En este trabajo se evaluó la respuesta inmunitaria temprana, desencadenada por la exposición a diversos inmunógenos, en dos especies de teleósteos habituales en la práctica de la piscicultura en la península, la trucha (Oncorhynchus mykiss), un salmoniforme protacantopterigio primitivo y la dorada (Sparus aurata), un perciforme moderno, mediante análisis estadístico de la expresión genética y ontológico de las categorías funcionales descriptivas de la expresión de los transcriptomas renal, hepático y branquial. Para ello se utilizaron dos versiones de una plataforma de micromatriz de ADNc diseñada específicamente para salmónidos. Para la valoración de la respuesta defensiva en las truchas expuestas a infecciones virales y bacterianas se utilizó la plataforma de micromatriz SFM 1.0, enriquecida con genes implicados en las respuestas metabólicas e inmunitarias, empleada en análisis previos ecotoxicológicos y que aquí se validó desde el punto de vista de la eficiencia en la detección del transcriptoma inmunitario en condiciones de carga alostática patológica. Para el análisis de la respuesta de la dorada a una dieta inmunoestimulante se utilizó una variante de la misma, la plataforma SFA 2.0 enriquecida con un mayor número de genes relacionados con la respuesta inmunitaria, apoptosis y comunicación celular y cuya eficiencia en la valoración de los cambios transcriptómicos del inmunoma sometido a intrusión viral se ha validado recientemente en diversos estudios con salmónidos. En este caso la respuesta transcriptómica debida a la hibridación cruzada entre los transcritos de salmónido y dorada se analizó teniendo en cuenta el número de genes expresados diferencialmente, la intensidad de su expresión y la adscripción a categorías funcionales específicas mediante análisis ontológico. La respuesta inmunitaria temprana (24-72 horas) de truchas expuestas a lipopolisacárido bacteriano (LPS) y formas atenuadas y activas del virus IHN, responsable de la necrosis hematopoyética infecciosa, se valoró en el riñón cefálico, el principal órgano hematopoyético de los teleósteos, y la respuesta de fase aguda debida a la exposición a LPS se analizó comparativamente entre el riñón cefálico y el hígado, el órgano responsable de la síntesis de proteínas de fase aguda en situaciones de inflamación. En ambos casos se utilizó un modelo, adaptado a la experimentación con teleósteos, análogo a la peritonitis murina causada por inoculación intraperitoneal de inmunógenos, debido a la descripción precisa que del mismo se tiene en la actualidad en los mamíferos, lo que facilita el estudio comparativo de la respuesta inmunitaria en los teleósteos. El tono e intensidad de la respuesta inmunitaria en la dorada se evaluaron mediante la administración oral continuada durante cuatro semanas de una dieta inmunoestimulante enriquecida con extractos de levadura y vitaminas antioxidantes (C y E), y sus efectos se valoraron comparativamente en el riñón cefálico y las branquias, estas útlimas de reconocida diversidad funcional e interfase preeminente entre los medios interno y externo al animal. / The early immune response to several immunogens was assessed in two commercial fish species, the rainbow trout (Oncorhynchus mykiss), a primitive prothacanthopterygian salmonid and the gilthead seabream (Sparus aurata), a modern perciform, using a salmonid-specifric cDNA microarray. The statistical analysis of gene expression and functional gene ontology (GO) categories of expressed genes were carried out on the renal, branchial and hepatic transcriptomes of challenged fish. A salmonid-specific microarray platform (SFM 1.0), previously used in ecotoxicological studies and enriched with genes related with metabolic and immune responses, was used to evaluate the alostatic alterations in the immune transcriptome of infected fish. A related salmonid-specific microarray platform (SFA 2.0), previously used in studies of viral-induced immune dysfunction in salmonids, and enriched with genes related with the immune responses, apoptosis and cell communication processes, was used to evaluate the response of seabream to the administration of an immunoestimulant diet. The performance of the SFA 2.0 platform was evaluated using the number and expression levels of differentially expressed genes in parallel with the GO analysis of specific functional categories.The response of the trout to bacterial lipopolysaccharide (LPS) or active and attenuated infectious hematopoietic necrosis virus (IHNV) intraperitoneal challenge, 24 and 72 hours post-injection, was investigated in the head kidney, a major haematopoietic organ in teleosts. The acute phase response was assessed in the liver of LPS-stimulated trout, using a modified protocol of the classical murine experimental peritoneal inflammation. The intensity of the seabream immune response to repeated (four weeks) oral administration of immunostimulant diets supplemented with yeast extracts and antioxidant vitamins (C and E) was investigated in the head kidney and the branchia, a multifunctional organ and one of the most important portals of entry in fish.

