Tesis para optar al grado académico de Magíster en Ciencias de la Acuicultura / La piscirickettsiosis es una enfermedad que afecta principalmente a salmónidos y cuyo agente etiológico es Piscirickettsia salmonis y que fue descubierto por primera vez en el salmón coho (Oncorhynchus kisutch) en 1989 en Chile (Fryer et al., 1990). Es un agente bacteriano, gramnegativo, intracelular facultativo (Karatas et al., 2008), aeróbico y altamente patógeno (Fryer y Hedrick, 2003). Morfológicamente corresponde a un microorganismo inmóvil, sin cápsula, pleomórfico, habitualmente cocoide, que se encuentra en forma de pares o en anillo y de un tamaño que varía entre 0,5 y 1,5 μm de diámetro (Fryer et al., 1990, Cvitanich et al., 1991). Mediante microscopía electrónica se ha observado que el agente posee en la superficie dos capas: una membrana externa ondulada que forma parte de la pared celular y una membrana interna citoplasmática (Fryer et al., 1990). Se relaciona filogenéticamente con el género Coxiella y Francisella y se agrupa con la subdivisión Gamma de las proteobacterias. Piscirickettsia salmonis se ha detectado en el salmón coho, salmón rey (O. tshawytscha), salmón japonés (O. masou), trucha arcoíris (O. mykiss), salmón rosado (O. gorbuscha) y salmón del Atlántico (Salmo salar) (Fryer et al., 1992). Cuando la enfermedad fue recién descrita se describió una mortalidad en las jaulas de engorda de entre un 30% a un 90% entre los salmones criados en Chile (Bravo y Campos, 1989).

Doctor en Ciencias mención Microbiología / Piscirickettsia salmonis es una bacteria patógena intracelular facultativa que causa la Septicemia Rickettsial de Salmónidos (SRS). Esta bacteria coloniza diversos tejidos y órganos, lo que culmina con la septicemia y muerte del animal. Es capaz de sobrevivir al interior de macrófagos, y se multiplica en ellos al interior de vacuolas replicativas unidas a la membrana celular. Esta forma de replicación es similar a la observada en bacterias relacionadas filogenéticamente, como las del género Francisella, Coxiella y Legionella. Los patógenos de estos géneros además comparten la presencia de plásmidos que se relacionan con la virulencia de la cepa que los posee, y codifican factores de virulencia (FdeV) como el sistema de secreción Dot/Icm, el cual ha sido descrito en P. salmonis. Mediante secuenciación, se han identificado de plásmidos en P. salmonis, cuya función no ha sido estudiada. En este trabajo se analizaron las secuencias codificantes contenidas en 4 plásmidos de P. salmonis LF-89, se identificaron genes de replicación y mantención, profagos, sistemas toxina-antitoxina, y FdeV. Estos probables FdeV tienen homólogos en todas las cepas secuenciadas de P. salmonis y se expresan en condiciones de infección en cultivos celulares SHK-1 y ASK derivados de Salmo salar y en cultivos primarios de riñón (CPR) de pez cebra (Danio rerio), utilizado como un modelo alternativo de infección. En todos ellos P. salmonis fue capaz de infectar, disminuyó la viabilidad celular y permaneció por al menos 12 días al interior de las líneas celulares, y 5 días en los CPR, según se observó por inmunofluorescencia. En las células de salmón, la bacteria causó un aumento en la expresión de il8, il10 e il12, y una disminución en los transcritos de ifn-γ, generando un ambiente antiinflamatorio. En los CPR infectados, generó un ambiente proinflamatorio producto de un aumento de la expresión de il6, ifn-γ y nos2a, aunque también se observó replicación de P. salmonis en ellos. Esto sugiere que los cultivos celulares responden de forma distinta a la infección por esta bacteria. En