A seqüência de nucleotídeos codificante do peptídeo derivado da hidrólise da canatoxina (jaburetox-2Ec), foi clonada e expressa nos sistema pET101/E. coli BL 21. Neste trabalho, estudamos a estabilidade dos plasmídeos da série pET contendo a seqüência codificante do jaburetox-2Ec no sistema de expressão E. coli BL 21 (Mulinari, 2004), e as condições para aumentar produção do peptídeo recombinante, avaliando a velocidade de transferência de oxigênio, o controle do pH, e a utilização da lactose como indutor em substituição ao IPTG. O cultivo da bactéria recombinante em incubadora orbital contendo 10 g/l de lactose como indutor produziu 1,26 μg de jaburetox-2Ec/mg de proteína total após oito horas de cultivo. A estabilidade do plasmídeo e a expressão do peptídeo recombinante foram estudadas em biorreatores. A expressão do jaburetox-2Ec foi fortemente afetada pelo pH da cultura, com a diminuição de mais de 50 % da concentração desse peptídeo quando ocorre acidificação do meio de cultura. Da mesma forma, o aumento da aeração e agitação tem efeito negativo sobre a produção do peptídeo, diminuindo em sete vezes a produção do jaburetox-2Ec Apesar do aumento da biomassa devido ao cultivo da E. coli recombinante em meio mínimo, contendo como fonte de carbono a glicose, isto não representou aumento da concentração do peptídeo recombinante. Contudo, sob a melhor condição de cultivo em biorreator estudada (pH controlado e menor transferência de oxigênio), obteve-se uma produção de 7,14 μg de jaburetox-2Ec/mg de proteína total, representando em torno de 2 % da proteína total da célula. Em todas as bateladas, após atingir a máxima expressão do peptídeo, essa concentração diminui provavelmente devido à atividade das proteases da célula causando a degradação do peptídeo recombinante. A carga metabólica imposta à célula devido à expressão do jaburetox-2Ec, é uma das possíveis causas da instabilidade do plasmídeo observada em todas as bateladas.

A seqüência de nucleotídeos codificante do peptídeo derivado da hidrólise da canatoxina (jaburetox-2Ec), foi clonada e expressa nos sistema pET101/E. coli BL 21. Neste trabalho, estudamos a estabilidade dos plasmídeos da série pET contendo a seqüência codificante do jaburetox-2Ec no sistema de expressão E. coli BL 21 (Mulinari, 2004), e as condições para aumentar produção do peptídeo recombinante, avaliando a velocidade de transferência de oxigênio, o controle do pH, e a utilização da lactose como indutor em substituição ao IPTG. O cultivo da bactéria recombinante em incubadora orbital contendo 10 g/l de lactose como indutor produziu 1,26 μg de jaburetox-2Ec/mg de proteína total após oito horas de cultivo. A estabilidade do plasmídeo e a expressão do peptídeo recombinante foram estudadas em biorreatores. A expressão do jaburetox-2Ec foi fortemente afetada pelo pH da cultura, com a diminuição de mais de 50 % da concentração desse peptídeo quando ocorre acidificação do meio de cultura. Da mesma forma, o aumento da aeração e agitação tem efeito negativo sobre a produção do peptídeo, diminuindo em sete vezes a produção do jaburetox-2Ec Apesar do aumento da biomassa devido ao cultivo da E. coli recombinante em meio mínimo, contendo como fonte de carbono a glicose, isto não representou aumento da concentração do peptídeo recombinante. Contudo, sob a melhor condição de cultivo em biorreator estudada (pH controlado e menor transferência de oxigênio), obteve-se uma produção de 7,14 μg de jaburetox-2Ec/mg de proteína total, representando em torno de 2 % da proteína total da célula. Em todas as bateladas, após atingir a máxima expressão do peptídeo, essa concentração diminui provavelmente devido à atividade das proteases da célula causando a degradação do peptídeo recombinante. A carga metabólica imposta à célula devido à expressão do jaburetox-2Ec, é uma das possíveis causas da instabilidade do plasmídeo observada em todas as bateladas.