Carbofuran and chlorpyrifos are two well-known pesticides widely investigated, and its effects on different organisms have been previously reported in separate studies. For this reason were considered to be good model subtances, relevant from the environmental perspective. On the other hand, we selected this kind of compounds because they are used in many tones annually in agriculture and horticulture and they are significant especially in greenhouse-based production of vegetables and fruits in southern Europe, particularly Spain.The general objective of this work was to compare the response of in vitro assays using cell lines with assays using fish in vivo in order to contribute to the development of alternative methods to the use of laboratory animals. Furthermore, we compared two types of cells, a fish cell line from an established culture and mammalian cells obtained from a primary cell culture, in order to see if there are similar responses based on common mechanisms of toxicity. A better knowledge of these mechanisms facilitates the interspecies extrapolation of the impact of environmental contaminants, which is one of the major challenges to ecotoxicologists.In order to have a general point of view of the toxicity of these pesticides, single and in mixture, acute toxicity was evaluated using a battery of ecotoxicological model systems and indicators representative of a wide range of organisms. The systems studied included: RTG-2 fish cell line, primary cell cultures from bovine granulosa cells, the marine bacteria (Vibrio fischeri), three species of freshwater microalgae (Chlorella vulgaris, Scenedesmus subspicatus and Selenastrum capricornutum) and the vertebrates zebra fish (Danio rerio). Sublethal effects were also evaluated in both types of cells using several biomarkers such as assessment of the DNA damage as genotoxic indicator, inhibition of production of progesterone as indicator of the aromatase activity and inhibiton of acetylcholinesterase activity as indicator of exposure to pesticides measured also in zebra fish. By comparing the obtained in vitro fish cell line and mammalian primary cell cultures results with currently used bacteria, algae and fish acute toxicity tests, it was possible to compare its sensitivity against these conventional toxicity tests. As conclusions of the study we can say: 1) fish cell lines can be used as an alternative to the use of fish in laboratory; 2) the simultaneous use of in vitro fish cell lines with fish species allow to assess whether cellular responses in vitro could mimic toxicity responses of individual fish, thus to directly assess the ecological relevance of the proposed in vitro cell based test; 3) cell lines are the most sensitive bioassay of the studied battery; 4) the use of a battery of multispecies tests to determine the toxicity of any product is recommended; 5) The aquatic test using bacteria or microalgae are quite interesting, but they cannot be considered as a substitute for the studies on fish, because of they assess the effect of toxicants on other trophic levels, not on fish and 6) synergistic and antagonistic toxicity effects were observed with pesticide cocktails relative to pure compound toxicities. / Carbofuran i chlorpyrifos són dos pesticides àmpliament investigats. Els seus efectes en diferents organismes han estat prèviament estudiats en diferents treballs. Per aquesta raó es va considerar que serien bones substàncies model, rellevants des de una perspectiva medi ambiental. Per altra banda, aquesta classe de compostos són utilitzats anualment en moltes tones en agricultura i horticultura i són especialment importants en la producció de vegetals i fruites en hivernacles en el sud d'Europa, particularment en Espanya. L'objectiu general d'aquest treball és comparar la resposta de assaigs in vitro utilitzant cèl·lules amb assaigs in vivo utilitzant peixos, per tal de contribuir al desenvolupament de mètodes alternatius a l'ús d'animals de laboratori. A més a més dintre dels assaigs in vitro, és van comparar dos tipus de cèl·lules, una línia cel·lular establerta de peix i un cultiu primari de cèl·lules de mamífer, per veure les diferents respostes basades en mecanismes comuns de toxicitat. El fet d'assolir un millor coneixement d'aquestos mecanismes facilita l'extrapolació entre espècies per l'avaluació de l'impacte de contaminants medi ambientals, la qual cosa és un dels majors reptes dels ecotoxicolegs.La toxicitat aguda d'aquestos pesticides, individuals i en barreja, es va avaluar emprant una barreja de sistemes i indicadors de models ecotoxicològics . Els sistemes estudiats inclouen: la línia cel·lular RTG-2 , cultius primaris de cèl·lules de la granulosa d'ovaris de bovins, la bactèria marina Vibrio fischeri, tres espècies de microalgues, Chlorella vulgaris, Scenedesmus susbspicatus i Selenastrum capricornutum i com a model de vertebrat, el peix zebrafish, Danio rerio. Els efectes subletals també van ser avaluats en els dos