Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:09Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-08-26 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Mycobacterium avium e Mycobacterium kansasii são micobactérias não tuberculosas frequentemente isoladas em infecções em pacientes HIV positivos. Em um projeto anterior do laboratório foi estudado um cultivo misto de M. avium e M. kansasii isolado da medula óssea de um paciente HIV positivo. Estudando colônias isoladas deste cultivo, foi possível observar que a cepa de M. kansasii possuía a sequência de inserção IS1245, que é especifica de M. avium. A presença deste elemento de inserção em M. kansasii foi confirmada por PCR-IS1245, RFLP-IS1245 e sequenciamento. Este estudo teve como objetivo investigar o mecanismo de transferência da IS1245 para M. kansasii. Uma banda de aproximadamente 100 kb foi detectada por PFGE em colônias de M. avium e de M. kansasii deste cultivo misto. Testes de mobilidade desta banda de DNA em géis de PFGE, em diferentes condições de corrida, e testes com exonucleases e com topoisomerase I comprovaram que esta banda era um plasmídeo linear (pMA100), que continha proteínas covalentemente ligada nos seus terminais 5’. Estes achados levaram à hipótese de que o plasmídeo pMA100 seria responsável pela transferência natural do elemento IS1245 de M. avium para M. kansasii por conjugação. Experimentos in vitro reproduziram o evento de conjugação, tanto com a cepa de M. kansasii isolada do cultivo misto, como com outras duas cepas de M. kansasii não relacionadas. A sequência de inserção se manteve estável no genoma de M. kansasii após 10 subcultivos e foi observada a ocorrência de transposição de modo replicativo em M. kansasii. Pela primeira vez está sendo demonstrada a transferência horizontal de genes natural entre espécies diferentes de micobactérias. / Mycobacterium avium and Mycobacterium kansasii are non-tuberculous mycobacteria frequently isolated in infections from HIV positive patients. In a previous study from our laboratory, a mixed culture of M. avium and M. kansasii from a bone marrow isolate of an HIV positive patient was studied. The analysis of isolated colonies allowed the detection of the insertion sequence IS1245, specific from M. avium, in M. kansasii. The presence of this element in M. kansasii was confirmed by PCR-IS1245, RFLP-IS1245 and sequencing. The objective of this study was to investigate the mechanism of transference of the IS1245 to M. kansasii. A band of approximately 100 kb was detected by PFGE in colonies of M. avium and M. kansasii from this mixed culture. Tests of mobility of this DNA band in PFGE gels, in different running conditions, and tests with exonucleases and topoisomerase I demonstrated that this band was a linear plasmid (pMA100) with proteins covalently linked to the 5’ ends. These findings led to the hypothesis that the pMA100 plasmid was responsible for the natural transference of the IS1245 element from M. avium to M. kansasii by conjugation. Experiments performed in vitro reproduced the conjugation event, not only with the M. kansasii strain from the mixed culture, but also with other two unrelated M. kansasii strains. The insertion sequence was stably maintained in the M. kansasii genome after 10 subcultures and its replicative transposition in M. kansasii was also observed. For the first time the natural horizontal gene transfer between different species of mycobacteria has been demonstrated. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

