherical particles by discrete superpositions of Bessel beams. A theoretical-numerical study has been carried out in the ray optics regime, completing the pre-existing research performed with such beams, in the scalar case, both in the Rayleigh regime and through a complete electromagnetic formalism. We investigate longitudinal intensity patterns of possible practical interest with potential to provide multiple simultaneous optical traps, by using two methods of analysis. The first assumes that, in the paraxial regime, all rays associated to the beams are almost parallel to each other, taking a superposition of parallel rays that are completely incident on a hemisphere of the scatterer as a suitable approximation. Such a method, however, is naturally constrained by the transverse forces. The second one, which makes the predictions about the longitudinal force component more reliable and accurate, adopts more robust procedures that take into consideration the contribution of the radiation pressure (scattering force) as well as the gradient force due to local intensity gradients associated to non-parallel rays. Thus it is hoped that this work will contribute to reinforce this specific and promising class of non-diffractive beams as interesting light beams for applications in optical trapping and micromanipulation.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:35:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 5613341 bytes, checksum: b10dc863b3516fce568d5d4513b2ee67 (MD5) Previous issue date: 2012-02-17 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / In this work, by using the optical tweezers technique, it was possible to study the changes on the mechanical properties of DNA - cisplatin complexes, as a function of some parameters such as the drug diffusion time and its concentration in the sample. A model was proposed in order to explain the behavior of the persistent length as a function of drug concentration, using only the data obtained from single molecule stretching experiments. Such analysis allow us to show that cisplatin binds cooperatively to the DNA molecule. In addition, DNA molecule compactation by the action of the drug, was characterized from studying the kinetics of some mechanical properties such as the radius of gyration and the maximum average end - to - end distance. / Neste trabalho, utilizando a técnica de pinçamento óptico, foi possível estudar as mudanças nas propriedades mecânicas dos complexos DNA - cisplatina, em função de alguns parâmetros de interesse, tais como: o tempo de difusão do fármaco e a concentração do fármaco na amostra. Um modelo foi proposto para explicar o comportamento do comprimento de persistência em função da concentração do fármaco, utilizando-se apenas os dados obtidos a partir dos experimentos de estiramento. Tal análise nos permitiu mostrar que a cisplatina se liga cooperativamente à molécula de DNA. Além disso, a compactação da molécula de DNA pela ação da cisplatina foi caracterizada a partir do estudo da cinética de algumas propriedades mecânicas, tais como: o raio de giro e a distância máxima ponta - à - ponta dos complexos.

Este trabalho é uma contribuição às análises de forças de aprisionamento óptico exercidas sobre partículas esféricas por superposições discretas de feixes de Bessel. Um estudo teórico-numérico foi realizado no regime de óptica geométrica, completando as pesquisas já realizadas com tais feixes e no caso escalar, tanto no regime de Rayleigh quanto através de um formalismo eletromagnético completo. Investigam-se padrões longitudinais de intensidade de possível interesse prático, com potenciais de fornecer múltiplas armadilhas ópticas simultâneas utilizando dois métodos de análise. O primeiro parte da observação de que no regime paraxial todos os raios associados aos feixes se encontram quase paralelos entre si quando se toma como aproximação uma superposição de raios paralelos que incidem completamente sobre um hemisfério do espalhador. Tal método, entretanto, é naturalmente restrito pelas forças transversais. O segundo, que torna mais confiáveis e precisas as predições acerca da componente longitudinal de força, adota procedimentos mais robustos que levam em consideração tanto a contribuição da pressão de radiação (força de espalhamento) quanto a força gradiente devido a gradientes locais de intensidade associados a raios não-paralelos. Assim, acredita-se que este trabalho traz como contribuição um reforço a esta classe específica e promissora de feixes não difrativos como feixes de luz interessantes para aplicações em aprisionamento e micromanipulação óptica. / This work is a contribution to the analyses of optical trapping forces exerted on spherical particles by discrete superpositions of Bessel beams. A theoretical-numerical study has been carried out in the ray optics regime, completing the pre-existing research performed with such beams, in the scalar case, both in the Rayleigh regime and through a complete electromagnetic formalism. We investigate longitudinal intensity patterns of possible practical interest with potential to provide multiple simultaneous optical traps, by using two methods of analysis. The first assumes that, in the paraxial regime, all rays associated to the beams are almost parallel to each other, taking a superposition of parallel rays that are completely incident on a hemisphere of the scatterer as a suitable approximation. Such a method, however, is naturally constrained by the transverse forces. The second one, which makes the predictions about the longitudinal force component more reliable and accurate, adopts more robust procedures that take into consideration the contribution of the radiation pressure (scattering force) as well as the gradient force due to local intensity gradients associated to non-parallel rays. Thus it is hoped that this work will contribute to reinforce this specific and promising class of non-diffractive beams as interesting light beams for applications in optical trapping and micromanipulation.