tipus cel·lulars utilitzant biomarcadors, tals com l'avaluació del dany a l'ADN com indicador genotòxic, la inhibició de la producció de progesterona com indicador de l'activitat de l'aromatasa i la inhibició de la activitat de l'enzim acetilcolinestarasa com indicador de l'exposició als pesticides la qual també es va mesurar en zebra fish.Al comparar els resultats obtinguts amb la línia cel·lular de peix i els cultius primaris de mamífer amb els resultats dels tests de toxicitat aguda amb bactèries, microalgues i peixos, va estar possible comparar la sensibilitat de les cèl·lules respecte els test de toxicitat convencionals.Es poden extreure les següents conclusions d'aquest estudi:1) les línies cel·lulars poden ser utilitzades com alternativa al ús de peixos en laboratori; 2) l'utilització simultània de línies cel·lulars derivades de peixos amb peixos in vivo permet avaluar si les respostes in vitro poden imitar les respostes de toxicitat obtingudes amb els peixos, així es permet avaluar la rellevància ecològica del test basat en cèl·lules in vitro; 3) les línies cel·lulars són el bioassaig més sensible dels utilitzats en aquesta bateria; 4) es recomana l'ús d'una bateria de test multiespècies per determinar la toxicitat de qualsevol producte; 5) els tests aquàtics que empren bactèries o microalgues són interessants però no poden considerar-se substitutius dels estudis amb peixos, perquè avaluen l'efecte dels tòxics a un altra nivell tròfic i ; 6) s'observen efectes toxicològics sinèrgics i antagonistes quan s'utilitzen les barreges de pesticides en front dels compostos purs. / Carbofuran y chlorpyrifos son dos pesticidas ampliamente investigados. Sus efectos en diferentes organismos han sido previamente estudiados en diferentes trabajos. Por esta razón se considero que serian unas buenas sustancias modelo, relevantes desde una perspectiva medioambiental. Por otra parte, esta clase de compuestos son utilizados anualmente en muchas toneladas en agricultura y horticultura y son especialmente importantes en la producción de vegetales y frutas en invernaderos en e l sur de Europa, particularmente en España.El objetivo general de este trabajo es comparar la respuesta de los ensayos in vitro utilizando células y los ensayos in vivo utilizando peces, para contribuir al desarrollo de métodos alternativos al uso de animales de laboratorio. Además dentro de los estudios in vitro se compararon dos tipos de células, una línea celular establecida de pez y un cultivo primario de células de mamífero, para ver las diferentes respuestas basadas en mecanismos comunes de toxicidad. El hecho de alcanzar un mejor conocimiento de estos mecanismos facilita la extrapolación entre especies para la evaluación del impacto de contaminantes medio ambientales, lo cual es uno de los mayores retos de los ecotoxicólogos.La toxicidad aguda de estos pesticidas, individuales y en mezcla, se evaluó utilizando una mezcla de sistemas y indicadores de modelos ecotoxicológicos. Los sistemas estudiados incluyen: la línea celular RTG-2, cultivos primarios de células de granulosa de ovarios bovinos, la bacteria marina Vibrio fischeri, tres especies de microalgas, Chlorella vulgaris, Scenedesmus subspicatus y Selenastrum capricornutum como modelo de vertebrado, el pez zebra fish, Danio rerio. Los efectos subletales también fueron evaluados en los dos tipos celulares utilizando biomarcadores tales como la evaluación del daño al ADN como indicador geonotóxico, la inhibición de la producción de progesterona como indicador de la actividad aromatasa y la inhibición de la actividad del enzima acetilcolinesterasa como indicador de la exposición a los pesticidas la cual también se midió en zebra fish.Al comparar los resultados obtenidos con la línea celular de pez y los cultivos primarios de mamífero con los resultados de los tests de toxicidad aguda con bacterias, microlagas y peces, fue posible comparar la sensibilidad de las células con los test de toxicidad convencionales.Se pueden extraer las siguientes conclusiones de este estudio: 1) las líneas celulares pueden ser utilizadas como alternativa al uso de peces en laboratorio; 2) la utilización simultánea de líneas celulares derivadas de peces con los peces in vivo permite evaluar si las respuestas in vitro pueden imitar las respuestas de toxicidad obtenidas con los peces in vivo, así se permite evaluar la relevancia ecológica del test basado en células in vitro; 3) las líneas celulares son el bioensayo más sensible de los utilizados en esta batería; 4) se recomienda el uso de una batería de test multiespecies para determinar la toxicidad de cualquier producto; 5) los test acuáticos que utilizan bacterias o microalgas son interesantes pero no pueden considerarse substitutos de los estudios con peces, porque evalúan el efecto de los tóxicos a otro nivel trófico y; 6) se observan efectos toxicológicos sinérgicos y antagonistas cuando se utilizan las mezclas de pesticidas respecto los compuestos puros.