A seqüência de nucleotídeos codificante do peptídeo derivado da hidrólise da canatoxina (jaburetox-2Ec), foi clonada e expressa nos sistema pET101/E. coli BL 21. Neste trabalho, estudamos a estabilidade dos plasmídeos da série pET contendo a seqüência codificante do jaburetox-2Ec no sistema de expressão E. coli BL 21 (Mulinari, 2004), e as condições para aumentar produção do peptídeo recombinante, avaliando a velocidade de transferência de oxigênio, o controle do pH, e a utilização da lactose como indutor em substituição ao IPTG. O cultivo da bactéria recombinante em incubadora orbital contendo 10 g/l de lactose como indutor produziu 1,26 μg de jaburetox-2Ec/mg de proteína total após oito horas de cultivo. A estabilidade do plasmídeo e a expressão do peptídeo recombinante foram estudadas em biorreatores. A expressão do jaburetox-2Ec foi fortemente afetada pelo pH da cultura, com a diminuição de mais de 50 % da concentração desse peptídeo quando ocorre acidificação do meio de cultura. Da mesma forma, o aumento da aeração e agitação tem efeito negativo sobre a produção do peptídeo, diminuindo em sete vezes a produção do jaburetox-2Ec Apesar do aumento da biomassa devido ao cultivo da E. coli recombinante em meio mínimo, contendo como fonte de carbono a glicose, isto não representou aumento da concentração do peptídeo recombinante. Contudo, sob a melhor condição de cultivo em biorreator estudada (pH controlado e menor transferência de oxigênio), obteve-se uma produção de 7,14 μg de jaburetox-2Ec/mg de proteína total, representando em torno de 2 % da proteína total da célula. Em todas as bateladas, após atingir a máxima expressão do peptídeo, essa concentração diminui provavelmente devido à atividade das proteases da célula causando a degradação do peptídeo recombinante. A carga metabólica imposta à célula devido à expressão do jaburetox-2Ec, é uma das possíveis causas da instabilidade do plasmídeo observada em todas as bateladas.

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No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Elizabeth Maria Bispo Beltrão.pdf: 1979482 bytes, checksum: 4c352a671acf0ad5c11d2ee0a0879114 (MD5) Previous issue date: 2017-02-23 / CAPES / Enterobacter aerogenes é uma enterobactéria frequentemente envolvida em Infecções Relacionadas a Assistência à Saúde, que pode apresentar resistência às diferentes classes de antimicrobianos. Há evidências de que a aquisição de resistência nessa espécie, se deve à disseminação plasmidial, juntamente com transposons, entre bactérias gram-negativas. Portanto, o objetivo deste trabalho foi realizar a caracterização de grupos de incompatibilidade plasmidiais (Incs) e determinar o ambiente genético de blaKPC-2 e outros genes de resistência presentes em plasmídeos de isolados clínicos de E. aerogenes provenientes de um hospital público de Recife-PE. Foram selecionados 17 isolados clínicos de E. aerogenes, carreadores do gene blaKPC, e os mesmos foram submetidos a PCR para os grupos Incs A/C, L/M e HI-2. Foram selecionados dois isolados de E. aerogenes para o sequenciamento do DNA plasmidial, por serem provenientes de septicemia em pacientes de UTI e portadores do gene blaKPC. Todos os 17 isolados foram positivos na PCR para os Incs A/C e L/M, enquanto o Inc HI-2 não foi detectado. Na análise do sequenciamento plasmidial além da confirmação da presença do gene blaKPC-2, também foram encontrados os genes de resistência, blaSCO-1, sul2 e aph (3')-VIi. O gene blaKPC-2 foi encontrado inserido no transposon Tn4401 com uma deleção da sequência de inserção ISKpn7 e dos genes istA, istB e transposase (TnpA). Próximo ao gene blaKPC-2 também foi encontrado o gene aph (3')-VIi. Com relação ao gene blaSCO-1, este foi encontrado próximo a uma transposase tnpAtnpR, sendo este o primeiro relato do gene blaSCO-1 em isolados de E. aerogenes. A presença de diferentes genes de resistência, inseridos em plasmídeos Inc A/C₂ e L/M, confirmam a importância de se monitorar a circulação dos plasmídeos e analisar as sequências gênicas dessas estruturas. Deve-se destacar que embora o gene blaKPC-2 tenha sido codificado dentro do elemento Tn4401, foram encontradas diferentes características estruturais, notadamente a perda de tnpA e ISKpn7, indicando uma nova versão do Tn4401 (a ser denominada Tn4401i). Essas características podem fazer com que o transposon Tn4401 perca sua capacidade de transposição, pois as sequências de inserção são essenciais para a sua mobilidade. Estes achados enfatizam ainda a continuada recombinação e evolução de plasmídeos e do elemento Tn4401 que contém o gene blaKPC-2, e o potencial de disseminação plasmidial de diferentes genes de resistência por E. aerogenes no ambiente hospitalar. / Enterobacter aerogenes is a frequently