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Orientador: João Pessoa Araujo Junior / Resumo: A segurança dos alimentos é essencial para o desenvolvimento da sociedade e as doenças transmitidas por alimentos (DTAs) acometem milhares de pessoas todos os anos. Dentre os agentes de DTA, Salmonella se destaca como a principal causa de hospitalizações e mortes. A carne suína é uma importante fonte de nutrientes, sendo a mais consumida no mundo. Vários relatos apontaram o isolamento de Salmonella multidrogas resistentes (MDR) associados com a cadeia produtiva dos suínos, e a ocorrência de elementos que possibilitam a transferência de genes de resistência entre populações bacterianas estão diretamente relacionados a essa característica. O presente trabalho objetivou determinar os genes associados com resistência a antimicrobianos de 9 isolados de Salmonella MDR provenientes de linfonodos mesentéricos de suínos, além de aplicar um protocolo in silico para predizer a localização de cada gene (plasmidial ou cromossomal) e detectar e caracterizar a presença de Integrons de resistência. Diversos genes de resistência para a mesma classe de antimicrobianos foram encontrados em cada cepa, e a localização presumida dos genes foi heterogênica, com exceção para os genes de resistência a sulfonamidas, todos classificados como plasmidiais. Cinco cepas apresentaram integrons classe 1, agrupados em três diferentes perfis. A comparação destes perfis com sequências do GenBank revelou que bactérias de diversas espécies, isoladas em diversos países e proveniente de diferentes fontes, inclusive... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Food safety is essential for society development, and foodborne diseases affect thousands of people every year. Among the main foodborne disease agents, Salmonella stands out as the most associated with hospitalizations and deaths. Pork products are an important source of nutrients for population and the most consumed meat in the world. Several reports reveal the presence of Multidrug Resistant (MDR) Salmonella strains in the pork production chain, and the occurrence of elements that allows transference of resistance genes between bacterial populations is related to this characteristic. The present study aimed to determinate the genetic bases associated with Antimicrobial Resistance (AMR) in nine MDR Salmonella strains isolated from swine mesenteric lymph-nodes, beside applying an in-silico protocol to determinate location of the AMR genes (chromosomal or plasmidial) and characterize resistance integrons. Different resistance genes for the same antimicrobial class were present in each strain, and gene localization was heterogenous, except for sulphonamides resistance genes, where all were classified as plasmidial. Five isolates harbored Class 1 ix integrons, which were classified in three distinct Integron Profiles (IPs). Comparison of IPs with sequences of GenBank database revealed that different species of bacteria, from different countries and isolation sources, including human clinical isolates had the same integrons. The diversity of resistance mechanisms for the same an... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Desde a primeira enzima ?-lactamase de espectro estendido (ESBL) detectada, na década de 1980, o número de diferentes enzimas ESBL têm aumentado exponencialmente. Houve também aumento no número de relatos de isolamento de bactérias resistentes presentes em alimentos de origem animal. O objetivo deste estudo foi avaliar enterobactérias de microbiota de frangos comerciais saudáveis, de granjas localizadas no interior do Estado de São Paulo (Brasil), quanto à resistência a antimicrobianos e ao potencial de virulência. Foram avaliadas todas as enterobactérias que apresentaram resistência à cefotaxima e/ou ceftazidima de 200 frangos comerciais para consumo humano. O teste de sensibilidade aos antimicrobianos foi realizado por disco de difusão para diferentes classes de antimicrobianos incluindo ?- lactâmicos e não ?-lactâmicos. Reação em cadeia da polimerase e sequenciamento foram utilizados para a pesquisa de genes codificadores de ESBL, ?-lactamases AmpC e determinantes de resistência às quinolonas mediada por plasmídeos (PMQR). A similaridade genética dos isolados foi caracterizada por eletroforese em campo pulsado (PFGE) e a localização cromossômica ou plasmideal de genes de resistência foi avaliada por I-Ceu IPFGE ou S1-PFGE. Além disso, experimentos de conjugação, tipagem de plasmídeos, investigação de filogenia e de virulência foram realizados. Em todas as amostras de cloaca coletadas foram identificados Enterobacteriaceae, incluindo Escherichia coli, Escherichia fergusonii, Klebsiella oxytoca e Klebsiella pneumoniae resistentes à cefotaxima e/ou ceftazidima. Salmonella sp não foi detectada. Foi encontrada ampla diversidade genômica entre todos os isolados classificados entre diferentes tipos de PFGE. Foram detectados diferentes genes codificadores de ?