Las células dendríticas (DCs) están especializadas en la presentación de antígeno. Sin embargo, las DCs expuestas al virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) también son capaces de transmitir una potente infección citopática a los linfocitos T CD4+, un proceso que frecuentemente se ha relacionado con la capacidad que tiene el receptor DC-SIGN (Dendritic Cell-Specific Intercellular adhesion molecule-3-Grabbing Non-integrin) para unirse de forma específica a la glicoproteína de la envuelta viral. La maduración de las DCs puede aumentar la eficiencia de transmisión del VIH a los linfocitos T CD4+ a través de la trans-infección. Nuestro objetivo en este trabajo ha sido comparar el efecto de la maduración en las células dendríticas derivadas de monocitos (MDDCs) y en las células dendríticas mieloides derivadas de sangre durante el proceso de captura del VIH. Para analizar la captura y transmisión viral a las células diana competentes in vitro de un VIH pseudotipado con envuelta y el virus homólogo replicativo utilizamos las técnicas de detección de p24gag, actividad luciferasa y microscopía electrónica y confocal. Así, observamos que la maduración de las MDDCs o las DCs mieloides aumenta la captura activa del VIH de una forma independiente del receptor DC-SIGN o de la glicoproteína de la envuelta viral, incrementándose también el tiempo de retención del virus capturado. Además, verificamos que la mayor transmisión viral de las DCs maduras (mDCs) a los linfocitos T CD4+ es altamente dependiente de una captura viral activa, un proceso endocítico mediado a través de dominios de membrana enriquecidos en colesterol. Notablemente, mientras que las mDCs concentran el virus capturado en una única vesícula positiva para las tetraspaninas CD63 y CD81, las DCs inmaduras carecen de dichas estructuras, lo que sugiere un proceso de tráfico intracelular viral diferencial en cada tipo celular.Los exosomas son vesículas celulares secretadas que pueden ser internalizadas por las DCs, contribuyendo a la activación específica de antígeno de los linfocitos naive T CD4+. En esta tesis demostramos que el VIH puede explotar esta ruta intrínseca a las mDCs que permite la diseminación de antígenos a través de los exosomas, permitiendo así la trans-infección de los linfocitos T CD4+. Tras la maduración de las DCs, la captura del VIH-1, las partículas pseudovirales VIH-1 Gag-eGFP (VLPs) y los exosomas aumenta significativamente, acumulándose dentro de un compartimento CD81+. La captura de estas partículas se inhibió preincubando las mDCs con las VLPs o los exosomas, lo que sugiere que la expresión de determinantes moleculares comunes en la superficie de las VLPs y los exosomas es necesaria para la internalización mediada por las mDCs. Así mismo, la captura mediada por las mDCs es insensible a un tratamiento proteolítico, pero puede bloquearse cuando los virus, las VLPs o los exosomas se producen en células tratadas con inhibidores de la biosíntesis de los esfingolípidos, que alteran la composición lipídica de las partículas que emergen.Por último, las VLPs y los exosomas capturados por las mDCs se transmiten a los linfocitos T CD4+ de una forma independiente de la glicoproteína de la envuelta viral, resaltando la existencia de una nueva ruta de diseminación viral.En general, estas observaciones ayudan a explicar la mayor capacidad de las mDCs para transmitir el VIH a los linfocitos T CD4+, un proceso que potencialmente puede contribuir a la diseminación viral en los nódulos linfáticos in vivo, donde la replicación viral tiene lugar de forma mayoritaria y hay una interacción continua entre las células T CD4+ susceptibles y las mDCs. / Dendritic cells (DCs) are specialized antigen-presenting cells. However, DCs exposed to human immunodeficiency virus (HIV) are also able to transmit a vigorous cytopathic infection to CD4+ T lymphocytes, a process that has been frequently related to the ability of DC-SIGN (Dendritic Cell-Specific Intercellular adhesion molecule-3-Grabbing Non-integrin) to bind HIV-1 envelope glycoproteins. Maturation of DCs can increase the efficiency of HIV transmission through trans-infection. We aimed to comparatively study the effect of maturation in monocyte derived dendritic cells (MDDCs) and blood-derived myeloid DCs during HIV capture process. In vitro capture and transmission of envelope pseudotyped HIV-1 and its homologous replication competent virus to susceptible target cells was assessed by p24gag detection, luciferase activity, and both confocal and electron microscopy. Maturation of MDDCs or myeloid DCs enhanced active capture of HIV in a DC-SIGN and viral envelope glycoprotein independent manner, increasing the lifespan