Um sistema multi-feixe de pinças ópticas baseado na técnica de contraste de fase da ordem zero pode apresentar vantagens significativas sobre sistemas mecanicamente complexos e sensíveis ao alinhamento, e sobre tecnologias que, apesar de serem similares, requerem a customização de componentes ópticos. Porém, ao nosso conhecimento, este sistema até agora não tem sido implementado experimentalmente. Neste trabalho tem-se desenvolvido, como prova de princípio, o primeiro sistema baseado na técnica de contraste de fase da ordem zero gerador de múltiplas pinças ópticas. Esta técnica da óptica de Fourier utiliza conceitos do contraste de fase de Zernike e técnicas de codificação de dois pixels para gerar padrões de intensidade no plano da imagem que são diretamente relacionados a distribuições de fase no plano de entrada do sistema, o qual é formado por um modulador espacial de luz (SLM). Esta dissertação de mestrado descreve detalhadamente os passos tomados com o propósito de utilizar os campos estruturados de luz gerados pelo sistema de contraste de fase da ordem zero para aprisionar esferas de 2 µm de diâmetro de sílica fundida. Neste trabalho apresentamos os fundamentos teóricos do aprisionamento óptico e da técnica de contraste de fase da ordem zero, seguidos pela implementação de experimentos independentes em cada modalidade, e finalmente apresentamos a integração de ambos os sistemas dentro um sistema único de pinças ópticas multi-feixe. Apesar da baixa eficiência óptica do sistema, foi possível implementar um sistema de pinças ópticas duplas. Finalizamos o nosso trabalho na discussão detalhada das limitações do nosso arranjo óptico e comentamos sobre potenciais melhorias para aumentar a rigidez das pinças ópticas e a qualidade geral do sistema. / A multi-beam optical trapping system based on the zero order phase contrast technique may offer significant advantages over mechanically-complex, alignment-sensitive optical trapping systems, and over technologies that, though similar, require the customization of optics components. However, to our knowledge, such a system has not been yet implemented experimentally. We have developed, as a proof of principle, what we think is the first system based on the zero order phase contrast technique to successfully generate multiple optical traps. This Fourier optics technique makes use of existing concepts of Zernike phase contrast and two-pixel encoding techniques to generate intensity patterns in the image plane that are directly related to phase distributions in the input plane, which is comprised by a spatial light modulator (SLM). This master\'s dissertation describes in detail the steps taken towards using the structured light fields generated by a zero order phase contrast system to trap 2 µm diameter fused silica beads. We present the theoretical foundations of optical trapping and the zero order phase contrast technique, followed by the implementation of independent laboratory experiments in each modality, and finally integrate both systems into a single optical setup for multi-beam trapping. In spite of the low optical efficiency of the system, we were able to implement dual optical traps. We finalize by discussing in detail the limitations of our experimental setup in and comment on potential improvements to increase the stiffness of the optical traps and the overall quality of the system.