-lactamases, a maioria em diferentes plasmídeos, de diversos tamanhos, sendo alguns conjugativos, presentes em diferentes populações bacterianas. Foram identificados isolados de E. coli produtores de CTX-M-2, com inserção do gene blaCTX-M-2 no cromossomo bacteriano. Plasmídeo IncI (ST113/ST114) foi identificado carreando o gene blaCTX-M-8. Foram também encontrados os genes codificadores de ?- ii lactamase, blaCTX-M-2 e blaCTX-M-15, sendo carreados por plasmídeos. Foi identificado gene blaCMY-2 disseminado por plasmídeos de diferentes grupos de incompatibilidade, na população comensal de E. coli. Nos isolados que abrigavam gene PMQR, além das resistências às quinolonas, foi observado também resistência a outras importantes classes de antimicrobianos. Genes determinantes de PMQR abrigados em plasmídeos tipo ColE foram encontrados em E. coli, E. fergusonii, K. oxytoca e K. pneumoniae. Todas as aves comerciais de granjas localizadas no interior do Estado de São Paulo, incluídas nesse estudo, apresentaram isolados considerados multirresistentes a antimicrobianos e o trato intestinal destes frangos é reservatório dos genes de resistência em enterobactérias da microbiota normal. Além disso, alguns isolados demonstraram alto potencial de virulência, incluindo a capacidade de adesão e invasão em células epiteliais in vitro. / of commercial poultry in farms located at the countryside of São Paulo State (Brazil). All enterobacteria presenting cefotaxime and/or ceftazidime resistance from 200 commercial broiler chickens for human consumption were evaluated. Antimicrobial susceptibility testing was performed by disc diffusion for different classes of antimicrobials, including ?-lactams and non-?-lactams. The genes encoding ESBL, ampC ?-lactamases and determinants of plasmid mediated quinolone resistance (PMQR) were screened by polymerase chain reaction and sequencing. Genetic similarity of bacterial isolates was characterized by pulsed field gel electrophoresis (PFGE) and the location of the resistance genes in the chromosome or plasmids was evaluated by I-CeuI-PFGE or S1-PFGE. Additionally, experiments of conjugation, plasmid typing, phylogeny and virulence characterization were performed. Enterobacteriaceae were identified in all cloacal swab samples, including Escherichia coli, Escherichia fergusonii, Klebsiella oxytoca and Klebsiella pneumoniae resistant to cefotaxime and/or ceftazidime. Salmonella sp. was not detected. High genetic diversity was detected among all isolates, classified into diferent types of PFGE. Different genes coding for ?-lactamases were detected, harbored in diverse plasmids, of different sizes, some were conjugative and were present in different bacterial populations. E. coli isolates producing CTX-M-2 were identified, harbouring the blaCTX-M-2 gene inserted into the chromosome. IncI (ST113/ST114) plasmid was identified carrying the blaCTX-M-8 gene. The ?-lactamase coding genes, blaCTX-M-2 and blaCTX-M-15 were also found in plamids. The gene blaCMY-2 was found disseminated in different types of plasmid replicons in the commensal E. coli population. In isolates harbouring PMQR genes, in addition to the quinolones resistance, was observed resistance to other important antimicrobials classes was observed. PMQR determinant genes harbored in ColE-like plasmids were found in E. coli, E. fergusonii, K. oxytoca and K. pneumoniae. All commercial poultry from farms located at São Paulo State, evaluated in this study, carried isolates considered multidrug resistant and the intestinal tract of these chickens is reservoir of resistant genes blaCTX-M-2, blaCTX-M-8 and blaCTX-M-15 in enterobacteria from the normal microbiota. Moreover, some have demonstrated a high virulence potential, with adhesion and invasion capacity in epithelial cells cultured in vitro.