of trapped virus. Moreover, higher viral transmission of mature DCs (mDCs) to CD4+ T lymphocytes was highly dependent on active viral capture, a process mediated through cholesterol-enriched domains. Mature DCs concentrated captured virus in a single large vesicle staining for CD81 and CD63 tetraspanins, while immature DCs lacked these structures, suggesting different intracellular trafficking processes. Exosomes are secreted cellular vesicles that can be internalized by DCs contributing to antigen specific naive CD4+ T lymphocyte activation. Here, we demonstrate that HIV can exploit this exosome antigen-dissemination pathway intrinsic to mDCs for mediating trans-infection of CD4+ T lymphocytes. Capture of HIV-1, HIV-1 Gag-eGFP viral like particles (VLPs) and exosomes by DCs was upregulated upon maturation, resulting in localization within a CD81+ compartment. Uptake of VLPs or exosomes could be inhibited by a challenge with either particle, suggesting that the expression of common determinant(s) on VLP or exosome surface is necessary for internalization by mDCs. Capture by mDCs was insensitive to proteolysis, but blocked when virus, VLPs, or exosomes were produced from cells treated with sphingolipid biosynthesis inhibitors that modulate the lipid composition of the budding particles. Finally, VLPs and exosomes captured by mDCs were transmitted to CD4+ T lymphocytes in an envelope glycoprotein-independent manner, underscoring a new potential viral dissemination pathway.Overall, these observations help explaining the greater ability of mDCs transferring HIV to CD4+ T lymphocytes, a process that can potentially contribute to the viral dissemination at lymph nodes in vivo, where viral replication takes place and there is a continuous interaction between susceptible T-cells and mDCs.

El diabló de l’avellana, Curculio nucum (L.) (Coleoptera: Curculionidae) és una plaga clau de l’avellaner, responsable de pèrdues important en la collita. Aquest treball pretén estudiar l’efectivitat dels nematodes entomopatògens per controlar C. nucum. Els nematodes entomopatògens pertanyen a les famílies Steinernematidae i Heterorhabditidae. Són paràsits d’insectes que porten associat un bacteri simbiòtic. D’un total de 295 mostres agafades en sòl d’avellaners al NE de la Península Ibérica, en 11 (3,73%) es van aïllar nematodes. Deu steinernemàtids i un heterorhabdítid van ser molecularment identificats com dos S. affine, cinc S. feltiae, dos S. intermedium, un Steinernema sp. i un H. bacteriophora. També es van aïllar fongs entomopatògens en 133 (45,08%) de les mostres, apareixent Metarhizium anisopliae (36,09%) i Beauveria bassiana (42,8%) com les espècies més freqüents. La virulència de vuit d’aquestes espècies de nematodes juntament amb una S. carpocapsae, aïllada en un jardí urbà de Barcelona, contra larves de C. nucum va ser avaluada. La mortalitat de larves deguda als nematodes varià del 10% causat per S. affine i el 78,75% per Steinernema sp. amb diferències significatives. La virulència del bacteri simbiont fou del 100% de mortalitat de larves a excepció de X. bovienii bacteri simbiont de S. affine (93,3%) i X. bovienii de S. feltiae (46,7%). La susceptibilitat de l’adult a quatre espècies de nematodes: S. feltiae, Steinernema sp., S. carpocapsae i H. bacteriophora també va ser avaluada. Els percentatges de mortalitat observats per Steinernema sp., S. feltiae i H. bacteriophora foren 1,7%, 16,7% i 8,3% respectivament, mentre que S. carpocapsae va demostrar ser el nematode més virulent, causant el 100% de mortalitat en l’adult. L’exposició d’adults a S. carpocapsae durant diferents períodes de temps va revelar que 15 minuts són suficients per matar 6,6-17% dels diablons i que el 100% de mortalitat es dóna a partir dels 120-240 minuts d’exposició. Per tal d’estudiar les diferències de susceptibilitat observades entre la larva i l’adult de C. nucum i les diferents espècies de nematodes entomopatògens utilitzats, s’avaluaren la penetració, les vies d’entrada i la resposta immunològica en la larva i l’adult de C. nucum. Els resultats indicaren que la larva és més susceptible a S. feltiae que a S. carpocapsae mentre que els adults foren molt susceptibles a S. carpocapsae. Es va determinar l’anus com a via preferent d’entrada en la larva i l’adult, tant per S. feltiae com per S. carpocapsae. La capacitat de penetració s’observà estar en relació amb la virulència del nematode. Basat en les nostres observacions la resposta immunològica queda descartada com a causa principal per explicar les diferències observades en la susceptibilitat als nematodes entomopatògens de larva i adult. La virulència de sis fongs entomopatògens contra la larva de C. nucum també