enterobacterium involved in healthcare-associated infections, it may be resistant to different antimicrobials agents classes. There is evidence of resistance acquisition in this species, due to plasmid propagation, along with transposons between gram-negative bacteria. This study aimed to characterize Plasmid Incompatibility Groups (Incs) and to determine the genetic region of blaKPC-2 and other resistance genes present in plasmids from clinical isolates of E. aerogenes from a public hospital in Recife/PE. Seventeen clinical isolates of E. aerogenes carriers of the blaKPC gene were selected and subjected to PCR for the Incs A/C, L/M and HI-2 groups. Only two E. aerogenes isolates were selected for the sequencing of the plasmid DNA by carriers blaKPC-2 gene and from septicemia in ICU patients. All seventeen strains were PCR positive for Incs A/C and L/M, while Inc HI-2 was not detected. Plasmid sequencing confirmed the presence of the blaKPC-2 gene, and resistance genes, blaSCO-1, sul2 and aph (3')-Vi were also found. blaKPC-2 gene was found inserted in Tn4401 transposon with deletion of the ISKpn7 insertion sequence and the istA, istB gene and a transposase (TnpA). Next to the blaKPC-2 gene was also found the aph (3')-VIi gene. Related to the blaSCO-1 gene, it was found next to a tnpAtnpR transposase, which is the first report of the blaSCO-1 gene in E. aerogenes isolates. Presence of different resistance genes inserted in Inc A/C₂ and L/M plasmids confirm the importance of monitoring the circulation of plasmids and analyzing their gene sequences. It is important to note that although the blaKPC-2 gene was encoded within the Tn4401 element, different structural characteristics were found; noting that the loss of tnpA and ISKpn7 indicated a new version of Tn4401 (will be called Tn4401i). These characteristics may do the transposon Tn4401 to lose its transposing ability, since the insertion sequences are essential for its mobility. These findings emphasize the continuous recombination and evolution of plasmids and Tn4401 element that contains the blaKPC-2 gene, in addition to the potential for plasmidial dissemination of different resistance genes by E. aerogenes in the hospital environment.

A macieira (Malus × domestica) possui importância mundial entre as frutíferas de clima temperado, e o Brasil se destaca entre os maiores produtores mundiais de maçã.À sarna da macieira, causada pelo fungo ascomiceto Venturia inaequalis, é uma das principais doenças nessa cultura. As duas cultivares mais consumidas no Brasil, Fuji e Gala, são altamente suscetíveis à sarna. O gene Vf2, derivado do clone 821 da espécie silvestre Malus floribunda, é capaz de conferir resistência à doença. O processo de melhoramento genético da macieira e a introgressão de novos genes derivados de germoplasma é um processo demorado e difícil devido ao longo tempo de geração das plantas e à autoincompatibilidade à autopolinização em Malus.Historicamente a introgressão recombinante de genes em vegetais baseou-se na transformação genética via Agrobacterium tumefaciens. Porém, novas técnicasestão sendo estabelecidas e vem revolucionado o campo da genômica funcional em plantas como a utilização de DNA epissomal em plasmídeos vegetais derivados de vírus. Estes vetores não se integram ao genoma da planta hospedeira e não são herdáveis. Os vetores consistem de vírus modificados capazes de espalhar-se por todos os tecidos da planta tratadasem causar doença e levando à expressão de genes de interesse sem a necessidade de obtenção de plantas transgênicas. Este trabalho tevecomo objetivo transferir a resistência aV. inaequalis, conferida pelo gene Vf2, para as cultivares de macieira Fuji e Gala, utilizando-seplasmídeos vegetais baseado nos vírus TYLCV (Tomato Yellow Leaf Curl Virus). O gene de resistência Vf2 derivado de Malus floribunda 821 foi clonado nosvetores de expressão e injetadoem plantas de macieira das cultivares Maxi Gala e Fuji Suprema.O DNA plasmidial foi detectado sistemicamente nas plantas tratadas e este se manteve estável durante os8 meses de testes. A expressão do gene Vf2 foi quantificada por RT-qPCR e diversas plantas apresentaram níveis elevados de expressão deste gene de resistência. Estas plantas foram desafiadas com esporos de V. inaequalis e a maioria das plantas tratadas apresentou fenótipo resistente à sarna. A introgressão recombinante baseada em plasmídeos vegetais demonstrou ser eficaz em transferir material genético de forma sistêmica nas duas cultivares de macieira testadas. O vetor plasmidial foi detectado nas plantas tratadas durante todo o período(8 meses) avaliado neste estudo, e a expressão do gene de resistência foi detectada em diversos indivíduos. Nosso estudo reforça a aplicabilidade