P. salmonis aumentó la expresión de genes relacionados sistemas de secreción (Dot/Icm y posiblemente la maquinaria del flagelo), toxinas y proteínas secretadas y genes plasmidiales, lo que indica que los plásmidos cumplen un rol en la infección bacteriana. Destacó la sobreexpresión de 3 copias pipB2, y la expresión diferencial de ficD, que aumentó significativamente sólo en células SHK-1, lo que se correlaciona con la formación de grandes vacuolas citoplasmáticas sólo en este tipo celular. / Piscirickettsia salmonis is a facultative intracellular pathogen, and the etiological agent of Salmonid Rickettsial Septicemia (SRS). This bacterium colonizes fish tissues and organs, causing septicemia and death of the animal. P. salmonis is able to survive inside the macrophages, and replicates in citoplasmic vacuoles attached to the cell membrane. This form of replication is similar to that observed in phylogenetically related bacteria, such as Francisella, Coxiella and Legionella. Pathogens of these genera also contains plasmids that are implicated in the virulence of the strain. These plasmids encode virulence factors (VF) such as the Dot / Icm secretion system, which has been also described in P. salmonis. After long read sequencing of P. salmonis genome, four distinct plasmid sequences were predicted in P. salmonis LF-89 strain, but their function is unknown. In this work, we analyzed the coding sequences of P. salmonis LF-89 plasmids and identified replication and maintenance genes, profagos, toxin-antitoxin systems, and VFs. Homologous genes were identified in all P. salmonis sequenced strains and the putative VFs were expressed in infected salmon cells (SHK-1 and ASK cultures), and in infected primary cell cultures derived from zebrafish kidney (ZFPCC), used as an alternative infection model. In those cultured cell types, P. salmonis was able to infect, decreased cell viability and remained inside the cells for at least 12 days for the cell lines, and 5 days for the ZFPCC, as observed by immunofluorescence assays. In salmon cells, the bacterium caused an increase expression of il8, il10 and il12, and a down-regulation of ifn-γ, generating an anti-inflammatory environment. Although bacterial replication occured in the infected ZFPCC, P. salmonis generated a proinflammatory environment, as a result of the up-regulation of il6, ifn-γ and nos2a. This suggests that cell cultures respond in different ways to P. salmonis infection. During infection, genes related to secretion systems (Dot / Icm and possibly the flagellum structure), toxins and secreted proteins and plasmid genes were overexpressed in the bacteria. These results suggests that P. salmonis plasmids have an important role in bacterial infection. In particular, the overexpression of three pipB2 gene copies, and the differential expression of ficD, which increased significantly only in SHK-1 cells, correlates with the formation of large cytoplasmic vacuoles that took place only in this cell type. / • Beca de Doctorado Nacional CONICYT año 2013, número 21130717, Becas complementarias Pasantía en el Extranjero, y beneficios adicionales de Gastos Operacionales y Extensión de Beca. • Proyecto Fondecyt 1120209 a cargo del Dr. Francisco P. Chávez. • Proyecto Fondecyt 1160802 a cargo de la Dra. Verónica Cambiazo. • FONDAP 15090007, Centro de Regulación del Genoma (CRG). / diciembre 2018