As metalo-β-lactamases (MBL) são capazes de hidrolisar os carbapenêmicos, a classe de antimicrobianos com maior potência para o tratamento de infecções graves e de maior uso clinico. Dentre as MBL, o grupo mais recentemente descrito e que apresentou rápida disseminação em todo o mundo é o da New-Delhi-Metalo- β-lactamases (NDM). Nas enterobactérias, os genes que codificam essas enzimas estão mais frequentemente localizados em plasmídeos. O estudo da estabilidade de plasmídeos que albergam o gene blaNDM-1 é importante para entender a predominância de espécies que carregam esses plasmídeos, desvendar mecanismos moleculares envolvidos na sua persistência e para desenvolver novas drogas que possam diminuir a sua persistência. Estudos recentes sobre estabilidade plasmidial evidenciaram que a maprotilina é capaz de induzir perda plasmidial de até 90% em E. coli K12. Neste trabalho, foi estudado o efeito da maprotilina na indução de cura de plasmídeos, que albergam o gene blaNDM-1, em diferentes espécies da família Enterobacteriaceae. Nove isolados pertencentes a diferentes espécies foram incluídas no estudo. Os plasmídeos foram caracterizados quanto ao seu tamanho por eletroforese e por sequenciamento de DNA no sistema Illumina. A persistência plasmidial foi determinada pelo método de contagem em placa em LB ágar com e sem tratamento com maprotilina em concentrações sub-inibitórias (50mg/L). O experimento foi conduzido por 10 dias, representando aproximadamente 100 gerações. Neste estudo evidenciou-se que o grupo das enterobactérias estão envolvidas na disseminação de plasmídeos com blaNDM-1, sendo que plasmídeos do grupo IncF estão mais relacionados a essa dispersão. A maprotilina teve efeito de cura plasmidial em todos os isolados exceto em E. hormaechei \"subsp. oharae\" e C. freundii. O isolado P. rettgeri apresentou maior taxa de perda plasmidial e a análise comparativa da sequência nucleotídica do plasmídeo indicou que a presença da IS5 pode estar relacionada com a diminuição da persistência plasmidial. Diferenças na persistência plasmidial, quando tratados com maprotilina, entre E. hormaechei \"subsp. steigerwaltii\" e E. hormaechei \"subsp. oharae\" sugerem que E. hormaechei \"subsp. oharae\" pode ser um possível disseminador de plasmídeos albergando blaNDM-1, devido a processos de adaptação co-evolutivos. / Metallo- β-lactamases (MBL) are able to hydrolase carbapenems, an antimicrobial class in clinical use with high potency in the treatment of severe infections. The most recently decribed group of MBL is the New-Delhi-Metallo-β-lactamases (NDM). This group is mostly correlated to the spread of resistance mediated by plasmid in Enterobacteriaceae. Understanding the plasmid persistence pattern is important in order to understand the predominance of a given species related to antimicrobial resistance plasmids spread, to unveil molecular mechanisms involved in the increase of plasmid persistence and to develop new drugs which could decrease its persistence. Recent studies have associated maprotiline to a decrease in 90% of plasmid persistence in E. coli K12. In this work, we evaluated the effect of maprotiline in curing plasmids carrying blaNDM-1 in different species of Enterobacteriaceae. Nine isolates belonging to different species were evaluated. Plasmids were characterized by agarose gel electrophoresis and by DNA sequencing with Illumina platform. The plate counting method was used to determine plasmid persistence, with and without sub-inhibitory (50 mg/L) concentration of maprotiline during 10 days, representing approximately 100 generations. We found that Enterobacteriaceae are involved in the spread of NDM-1 plasmid-mediate resistance and the IncF group is the plasmid incompatibility group more frequently involved in this dissemination. Maprotiline showed a plasmid-curing effect in all isolates, except against plasmids of E. hormaechei \"subsp. oharae\" and C. freundii. The P. rettgeri isolate had the highest plasmid-curing rate. Sequencing analysis revealed an IS5 in the plasmid, which could be associated to a decrease in plasmid persistence. The difference between plasmid persistence pattern of plasmids isolated from E. hormaechei \"subsp. steigerwaltii\" and E. hormaechei \"subsp. oharae\", when treated with maprotiline, suggest that E. hormaechei \"subsp. oharae\", could be associated to the spread of plasmids carrying blaNDM-1 due to co-evolution adaptation.