desta técnica em plantas lenhosas perenes e abre a possibilidade para a introgressão rápida de outras características de interesse derivadas da expressão heteróloga de genes com potencial biotecnológico. / Apple (Malus x domestica) is an important crop among temperate fruit trees, and Brazil features among the world’s biggest apple producers. The apple scab, caused by the ascomycete fungus Venturia inaequalis, is a major disease of the culture. The two most consumed cultivars in Brazil, Fuji and Gala, are highly susceptible to apple scab. The Vf gene, derived from clone 821 of the wild species Malus floribunda, is capable of conferring resistance to the scab disease. The genetic improvement process of apple by introgression of new genes derived from germplasm is lenghty due to long generation time and self-incompatibility. Historically the recombinant introgression of genes in plantshas been based on genetic transformation emplyingAgrobacterium tumefaciens. However, new techniques have been developed and are revolutionizing plantfunctional genomics such as virus-derived plant episomalplasmids.These vectors do not integrate in to thehost plant genome and are not inheritable. The vectors consist of a modified virus capable of spreading to all tissues of thetreated plant without causing disease and leading to the systemic expression of the gene of interest without the need of obtaining transgenic plants.This workaimed to transfer the resistance against V. inaequalis, granted by the Vf2 gene, to Fuji and Gala apple suceptible cultivars, by using plant plasmids based on TYLCV (Tomato Yellow Leaf Curl virus).The resistance gene Vf2 derived from Malus floribunda 821 was cloned on expression vectors and injectedto Maxi Gala and Fuji Supremaplants.The plasmid DNA was systemically detected on treated plants and remained stable for at least8 months.The expression of theVfgene was quantified by RT-qPCR and several plants presented high levels of Vf2expression. These plants were challenged by spores of V. inaequalis and the majority of the treated plants displayed scab resistant phenotypes.The Vf2introgression based on plant plasmidswas shown to be effective on transferring genetic material sistemically to the apple cultivars tested. The plasmids weredetected on treated plants during the whole evaluated time of this study (8 months), and the resistance gene expression was detected on several individuals. Our study reinforces the applicability of such technique in woody perennial plants and givesthe possibility for fast introgression of other characteristics of interest dependent on genes with diverse biotechnological potential.

A macieira (Malus × domestica) possui importância mundial entre as frutíferas de clima temperado, e o Brasil se destaca entre os maiores produtores mundiais de maçã.À sarna da macieira, causada pelo fungo ascomiceto Venturia inaequalis, é uma das principais doenças nessa cultura. As duas cultivares mais consumidas no Brasil, Fuji e Gala, são altamente suscetíveis à sarna. O gene Vf2, derivado do clone 821 da espécie silvestre Malus floribunda, é capaz de conferir resistência à doença. O processo de melhoramento genético da macieira e a introgressão de novos genes derivados de germoplasma é um processo demorado e difícil devido ao longo tempo de geração das plantas e à autoincompatibilidade à autopolinização em Malus.Historicamente a introgressão recombinante de genes em vegetais baseou-se na transformação genética via Agrobacterium tumefaciens. Porém, novas técnicasestão sendo estabelecidas e vem revolucionado o campo da genômica funcional em plantas como a utilização de DNA epissomal em plasmídeos vegetais derivados de vírus. Estes vetores não se integram ao genoma da planta hospedeira e não são herdáveis. Os vetores consistem de vírus modificados capazes de espalhar-se por todos os tecidos da planta tratadasem causar doença e levando à expressão de genes de interesse sem a necessidade de obtenção de plantas transgênicas. Este trabalho tevecomo objetivo transferir a resistência aV. inaequalis, conferida pelo gene Vf2, para as cultivares de macieira Fuji e Gala, utilizando-seplasmídeos vegetais baseado nos vírus TYLCV (Tomato Yellow Leaf Curl Virus). O gene de resistência Vf2 derivado de Malus floribunda 821 foi clonado nosvetores de expressão e injetadoem plantas de macieira das cultivares Maxi Gala e Fuji Suprema.O DNA plasmidial foi detectado sistemicamente nas plantas tratadas e este se manteve estável durante os8 meses de testes. A expressão do gene Vf2 foi quantificada por RT-qPCR e diversas plantas apresentaram níveis elevados de expressão deste gene de resistência. Estas plantas foram desafiadas com esporos de V. inaequalis e a maioria das plantas tratadas