fou testada. La major mortalitat de larves (80%) fou causada per M. anisopliae. Quan es van aplicar fongs i nematodes entomopatògens de manera combinada no s’observaren efectes antagònics o sinèrgics. Finalment, la persistència i la distribució vertical van ser avaluades en assajos de camp, mostrant que els nematodes foren capaços de persistir un mínim de 9 setmanes després de l’aplicació i que assoliren profunditats de fins a 40 cm. Els nematodes entomopatògens pogueren reduir de forma efectiva la població de C. nucum al camp. Un control eficaç requereix la combinació de diverses estratègies. Una aplicació d’estiu, utilitzant S. feltiae, Steinernema sp. o H. bacteriophora per controlar les larves quan s’enterrin al sòl, i una aplicació de primavera amb les mateixes espècies de nematodes per reduir la població d’insectes hivernants. Una aplicació addicional de primavera amb S. carpocapsae actuarà controlant de manera efectiva tant els adults hivernants com els que emergeixin del terra. / The Hazelnut weevil, Curculio nucum (L.) (Coleoptera: Curculionidae), is a key pest of hazelnuts causing an important economical impact on crop yield. This report summarizes the studies developed to prove the efficacy of entomopathogenic nematodes to control C. nucum. Entomopathogenic nematodes in the Steinernematidae and Heterorhabditidae families are insect lethal parasites with an endosymbiotic bacteria associated. From a total of 295 soil samples taken from hazelnut areas in the NE of the Iberian Peninsula, 11 (3.73%) were positive to entomopathogenic nematodes. Ten steinernematids and one heterorhabditid were molecular identified as two S. affine, five S. feltiae, two S. intermedium, one Steinernema sp. and one H. bacteriophora. Also, entomopathogenic fungi were recovered in 133 (45.08%) of the total samples, being Metarhizium anisopliae (36.09%) and Beauveria bassiana (42.8%) the most frequently isolated. The virulence of eight of these nematode species and strains, together with a S. carpocapsae isolated from an urban garden in Barcelona, was tested against larvae of C. nucum. Larval exposure to entomopathogenic nematodes resulted in mortality between 10% caused by S. affine and 78.75% by Steinernema sp. with significant differences. The virulence of the endosymbiotic bacteria was 100% mortality of larvae except for the X. bovienii belonging to S. affine (93.3%) and X. bovienii belonging to S. feltiae (46.7%). The susceptibility of the adult weevils to four nematodes species: S. feltiae, Steinernema sp., S. carpocapsae and one H. bacteriophora was tested. The mean mortality percentages caused by Steinernema sp., S. feltiae and H. bacteriophora were 1.7%, 16.7% and 8.3% respectively, while S. carpocapsae proved to be the most virulent nematode, causing 100% insect mortality. The adult exposure to S. carpocapsae over different periods of time revealed that 15 minutes were long enough to infect 6.6-17% of the weevils, and adult mortality reached 100% in 120 to 240 minutes of exposure. To assess the observed differences in susceptibility in relation to the insect stage of development and the nematode species used, penetration into the larva and adult of C. nucum, routes of entrance to the insect and insect immune response were evaluated. Results revealed larvae to be more susceptible to S. feltiae than to S. carpocapsae and adults were highly susceptible to S. carpocapsae. The anus was determined as the main entry route of S. carpocapsae and S. feltiae in adult insects and larvae. The penetration rate was found to be related to the nematode virulence. Our findings suggest rejecting the immune system as being responsible for the different susceptibility between larvae and adults. The virulence of six entomopathogenic fungi against larvae of C. nucum was also tested. The highest larvae mortality (reaching 80%) was due to M. anisopliae. When entomopathogenic fungi were applied in combination with entomopathogenic nematodes no antagonistic or synergistic effects were observed. Finally, short-term field persistence and the vertical distribution were assessed showing that nematodes can persist nine weeks after application and that nematodes can reach depths of 40 cm. The entomopathogenic nematodes can effectively reduce C. nucum populations in field. Efficient biocontrol requires a combined strategy. A summer application using S. feltiae, Steinernema sp. or H. bacteriophora to control the larvae when they are burying into the ground and a spring application with same nematodes species to reduce the overwintering larvae population. An additional spring application with S. carpocapsae would effectively control the overwintering and the emerging adults.