Para a transformação tradicional da levedura Saccharomyces cerevisiae são empregadas cepas hospedeiras que devem necessariamente conter um marcador de auxotrofia, de forma que as células transformadas possam ser selecionadas posteriormente por complementação gênica. Em nosso trabalho construímos um vetor, que dispensa a necessidade destas marcas de auxotrofia, permitindo transformar cepas de leveduras selvagens e, portanto, até mesmo algumas cepas de interesse industrial. Este vetor é composto por um cassete de expressão de interesse (promotor, gene estrutural e terminador) ladeado por dois fragmentos do gene CAN1 de S. cerevisiae. Uma vez que as extremidades deste fragmento, são homólogas às sequências do gene CAN1 da levedura a ser transformada, este irá causar a disrupção genética na região homóloga. Por sua vez, o gene CAN1, quando funcional, é responsável pela permease do aminoácido arginina. Este aminoácido é análogo à canavanina, que entra na célula pelo mesmo mecanismo da arginina, e é uma droga com efeito letal à S. cerevisiae. Após a introdução deste novo vetor, a célula torna-se resistente à canavanina, por impedir a entrada de arginina e, consequentemente de canavanina na célula, permitindo a seleção dos transformantes e mantendo a informação genética adicional clonada 100% estável. Em nosso trabalho, para analisar esta proposta, empregamos o cassete de expressão em que a sequência sinal e estrutural da glicoamilase encontram-se clonadas sob a regulação das sequências promotoras e terminadoras da PGK de S. cerevisiae. Obtivemos sucesso na transformação, tanto de uma cepa de laboratório com marcas auxotróficas, como de células de cepas selvagens, sem nenhuma marca de auxotrofia , utilizadas em processos industriais, FTPT e HTYM-81 que originalmente são sensíveis à canavanina. / Traditionally auxotrophic mutants of Saccharomyces cerevisiae are used as host cells for transformation since the selection of transformants is based on genetic complementation by a marker gene carried on the vector. In this work a vector was constructed which overcomes the need for auxotrophic mutants allowing selection of transformed wild-type strains, including some strains of industrial interest. The vector contains an expression cassette (promoter, structural gene and terminator) which is flanked by two fragments of the CAN 1 gene of S. cerevisiae. Since the ends of this fragment are homologous to the host <i.CAN 1 gene, it disrupts that gene upon transformation. The CAN 1 gene codes for the permease of the amino acid arginine which is analogous to canavanine and enters the cell by the same mechanism. Canavanine, however, is a lethal drug for S. cerevisiae. Since tranformants become resistant to canavanine, because no permease is synthesized, and thus canavanine cannot enter the cell, transformants are easily selected and the additional cloned genetic information is 100% stable. In this work, we employed the expression cassette containing the signal and the coding sequences of glucoamylase of Aspergillus awamori under the control of the promoter and the terminator of phophoglycerate kinase (PGK) of S. cerevisiae. We successfully transformed a laboratory yeast strain carrying auxotrophic markers, as well as two wild-type strains, employed in industrial processes, which originally were sensitive to cananvanine.

As grandes quantidades de antimicrobianos utilizados na produção de aves e suínos é um problema de saúde pública em todo mundo. O surgimento e disseminação de novos mecanismos de resistência a antibióticos de importância clínica em medicina humana e veterinária é fato que tem apontado a entrada de uma era \"pós-antibióticos\". Considerando a importância da avicultura e suinocultura na economia brasileira e os riscos para saúde humana e dos animais, o objetivo deste estudo foi determinar a ocorrência de genes emergentes de resistência aos antibióticos das classes dos &#946;-lactâmicos, quinolonas, fosfomicina e colistina. Foram selecionados 1.152 isolados de Escherichia coli de origem clínica, fecal e de carne de suínos, frangos de corte, poedeiras e perus proveniente dos principais estados produtores e exportadores do Brasil (SP, RS, SC, PR, MG e GO). Através de métodos clássicos de biologia molecular e sequenciamento do genoma completo foi realizada a caracterização genotípica dos isolados, assim como a caracterização dos elementos genéticos móveis que carreavam esses genes. Dentre os isolados de aves (n=773), 103 (13,4%) foram produtores de ESBL: CTX-M-2 (n=61); CTX-M-55 (n=26); CTX-M-8 (n=12); CTX-M-2 + CTX-M-55 (n=3); CTX-M-2+CTX-M-8 (n=1); CTX-M-8+CTX-M-55 (n=1). 