No description available.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / En la presente Memoria de Título se utilizó el método "dot-blot" asociado a quimioluminiscencia para determinar la cinética de infección de dos cepas de Piscirickettsia salmonis en ovas de trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss). Debido a que no existía información bibliográfica acerca de la utilización del método "dot blot" para detectar la infección de las ovas con P. salmonis, fue necesario estandarizar la técnica, por lo cual se realizaron distintos experimentos para ver la especificidad de los anticuerpos, la sensibilidad del método, el efecto de la desnaturalización de las muestras y la dilución más adecuada de los anticuerpos. Se realizó el experimento de cinética en ovas de trucha arco iris (O. mykiss) utilizando los tiempos de 1, 3, 5, 10, 30 y 60 minutos. Las ovas se depositaron individualmente en tubos Eppendorf, a los cuales se les agregó 400 micro L de inóculo bacteriano (sobrenadante de cultivo celular con aproximadamente 100% de efecto citopático). Se utilizaron 2 grupos de ovas por cada tiempo, uno de ellos se cultivó con la cepa LF-89 y el otro con la cepa SLGO-95. La reacción fue detenida mediante la eliminación del inóculo y dos lavados con solución "buffer" PBS pH 7,2. Posteriormente las ovas fueron congeladas a -70 grados C hasta su procesamiento. Se utilizaron además dos grupos controles (5 y 60 min), que corresponden a ovas que se incubaron con 500 micro L de MEM. Las ovas fueron homogeneizadas para realizar la metodología "dot-blot". Las películas obtenidas fueron escaneadas y evaluadas mediante densitometría por un "software" computacional. Los resultados indican reacción positiva a partir del primer tiempo estudiado para ambas cepas, la que se mantiene hasta el último tiempo estudiado. El análisis densitométrico señala que la reacción aumenta a medida que transcurre el tiempo, entregando una señal proporcionalmente más alta para SLGO-95 que para LF-89, lo que es concordante con estudios de virulencia en peces que señalan que esta cepa produce mortalidades más altas y más tempranas. Además los resultados apoyan la vía vertical de transmisión

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / En el presente estudio se investigó la factibilidad de establecer una fase sólida para realizar un ELISA con el fin de detectar anticuerpos contra Piscirickettsia salmonis. Se realizaron varias etapas en el protocolo de purificación, para la obtención del antígeno. Se obtuvo un antígeno soluble de P. salmonis mediante extracción salina, se realizaron centrifugaciones y se liofilizó la muestra, obteniendo 567 g de antígeno, de los cuales se detectó una cantidad de 0,1 mg de proteína. En las condiciones del ensayo se utilizaron dos tipos de placas, dos tampones de sensibilización y se realizaron incubaciones a diferentes temperaturas. Para el desarrollo de la prueba de ELISA se utilizó una mezcla de anticuerpos monoclonales específicos contra P. salmonis y un antisuero conjugado de cabra anti-ratón. Como resultados, se obtuvieron reacciones negativas en todos los casos, sin haber alcanzado la razón de adsorción mínima para darle significancia al resultado; sin embargo, existió reacción colorimétrica visible en aquellas muestras procesadas en placas NUNC 69620, incubadas a temperatura ambiente, con tampón de sensibilización carbonato-bicarbonato con pH 9,6; por lo que se podría deducir que entre todos los procedimientos, este último protocolo podría ser el de elección. Como conclusión se establece que, bajo los protocolos realizados y con las concentraciones antigénicas utilizadas, no fue posible comprobar la adhesión de antígenos de Piscirickettsia salmonis a las placas, no pudiéndose establecer una fase sólida para el diagnóstico de esta bacteria por medio de la detección de anticuerpos..