apresentou fenótipo resistente à sarna. A introgressão recombinante baseada em plasmídeos vegetais demonstrou ser eficaz em transferir material genético de forma sistêmica nas duas cultivares de macieira testadas. O vetor plasmidial foi detectado nas plantas tratadas durante todo o período(8 meses) avaliado neste estudo, e a expressão do gene de resistência foi detectada em diversos indivíduos. Nosso estudo reforça a aplicabilidade desta técnica em plantas lenhosas perenes e abre a possibilidade para a introgressão rápida de outras características de interesse derivadas da expressão heteróloga de genes com potencial biotecnológico. / Apple (Malus x domestica) is an important crop among temperate fruit trees, and Brazil features among the world’s biggest apple producers. The apple scab, caused by the ascomycete fungus Venturia inaequalis, is a major disease of the culture. The two most consumed cultivars in Brazil, Fuji and Gala, are highly susceptible to apple scab. The Vf gene, derived from clone 821 of the wild species Malus floribunda, is capable of conferring resistance to the scab disease. The genetic improvement process of apple by introgression of new genes derived from germplasm is lenghty due to long generation time and self-incompatibility. Historically the recombinant introgression of genes in plantshas been based on genetic transformation emplyingAgrobacterium tumefaciens. However, new techniques have been developed and are revolutionizing plantfunctional genomics such as virus-derived plant episomalplasmids.These vectors do not integrate in to thehost plant genome and are not inheritable. The vectors consist of a modified virus capable of spreading to all tissues of thetreated plant without causing disease and leading to the systemic expression of the gene of interest without the need of obtaining transgenic plants.This workaimed to transfer the resistance against V. inaequalis, granted by the Vf2 gene, to Fuji and Gala apple suceptible cultivars, by using plant plasmids based on TYLCV (Tomato Yellow Leaf Curl virus).The resistance gene Vf2 derived from Malus floribunda 821 was cloned on expression vectors and injectedto Maxi Gala and Fuji Supremaplants.The plasmid DNA was systemically detected on treated plants and remained stable for at least8 months.The expression of theVfgene was quantified by RT-qPCR and several plants presented high levels of Vf2expression. These plants were challenged by spores of V. inaequalis and the majority of the treated plants displayed scab resistant phenotypes.The Vf2introgression based on plant plasmidswas shown to be effective on transferring genetic material sistemically to the apple cultivars tested. The plasmids weredetected on treated plants during the whole evaluated time of this study (8 months), and the resistance gene expression was detected on several individuals. Our study reinforces the applicability of such technique in woody perennial plants and givesthe possibility for fast introgression of other characteristics of interest dependent on genes with diverse biotechnological potential.

A macieira (Malus × domestica) possui importância mundial entre as frutíferas de clima temperado, e o Brasil se destaca entre os maiores produtores mundiais de maçã.À sarna da macieira, causada pelo fungo ascomiceto Venturia inaequalis, é uma das principais doenças nessa cultura. As duas cultivares mais consumidas no Brasil, Fuji e Gala, são altamente suscetíveis à sarna. O gene Vf2, derivado do clone 821 da espécie silvestre Malus floribunda, é capaz de conferir resistência à doença. O processo de melhoramento genético da macieira e a introgressão de novos genes derivados de germoplasma é um processo demorado e difícil devido ao longo tempo de geração das plantas e à autoincompatibilidade à autopolinização em Malus.Historicamente a introgressão recombinante de genes em vegetais baseou-se na transformação genética via Agrobacterium tumefaciens. Porém, novas técnicasestão sendo estabelecidas e vem revolucionado o campo da genômica funcional em plantas como a utilização de DNA epissomal em plasmídeos vegetais derivados de vírus. Estes vetores não se integram ao genoma da planta hospedeira e não são herdáveis. Os vetores consistem de vírus modificados capazes de espalhar-se por todos os tecidos da planta tratadasem causar doença e levando à expressão de genes de interesse sem a necessidade de obtenção de plantas transgênicas. Este trabalho tevecomo objetivo transferir a resistência aV. inaequalis, conferida pelo gene Vf2, para as cultivares de macieira Fuji e Gala, utilizando-seplasmídeos vegetais baseado nos vírus TYLCV (Tomato Yellow Leaf Curl Virus). O gene de resistência Vf2 derivado de Malus floribunda 821 foi clonado nosvetores de expressão e