44 (5,7%) apresentaram CMY-2, presente em plasmídeos IncI1/ST12 e IncK. Em relação à resistência às quinolonas e colistina mediada por plasmídeos, os genes encontrados foram qnrA1 (1%), qnrB19 (6%) e qnrS1 (0,8%), além de 41 isolados positivos para mcr-1. A ocorrência de genes plasmidiais de resistência à fosfomicina ( fosA3) foi de 3,4%, que estiveram relacionados a plasmídeos epidêmicos IncN/F33:A-:B-. Dentre os isolados de E. coli patogênicas (ETEC, STEC), comensais e de carne de suínos ( n =378) foi encontrada uma alta prevalência de cepas positivas para mcr-1 (33,8%). Foram encontrados três isolados positivos para mcr-3 dentre os isolados de ETEC e comensais. O gene qnrS1 também teve alta prevalência (24,6%). Nos isolados de aves e suínos, o gene mcr-1 esteve presente em plasmídeos IncX4. Análises da sequência completa de DNA de vários plasmídeos mostrou relação com plasmídeos que circulam em criações animais na Ásia. Este estudo contribui para o estabelecimento de um cenário em relação à resistência antimicrobiana na produção animal no Brasil. Levando em conta que o Brasil está entre os maiores exportadores de carne de aves e suínos do mundo, é urgente a elaboração de estratégias para o controle da disseminação de bactérias resistentes a antibióticos clinicamente importantes. / The large amounts of antimicrobials used in the poultry and swine production is a public health concern worldwide. The emergence and spread of novel resistance mechanisms to important antibiotics in human and veterinary medicine is a fact that has pointed to entry into a \"post-antibiotic\" era. Considering the importance of poultry and pig farming in the Brazilian economy and the risks to human and animal health, the aim of this study was to determine the occurrence of emerging resistance genes to &#946;-lactam, quinolones, fosfomycin and colistin antibiotics. A total of 1.152 of clinical, fecal and retail meat isolates of Escherichia coli from from swine, broilers, laying hens and turkeys from the main producing and exporting states of Brazil (SP, RS, SC, PR, MG and GO) were selected. Through classical molecular biology methods and whole genome sequencing, the characterization of the isolates was performed, as well as the characterization of the mobile genetic elements that carried these genes. Among avian isolates (n = 773), 103 (13.4%) were ESBL-producers: CTX-M-2 (n = 61); CTX-M-55 (n = 26); CTX-M-8 (n = 12); CTX-M-2 + CTX-M-55 (n = 3); CTX-M-2 + CTX-M-8 (n = 1); CTX-M-8 + CTX-M-55 (n = 1). 44 (5.7%) showed pAmpC CMY-2, present in IncI1/ST12 and IncK plasmids. An isolate belonging to ST117 harboring bla CMY2 and bla CTX-M-2 integrated into the chromosome. Regarding plasmid-mediated resistance to quinolones and colistin, the genes found were qnrA1 (1%), qnrB19 (6%) and qnrS1 (0.8%), in addition to 41 mcr-1 positive isolates. The occurrence of plasmid-mediated fosfomycin resistance ( fosA3) was 3.4%, which were related to the IncN/F33: A-: B- epidemic plasmids. A high prevalence of mcr-1 positive strains (33.8%) was found among pathogenic (ETEC, STEC) and commensal porcine E. coli isolates (n = 378). Three mcr-3 positive isolates were found among the ETEC and commensal isolates. The qnrS1 gene also had a high prevalence (24.6%). In avian and porcine isolates, the mcr-1 gene was present in IncX4 plasmids. Analyzes of the complete DNA sequence of various plasmids showed relation to plasmids circulating in animal production in Asia. This study contributes to the determination of a national scenario of antimicrobial resistance in animal production in Brazil. Taking into account that Brazil is among the largest exporters of poultry and pork in the world, it is urgent to devise strategies to control the spread of multidrug resistant bacteria to clinically important antibiotics.