L'agent de control biològic (ACB) Candida sake CPA-1 és un llevat que ha demostrat reduir la podridura per B. cinerea (PBC) en collita quan va ser aplicada a camp amb l'additiu Fungicover® (FC) en estudis previs. Objectius: 1) estudiar l'eficàcia dels tractaments de C. sake amb FC, comparant amb altres productes comercials per al control de la PBC i de fonts d'inòcul secundari de B. cinerea (cap. 1, 2, 4 i 6), 2) Avaluar l'efecte d'aquests tractaments biològics sobre la podridura àcida del raïm (Cap. 3); 3) Investigar l'epidemiologia de la PBC en vinyes de climatologia mediterrània (Lleida), determinant els moments més importants durant la campanya per al desenvolupament de B. cinerea (Cap. 2, 5); 4) Avaluar l'efecte dels factors que redueixen la supervivència de C. sake CPA-1 en camp (Cap. 6, 7). Els resultats presentats en aquesta tesi doctoral demostren l'alta eficàcia dels tractaments amb C. sake CPA-1 i FC (82-90% de reducció de la severitat comparat amb el control sense tractar en assaigs à camp), que va ser similar o major que la d'altres productes registrats i en ús, confirmant la fiabilitat i el potencial d'aquests mètodes de control biològics per al control de la PBC en vinya. D’altra banda, s'han obtingut noves dades sobre la supervivència de C. sake i l'epidemiologia de B. cinerea, important per a futurs estudis de control biològic d'aquesta malaltia. Aquesta informació també aporta importants aplicacions pràctiques per optimitzar els tractaments amb C. sake i altres mitjans de control alternatius als fungicides de síntesi. / El agente de control biológico (ACB) Candida sake CPA-1 es una levadura que ha demostrado reducir la podredumber por B. cinerea (PBC) en cosecha cuando fue aplicada en campo junto con el aditivo Fungicover® (FC) en estudios previos. Objetivos: 1) estudiar la eficacia de los tratamientos de C. sake con FC, comparando con otros productos comerciales para el control de la PBC y de fuentes de inóculo secundario de B. cinerea (Cap. 1, 2, 4 y 6); 2) Evaluar el efecto de estos tratamientos biológicos sobre la podredumbre ácida del racimo (Cap. 3); 3) Investigar la epidemiología de la PBC en viñedos de climatología mediterránea (Lleida), determinando los momentos más importantes durante la campaña para el desarrollo de B. cinerea (Cap. 2, 5); 4) Evaluar el efecto de los factores que reducen la supervivencia de C. sake CPA-1 en campo (Cap. 6, 7). Los resultados presentados en la presente tesis doctoral demuestran la alta eficacia de los tratamientos con C. sake CPA-1 y FC (82-90% de reducción de la severidad respecto al control sin tratar en ensayos de campo), que fue similar o mayor que la de otros productos registrados y en uso, confirmando la fiabilidad y el potencial de estos métodos de control biológicos para el control de la PBC en viña. Además, se han obtenido nuevos datos sobre la supervivencia de C. sake y la epidemiología de B. cinerea, importantes para futuros estudios de control biológico de esta enfermedad. Esta información también revela importantes aplicaciones prácticas para optimizar los tratamientos con C. sake y otros medios de control alternativos a los fungicidas de síntesis. / The biocontrol yeast Candida sake CPA-1 had demonstrated to be effective to control BBR applied in combination with Fungicover in previous studies. Objectives: 1) to study and compare the efficacy of C. sake plus FC with other biologically-based treatments against BBR and secondary B. cinerea inoculum sources (Chapters 1, 2, 4 and 6); 2) to test the effect of biologically-based treatments on sour rot of grapes (Chapter 3). Moreover, 3) the epidemiology of B. cinerea in Mediterranean climate vineyards (Lleida) was also studied (Chapters 2, 5), in order to determine the most important phenological stages along the season for B. cinerea development; and lastly, 4) to investigate the effect of the abiotic factors determining the survival of C. sake CPA-1 after field applications (Chapters 6, 7). The results of the present PhD thesis demonstrated the high efficacy of C. sake CPA-1 plus FC treatments (82-90% severity reduction compared to the untreated control in field experiments), which was similar or higher than other commercialised products, confirming the reliability and potential of biologically-based strategies to control BBR. In addition, new data on survival of C. sake and B. cinerea epidemiology have been obtained, important for future research on BCAs and BBR. This information also provided important practical outcomes to optimise field treatments with C. sake and other biologically-based products.