injetadoem plantas de macieira das cultivares Maxi Gala e Fuji Suprema.O DNA plasmidial foi detectado sistemicamente nas plantas tratadas e este se manteve estável durante os8 meses de testes. A expressão do gene Vf2 foi quantificada por RT-qPCR e diversas plantas apresentaram níveis elevados de expressão deste gene de resistência. Estas plantas foram desafiadas com esporos de V. inaequalis e a maioria das plantas tratadas apresentou fenótipo resistente à sarna. A introgressão recombinante baseada em plasmídeos vegetais demonstrou ser eficaz em transferir material genético de forma sistêmica nas duas cultivares de macieira testadas. O vetor plasmidial foi detectado nas plantas tratadas durante todo o período(8 meses) avaliado neste estudo, e a expressão do gene de resistência foi detectada em diversos indivíduos. Nosso estudo reforça a aplicabilidade desta técnica em plantas lenhosas perenes e abre a possibilidade para a introgressão rápida de outras características de interesse derivadas da expressão heteróloga de genes com potencial biotecnológico. / Apple (Malus x domestica) is an important crop among temperate fruit trees, and Brazil features among the world’s biggest apple producers. The apple scab, caused by the ascomycete fungus Venturia inaequalis, is a major disease of the culture. The two most consumed cultivars in Brazil, Fuji and Gala, are highly susceptible to apple scab. The Vf gene, derived from clone 821 of the wild species Malus floribunda, is capable of conferring resistance to the scab disease. The genetic improvement process of apple by introgression of new genes derived from germplasm is lenghty due to long generation time and self-incompatibility. Historically the recombinant introgression of genes in plantshas been based on genetic transformation emplyingAgrobacterium tumefaciens. However, new techniques have been developed and are revolutionizing plantfunctional genomics such as virus-derived plant episomalplasmids.These vectors do not integrate in to thehost plant genome and are not inheritable. The vectors consist of a modified virus capable of spreading to all tissues of thetreated plant without causing disease and leading to the systemic expression of the gene of interest without the need of obtaining transgenic plants.This workaimed to transfer the resistance against V. inaequalis, granted by the Vf2 gene, to Fuji and Gala apple suceptible cultivars, by using plant plasmids based on TYLCV (Tomato Yellow Leaf Curl virus).The resistance gene Vf2 derived from Malus floribunda 821 was cloned on expression vectors and injectedto Maxi Gala and Fuji Supremaplants.The plasmid DNA was systemically detected on treated plants and remained stable for at least8 months.The expression of theVfgene was quantified by RT-qPCR and several plants presented high levels of Vf2expression. These plants were challenged by spores of V. inaequalis and the majority of the treated plants displayed scab resistant phenotypes.The Vf2introgression based on plant plasmidswas shown to be effective on transferring genetic material sistemically to the apple cultivars tested. The plasmids weredetected on treated plants during the whole evaluated time of this study (8 months), and the resistance gene expression was detected on several individuals. Our study reinforces the applicability of such technique in woody perennial plants and givesthe possibility for fast introgression of other characteristics of interest dependent on genes with diverse biotechnological potential.

Orientador: Sandro Roberto Valentini / Coorientador: Cleslei Fernando Zanelli / Banca: Mário Henrique Bengtson / Banca: Carla Columbano de Oliveira / Resumo: O fator de tradução de eucariotos 5A (eIF5A) é altamente conservado em arqueas e eucariotos e sofre uma modificação pós-traducional única e essencial chamada hipusinação. Embora tenha sido sugerida inicialmente uma função para eIF5A no início da tradução, foi na etapa de elongação que sua função foi melhor demonstrada. Estudos prévios mostraram que eIF5A tem algum papel na translocação de proteínas pela via co-traducional e que mutantes desse fator possuem níveis aumentados de proteínas envolvidas com o estresse de retículo endoplasmático (RE). Desta forma, nesse trabalho, foi estudada a correlação entre eIF5A e a via de resposta ao estresse de RE (Unfolded Protein Response - UPR). Considerando que o fator de transcrição Hac1 é um elemento essencial da via UPR em Saccharomyces cerevisiae, foi inicialmente verificado se eIF5A afetava o splicing citoplasmático do mRNA de HAC1, o qual é dependente da ativação de Ire1, um sensor de proteínas desenoveladas no interior do RE. Para isto, foi realizada a quantificação dos níveis de mRNA maduro e imaturo de HAC1 por meio de ensaios de qPCR e RT-PCR semiquantitativa, análises estas que não revelaram qualquer diferença de comportamento do mutante hyp2-3 de eIF5A em relação ao selvagem. Por outro lado, diferentes mutantes de eIF5A mostraram sensibilidade a DTT e resistência a tunicamicina, um comportamento ainda não descrito na literatura e que difere de mutantes da via de SRP (via co-traducional de translocação de proteínas para o RE). ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The eukaryotic translation factor 5A (eIF5A) is highly conserved in archaea and eukaryotes and undergoes a unique and essential post-translational modification called hypusination. Although a function for eIF5A was initially suggested at the initiation of translation, it was in the elongation step that its function was best demonstrated. Previous studies have shown that eIF5A has a role in protein translocation by the co-translational pathway and that mutants of this factor have increased levels of proteins involved with endoplasmic reticulum (ER) stress. Therefore, in this work, the correlation of eIF5A with the stress response pathway of ER (the Unfolded Protein Response - UPR) was studied. Considering that the Hac1 transcription factor is an essential element of the UPR pathway in Saccharomyces cerevisiae, it was first verified whether eIF5A affects the cytoplasmic splicing of the HAC1 mRNA, which is dependent on the activation of Ire1, a sensor of unfolded proteins in the RE. To test it, we did the quantification of the mature and immature mRNA levels of HAC1 by means of qPCR and semi-quantitative RT-PCR assays, which did not reveal any difference in the behavior of the eIF5A mutant hyp2-3 in comparison to the wild-type. On the other hand, different mutants of eIF5A show sensitivity to DTT and resistance to tunicamycin, a behavior not yet described in the literature and that differs from mutants of the SRP pathway (co-translocation pathway for RE) and also this behavior of eIF5A mutants was not modified by overexpression of SRP. In addition, the eIF5A mutant phenotype in DTT and tunicamycin differs from that of knockout strains of ribosomal proteins, knockout of a ribosome biogenesis factor... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Alessandro de Mello Varani / Coorientador: Marcos Túlio Oliveira / Banca: Jesus Aparecido Ferro / Banca: Henrique Ferreira / Resumo: Xanthomonas citri subsp. citri (Xac) é um fitopatógeno responsável por causar o Cancro Cítrico, relacionado a grandes perdas econômicas para a citricultura. Esta bactéria utiliza diversos mecanismos moleculares para infectar o hospedeiro, dentre eles, o Sistema de Secreção Tipo III (T3SS), considerado o principal fator de virulência expresso in planta pela Xac. Sabe-se que a ativação do T3SS é controlada por dois reguladores: HrpG e HrpX. Porém, os mecanismos que controlam estes reguladores e posteriormente a expressão do T3SS in planta ainda são pouco compreendidos. Estudos realizados por nosso grupo de pesquisa sugerem que a concentração de fosfato inorgânico (Pi) presente em meio de cultura ou em espaço apoplástico, onde a Xac causa a infecção em plantas, pode estar relacionado com a ativação do T3SS, sugerindo uma possível relação entre o Pi com os reguladores HrpG e HrpX. Em Xac, a detecção e transportorte do Pi é realizada pelo sistema de dois componentes (TCS) PhoR/PhoB, codificado pelo operon pho. Afim de averiguar a possível relação entre PhoR/PhoB com os reguladores do T3SS HrpG e HrpX, ensaios de modelagem molecular foram realizados, indicando que a proteína PhoR poderia interagir fisicamente com HrpG, fosforilando-a, e sugerindo um possível mecanismo de interação entre o TCS PhoR/PhoB e os genes reguladores do T3SS. Para testar a hipótese de interação física entre HrpG e PhoR, as proteínas recombinantes PhoR, PhoB e HrpG de Xac foram expressas em células de Escher... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Xanthomonas citri subsp. citri (Xac) is a plant pathogen that causes citrus canker, responsible for significant economic losses in citriculture. This bacteria uses several molecular mechanisms to infect the host, such as the Type III Secretion System (T3SS), which is considered the main factor of virulence expressed in plant by Xac. Activation of T3SS is controlled by two regulators, HrpG and HrpX, however, the mechanisms that control these regulators and subsequently the expression of T3SS in planta are poorly understood. Previosuly, our research group identified that the concentration of inorganic phosphate (Pi) present in culture media or in the apoplastic space, where Xac causes infection in plants, may be related to the activation of T3SS, suggesting a possible relationship between Pi and the HrpG and HrpX regulators. In Xac, the detection and transport of Pi is performed by the two-component system (TCS) PhoR/PhoB, encoded by the operon pho. In order to investigate the possible relationship between PhoR/PhoB and the regulators of T3SS HrpG and HrpX, molecular modeling analyses were performed and indicated that the PhoR protein could physically interact with HrpG and phosphorylate it, suggesting a possible mechanism of interaction between TCS PhoR / PhoB and the T3SS regulatory genes with subsequent activation of T3SS. To test the hypothesis, recombinant forms of PhoR, PhoB and HrpG were expressed in Escherichia coli BL21 cells for the purpose of performing pull-down ass... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Ana Marisa Fusco Almeida / Coorientador: Cleslei Fernando Zanelli / Banca: Carlos Peleschi Taborda / Banca: Cristiano Gallina Moreira / Resumo: Paracoccidiodomicose (PCM) é uma micose sistêmica endêmica na América Latina, de alta prevalência no Brasil, que tem como agente etiológico os fungos dimórficos do gênero Paracoccidioides, P. brasiliensis e P. lutzii. No processo de infecção as adesinas, substâncias sintetizadas por estes fungos que se ligam a matriz extracelular, são importantes fatores de virulência para o estabelecimento da infecção. A proteína de 30kDa, pertencente a família de proteínas 14-3-3, se destaca no processo adesivo deste fungo. As proteínas 14-3-3 são uma família de proteínas presentes em todas as células eucariotas e possuem múltiplas funções. Em P. brasiliensis, a proteína 14-3-3Pb, liga-se a laminina, principal componente da matriz extracelular das células hospedeiras, e durante a infecção sua expressão é aumentada. Com o intuito de compreender melhor a função desta proteína o objetivo deste estudo foi realizar a análise funcional da 14-3-3Pb através da obtenção de um homólogo funcional em S. cerevisiae e análise do anticorpo monoclonal anti-14-3-3Pb. S. cerevisiae foi escolhida como modelo de estudo por ser uma levedura amplamente utilizada na pesquisa genética, ao contrário de P. brasiliensis, e por possuir duas isoformas de 14-3-3, Bmh1p e Bmh2p, com alta identidade com 14-3-3Pb Para obtenção do homólogo funcional, foi realizada a transformação do vetor pYES-14-3-3Pb em S. cerevisiae. A partir da obtenção dos transformantes a avaliação da complementação foi realizada e foi observado uma complementação parcial das proteínas Bmh1p e Bmh2p por 14-3-3Pb. Ainda foram realizados teste de sensibilidade aos antifúngicos e a derivados semissintéticos do ácido gálico, onde foi possível observar um aumento da sensibilidade das linhagens com nocaute para os genes BMH1 e BMH2, S. cerevisiae Δbmh1 e Δbmh2, quando comparado à linhagem selvagem. A análise do anticorpo monoclonal foi realizada através de ensaio... / Abstract: Paracoccidioidomycosis (PCM) a systemic mycosis endemic in Latin America, with high prevalence in Brazil, has as etiological agent dimorphic fungi Paracoccidioides spp., P. brasiliensis e P. lutzii. During the infection process the adhesins, substances synthetized by fungi that interacts with host's extracellular matrix (ECM), are important virulence factors for the establishment of infection. A 30kDa protein that belongs to 14-3-3 proteins family stands out in the adhesion process of this fungus. The 14-3-3 proteins are present in all eukaryotic cells and play multiple functions. In P. brasiliensis, the 14-3-3Pb protein binds to lamin, the major component of ECM from host cells, and during the infection the expression is increased. In order to have a better understanding of 14-3-3Pb functions the aim of this study is to perform a functional analysis of this protein through achieving a functional homologous in S. cerevisiae and to analyze the monoclonal antibody anti-14-3-3Pb during infection. S. cerevisiae was chosen as model because it's widely use in genetic research, unlike P. brasiliensis, and has two isoforms of 14-3-3 proteins, Bmh1p and Bmh2p, with high identity with 14-3-3Pb. The functional homologous were obtained by yeast transformation of pYES-14-3-3Pb vector. Complementation assay was performed with obtained transformants, and it was observed that 14-3-3Pb partially complements Bmh1p and Bmh2p, with higher complementation of Bmh2p. Also susceptibility assays were performed with antifungal drugs and semi-synthetic compounds derived from gallic acid where it was observed that S. cerevisiae wild type was less sensitive to antifungals than the knockout strains, S. cerevisiae Δbmh1 and Δbmh2. Monoclonal antibody anti14-3-3Pb was evaluated alone and in association with substances with antifungal activities through inhibition adhesion assay, where it was observed that the anti-14-3-3Pb alone is able to inhibit P. brasiliensis ... / Mestre