Orientador: Iracilda Zeppone Carlos / Banca: Juliana Pfrimer Falcão / Banca: Orivaldo Pereira Ramos / Banca: Fernanda de Freitas Aníbal / Banca: Alexandra Ivo de Medeiros / Resumo: A infecção por Y. pseudotuberculosis é uma causa de doenças intestinais e extraintestinais. A resolução da infecção está relacionada à ativação de células Th1, entretanto, pouco se conhece sobre a influência de outras subpopulações de linfócitos T, como Th17 e Treg, na regulação dessa infecção. Células dendríticas são capazes de orientar a resposta imune adaptativa através da produção de citocinas e apresentação de antígenos às células T, tornando essas células essenciais na ativação e diferenciação de linfócitos T. Desse modo, o presente trabalho avaliou o papel de distintas subpopulações de linfócitos T e a influência de células dendríticas no desenvolvimento da resposta imune contra a infecção por Y. pseudotuberculosis. Para tanto, foram avaliadas as subpopulações de linfócitos T CD4+, CD8+ e Foxp3+, presentes durante a infecção por Y. pseudotuberculosis e amostras bacterianas mutantes para fatores de virulência Yops, bem como a expressão de citocinas intracelulares (IL-2, IL-4, IL-10, IL-17, IFN-γ, TNF-α e TGF-β) por estas células. O papel de linfócitos Treg e Th17 no controle da bactéria foi analisado por meio de ensaio de depleção de células CD25+ e neutralização de IL-17. Além disso, a influência de células dendríticas na modulação da resposta imune contra Y. pseudotuberculosis foi estudada através da determinação da produção de citocinas (IL-6, IL-12, IL-10, IL-23, TNF-α e TGF-β) e co-cultivo com linfócitos T obtidos de animais imunizados com antígenos de Y. pseudotuberculosis. Os resultados mostraram redução na produção de citocinas pró-inflamatórias por células dendríticas infectadas com a amostra bacteriana portadora do plasmídeo de virulência, em ambas as linhagens de camundongos estudadas... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Y. pseudotuberculosis infection is a cause of intestinal and extraintestinal diseases. Infection resolution is related to the activation of Th1 cells, however, little is known about the influence of other T cells subsets, like Th17 and Treg, in the control of this infection. Dendritic cells are capable of directing the adaptive immune response by producing cytokines and presenting antigens to T cells, making them essential to T lymphocytes activation and differentiation. Thus, this study evaluated the role of different T lymphocytes subsets and the influence of dendritic cells on the development of the immune response against Y. pseudotuberculosis infection. Here, we evaluated the T cells subsets CD4+, CD8+ and Foxp3+, present during Y. pseudotuberculosis infection and mutant samples bacterial virulence factors, and also the intracellular expression of cytokines (IL-2, IL-4, IL-10, IL-17, IFN-γ, TNF-α and TGF-β) by these cells. The role of Th17 and Treg cells in controlling the bacteria was analyzed by tests of depleted CD25+ cells and IL-17 neutralization. Furthermore, the influence of dendritic cells in modulating the immune response against Y. pseudotuberculosis was studied by determining the cytokine production (IL-6, IL-12, IL-10, IL-23, TNF-α and TGF-β) and co-culture with lymphocytes from animals immunized with Y. pseudotuberculosis antigens. The results showed a reduction in proinflammatory cytokines production by dendritic cells infected with bacteria carrying the bacterial virulence plasmid, in both mice strains studied... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Bacillus subtilis é uma alternativa ao emprego de Escherichia coli para a produção de proteínas recombinantes. O principal entrave à utilização de B.subtilis para esse fim é a baixa disponibilidade de sistemas de expressão. Nesse trabalho, testamos diferentes plasmídeos e promotores com o objetivo de desenvolver sistemas de expressão heteróloga eficientes. Ao fim do trabalho, propomos dois novos sistemas de expressão baseados do arcabouço do plasmídeo pMTL500E e nos promotores dos genes cdd e gsiB, ambos de B.subtilis. Os dois plasmídeos construídos apresentam expressão constitutiva e demonstraram desempenho superior no tocante à produção de proteínas heterólogas quando comparados ao único sistema comercialmente disponível, conhecido como pHT01. Em uma segunda parte do trabalho, propomos a utilização de Listeria innocua como veículo de entrega para antígenos vacinais. Por meio de ensaios ex-vivo e in vivo, demonstramos que essa bactéria possui potencial promissor para aplicações vacinais, inclusive quando comparada ao bem estabelecido B.subtilis. / Bacillus subtilis is an alternative to the use of Escherichia coli for the production of recombinant proteins. The main bottleneck to the use of B. subtilis for this purpose is the low availability of expression systems. In this study, we evaluated different plasmids and promoters with the aim of developing efficient heterologous expression systems. At the end of this work, we propose two new expression systems based on plasmid pMTL500E and the promoters from cdd and gsiB genes, both of them from B.subtilis. The two plasmids constructed exhibit constitutive expression and demonstrated superior performance regarding the production of heterologous proteins compared to the unique commercially available system, which is known as pHT01. In a second part of the work, we propose the use of Listeria innocua as a delivery vehicle for vaccine antigens. After ex-vivo and in-vivo experiments, we demonstrated that this bacterium has a promising potential for vaccine applications, even when compared to well established B.subtilis.

Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) é um dos principais agentes de diarréia em crianças nos países em desenvolvimento. Esse patótipo pode ser classificado em dois grupos: EPEC típica (t-EPEC) e EPEC atípica (a-EPEC). O objetivo principal deste estudo foi traçar o perfil plasmidial de 78 amostras de a-EPEC bem como investigar em 72 amostras a presença de genes de virulência descritos em outros patótipos de DEC para procura de um marcador de virulência específico deste grupo de amostras. Foi detectada a presença de alguns genes de virulência como: pet (5,5%), pic (2,7%), astA (18%), efa1/lifA, toxB (2,7%), ldaH (8,3%) e ehly1 (4,2%). Os perfis plasmidiais obtidos permitiram verificar que entre as 78 amostras analisadas, 12 não possuem plasmídio, 33 possuem plasmídios entre 50 a 90 kb e 38 possuem plasmídios entre 90 a 124 kb. A pesquisa dos grupos de incompatibilidade revelou que os grupos IncFIB e IncF são os mais freqüentes entre as amostras de a-EPEC. Os resultados de RFLP do DNA plasmidial das amostras do sorotipo O55:H7 sugeriu que existem seqüências de nucleotídeos comuns entre os plasmídios. Os dados obtidos também permitiram inferir a existência de fragmentos de DNA plasmidial comum entre amostras de EHEC O157:H7 e amostras de a-EPEC O55:H7. A função biológica dos plasmídios de a-EPEC e a relação com o plasmídio pO157 necessitam de estudos complementares. / Escherichia coli (EPEC) is one of the main agents of diarrhea in children in developing countries. This pathotype can be classified in two groups: typical EPEC (t-EPEC) and atypical EPEC (a-EPEC). The aim of this study was to determine the plasmid profile of 78 strains of a-EPEC and investigate 72 strains for the presence of virulence genes described in other DEC. It was detected the presence of some virulence genes: pet (5,5%), pic (2,7%), astA (18%), efa1/lifA, toxB (2,7%), ldaH (8,3%) e ehly1 (4,2%). The plasmid profiles obtained allowed us to verify that among the 78 samples analyzed, 12 did not have plasmids, 33 strains have plasmids ranging between 50 and 90 kb, and 38 have plasmids ranging between 90 to 124 kb. Incompatibility groups analysis revealed that IncFIB and IncF groups are the most frequent among the samples of a-EPEC. RFLP analysis of plasmid DNA of strains of serotype O55:H7 suggested that there are nucleotide sequences common to the plasmids. The data also allowed inferring the existence of fragments of plasmid DNA common to EHEC O157:H7 and a-EPEC O55:H7. The biological function of aEPEC plasmid and the relationship with pO157 requires further studies.