La podridura marró causada per Monilinia spp. és la malaltia de postcollita més important que afecta a la fruita de pinyol. Malgrat que a Espanya s’ha autoritzat de forma excepcional la matèria activa fludioxonil en postcollita de préssec i nectarina, l’aplicació de fungicides en precollita segueix essent imprescindible per a un bon control de la malaltia. No obstant això, en moltes ocasions els nivells de control són insuficients ocasionant importants pèrdues econòmiques al sector. L’objectiu d’aquesta tesi és l’estudi de diferents estratègies per al control de Monilinia spp. en postcollita, concretament, l’ús d’àcid peracètic (PAA), la millora d’un tractament de radiofreqüències (RF) i l’escalfament per microones (MW). Un bany durant 1 min en 300 mg L-1 de PAA va mostrar una elevada eficàcia i aquesta concentració es va reduir fins a 200 mg L-1 a l’aplicar-se en aigua a 40 ºC. La immersió de la fruita en aigua durant el tractament de RF va solucionar tant la manca d’eficàcia observada en nectarines com la influència del calibre del fruit que va mostrar aquest tractament aplicat en aire, reduint a més el temps d’exposició de 18 a 4.5 min. El tractament de MW a 10 kW durant 95 s va presentar una elevada eficàcia, però aquesta eficàcia va dependre del pes de la fruita. En aplicar les microones amb la fruita submergida en aigua a 40 ºC, el tractament a 20 kW durant 60 s va mostrar un elevat control i a més, la seva eficàcia no es va veure afectada pel pes, el temps d’infecció i la concentració d’inòcul. / La podredumbre parda causada por Monilinia spp. es la enfermedad de poscosecha más importante que afecta a la fruta de hueso. A pesar de que en España se ha autorizado de forma excepcional la materia activa fludioxonil en poscosecha de melocotón y nectarina, la aplicación de fungicidas en precosecha sigue siendo imprescindible para un buen control de la enfermedad. Sin embargo, en muchas ocasiones los niveles de control son insuficientes ocasionando importantes pérdidas económicas. El objetivo de esta tesis es el estudio de diferentes estrategias para el control de Monilinia spp. en poscosecha, concretamente, el uso de ácido peracético (PAA), la mejora de un tratamiento de radiofrecuencias (RF) y el calentamiento por microondas (MW). Un baño durante 1 min en 300 mg L-1 de PAA mostró una elevada eficacia y esta concentración se redujo a 200 mg L-1 al aplicarse en agua a 40 ºC. La immersión de la fruta en agua durante el tratamiento de RF solucionó tanto la falta de eficacia observada en nectarinas como la influencia del tamaño de la fruta que mostró este tratamiento aplicado en aire, reduciendo además el tiempo de tratamiento de 18 a 4.5 min. El tratamiento de MW a 10 kW durante 95 s presentó una elevada eficacia, sin embargo, esta dependió del peso de la fruta. Al aplicarse las MW con la fruta sumergida en agua a 40 ºC, el tratamiento a 20 kW durante 60 s mostró un elevado control y además su eficacia no se vio afectada por el peso, el tiempo de infección y la concentració de inóculo. / Brown rot caused by Monilinia spp. is the most important postharvest disease of stone fruit. Although in Spain the use of fludioxonil has been authorized exceptionally in postharvest of peaches and nectarines, the application of fungicides in preharvest remains essential for a good control of this disease. However, many times the level of control is insufficient causing significant economic losses. The objective of this thesis is to study different strategies to control Monilinia spp. in postharvest, specifically, the use of peracetic acid (PAA), the improvement of a radio frequency (RF) treatment and a microwave (MW) heating. Dipping fruit for 1 min in 300 mg L-1 of PAA showed high efficacy and this concentration was reduced to 200 mg L-1 when applied in water at 40 ºC. Immersion of fruit in water during RF treatment solved both the lack of efficacy observed in nectarines as the influence of fruit size that this treatment showed when applied in air and besides, exposure time was reduced from 18 to 4.5 min. The MW treatment at 10 kW for 95 s showed high efficacy, however, this efficacy depended on fruit weight. When MW treatment was applied with fruit immersed in water at 40 ºC, a treatment at 20 kW for 60 s showed high control and moreover, its efficacy was not affected by fruit weight, infection time and inoculum concentration.

L'objectiu principal d'aquesta memòria ha estat estudiar la biologia reproductiva de les Delphineae a la Mediterrània occidental, des de dos vessants diferents: a) la biologia de la pol.linització, analitzant la relació morfologia floral-antòfil, i b) l'estudi dels sistemes reproductius i mecanismes d'aïllament reproductiu.

Thèse (M.Ress.Renouv.) -- Université du Québec à Chicoutimi, 2003. / Bibliogr.: f. 116-131. Document électronique également accessible en format PDF. CaQCU

Th. 3e cycle--Biologie et physiologie végétale--Strasbourg--Université Louis-Pasteur, 1983. / Bibliogr. p. 143-146 . Index.

Thesis--Catholic University of America. / Bibliography: p. 30-32.