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Un total de 2.461 individuos de Salmón del Atlántico (Salmo salar), de 29 familias de propios hermanos, con aproximadamente 85 individuos por familia en etapa de pre-smolt fueron desafiados con la bacteria Piscirickettsia salmonis para inducir la enfermedad piscirickettsiosis (SRS). El análisis se realizó definiendo la sobrevivencia a la enfermedad como una característica binaria mediante un modelo binario (MB) y como la respuesta binaria a una suma de factores de efecto desconocido que se comportan según una curva de distribución normal, llamado modelo umbral (MU). El principal parámetro que se obtuvo fue la heredabilidad la que se definió como la capacidad de sobrevivir frente al desafío con el agente patógeno. Además se calculó la respuesta a la selección, definiéndose como la disminución de la mortalidad poblacional debido a la infección con el patógeno. La heredabilidad y la respuesta a la selección fueron analizadas con ambos modelos al día 30, 40 y 51 obteniéndose heredabilidades de entre 0,195 a 0,25 para el modelo binario y de entre 0,457 a 0,417 para el modelo umbral; mientras que la respuesta a la selección con el modelo binario fue entre -0,019 y -0,066 y para el modelo umbral varió entre -0,082 y -0,179. Estos resultados llevan a pensar que un programa genético tendiente a seleccionar la población por su capacidad genética para resistir la piscirickettsiosis, tendría una efectividad considerable y podría ser una buena alternativa para aumentar la competitividad de la industria salmonícola nacional / Proyecto Corfo-Innova (05CT6 PP-10)

Submitted by HELSI MARIA ISIDRO CRISTOBAL null (helmar2009@live.com.mx) on 2017-10-25T12:25:09Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_Helsi_final.pdf: 975344 bytes, checksum: bb2e31aa42ebcacbcd49b7790b75ac33 (MD5) / Approved for entry into archive by Monique Sasaki (sayumi_sasaki@hotmail.com) on 2017-10-31T15:36:17Z (GMT) No. of bitstreams: 1 cristobal_hmi_me_jabo.pdf: 975344 bytes, checksum: bb2e31aa42ebcacbcd49b7790b75ac33 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-31T15:36:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 cristobal_hmi_me_jabo.pdf: 975344 bytes, checksum: bb2e31aa42ebcacbcd49b7790b75ac33 (MD5) Previous issue date: 2017-09-26 / Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) / Os programas de melhoramento em espécies aquícolas apresentam, no geral, um número restrito de famílias e um pequeno tamanho efetivo populacional, levando ao acasalamento de animais aparentados e, consequentemente, ao aumento da endogamia. Por sua vez, maiores níveis de endogamia tendem a ocasionar queda no desempenho dos animais causada pela depressão endogâmica. O objetivo deste estudo foi estimar os níveis de endogamia e depressão endogâmica sobre as características de peso à despesca, comprimento à despesca e resistência a Piscirickettsia salmonis em uma população de salmão coho. A resistência a Piscirickettsia salmonis foi definida como o dia da morte de cada peixe após desafio conduzido em dois anos, com média de 42 dias em 2012 e 14 dias no ano de 2014. Foi utilizado um banco de dados composto por 53.504 observações, provenientes de nove gerações e 930 famílias. A estimação dos componentes de variância e endogamia foram obtidas utilizando o programa computacional AIREMLF90 e os valores de depressão endogâmica foram estimados a partir de um modelo animal. Os valores observados para o coeficiente de endogamia foram crescentes ao longo das gerações, com uma taxa média máxima de 8,75% no ano de 2014. A depressão endogâmica afetou em maior nível as características de peso à despesca e dia de morte, com redução de 6,4 e 9,2% no desempenho dos animais, respectivamente, para o nível máximo de endogamia observado (30%). Os resultados indicam a necessidade de uso de estratégias mais efetivas de controle da endogamia para a manutenção do progresso genético do programa de melhoramento de salmão coho. / Aquaculture breeding programs present, in general, low number of families and reduced effective population size, resulting in mating of related animals and, consequently, increased level of inbreeding. High inbreeding coefficient may negatively impact the animals’ performance due to inbreeding depression. The objective of this study was to estimate inbreeding coefficient and inbreeding depression on growth traits and resistance against Piscirickettsia salmonis in a coho salmon population. Resistance against P. salmonis was defined as days to death of each fish after being challenged in two different years, with an average of 42 days in 2012 and 14 days in 2014. Data of 53,504 animals from 930 families was analyzed. Variance components were estimated using the software AIREMLF90, and inbreeding depression was estimated under an animal model. An increasing rate of inbreeding was observed, attaining an average of 8.75% in 2014. Inbreeding depression was more pronounced for harvest weight (PD) and days to death (DM), in comparison with harvest length. At the highest observed inbreeding level (30%), the estimated reduction caused by inbreeding depression was equal to 6,4% for PD and 9,2% for DM. The results indicate the necessity to control inbreeding more effectively for the studied coho salmon population, to guarantee genetic progress in the long term. / CONACYT: 579741/410470