A digoxina é um dos medicamentos indicados para o tratamento de falência cardíaca. Possui janela terapêutica estreita, sendo responsável por casos de intoxicação. O único antídoto disponível para a desintoxicação é o anticorpo policlonal DigiFab®, no formato Fab. O seu uso é eficaz, porém de custo elevado. Clones bacterianos produtores de fragmento Fab monoclonal anti-digoxina foram obtidos previamente pelo nosso grupo, pela técnica de phage display. Neste trabalho as variantes Fab dos 4 clones foram expressas em E.coli para estabelecer o método para a purificação. Com a obtenção dos fragmentos Fab purificados, foi caracterizada a sua afinidade ao antígeno e especificidade, em ensaios de inibição por digoxina, digitoxina, digoxigenina e ouabaina. Os parâmetros cinéticos da ligação dos fragmentos Fab dos 4 clones e do DigiFab® foram avaliados por SPR. Nas condições experimentais, não foram verificadas diferenças significativas entre os produtos dos 4 clones e o comercial, demonstrando o potencial dos fragmentos Fab monoclonais obtidos como antídoto à digoxina. / Digoxin is a medication indicated for heart failure treatment. Its therapeutic window is narrow, being responsible for intoxication cases. The only antidote available for the detoxification is a polyclonal antibody - DigiFab® in Fab format. Its use is effective, but costly. Bacterial clones producing anti-digoxin monoclonal Fab fragments were previously obtained by our group using phage display technology. In this work the Fab variants of the 4 clones were expressed in E.coli to establish the purification method. The purified fragments were characterized regarding the affinity to the antigen and the specificity through inhibition assays with digoxin, digitoxin, digoxigenin and ouabain. The binding kinetic parameters of Fab fragments of the 4 clones and the commercial product to Dig-BSA conjugate were assessed by SPR. Under the experimental conditions no significant differences were observed among the 4 clones and the commercial product, demonstrating the potential of monoclonal Fab fragments as an antidote to digoxin.

FGF2 (Fibroblast Growth Factor 2), o fundador da família FGF, tem funções regulatórias na mitogênese, diferenciação, morfogênese e reparo tecidual. Diversas espécies moleculares de FGF2 compartilham uma seqüência C-terminal comum de 155 aminoácidos, pois se originam de diferentes sítios de iniciação de leitura de um único mRNA. O menor, o FGF2-18kDa, é liberado extracelularmente para se ligar a receptores específicos (FGFRs) para disparar as funções parácrinas e autócrinas pelas quais este fator é conhecido. Por outro lado, as espécies maiores (FGF2-21, 22, 22,5 e 34kDa) são intracelulares se ligam a parceiros moleculares desconhecidos para exercer funções intrácrinas ainda indefinidas. O objetivo desta tese foi produzir espécies recombinantes do FGF2-18 e FGF2-22,5, na forma de proteínas de fusão, para analisar funções biológicas e mecanismos de sinalização. Nas células malignas Y1 de camundongo, os recombinantes de FGF2-18kDa (FGF2-18, His-FGF2-18 e His-FGF2-18-ProA) dispararam uma resposta antagônica estimulando as vias de sinalização mitogênica, mas bloqueando o ciclo celular. Nos fibroblastos não tumorigênicos Balb3T3, estes mesmos recombinantes de FGF2-18kDa dispararam apenas a resposta mitogênica clássica. Todos os efeitos biológicos destes recombinantes de FGF2-18kDa foram bloqueados pelo inibidor específico da proteína quinase de tirosina dos FGFRs, PD173074, demonstrando que são respostas intermediadas pelos FGFRs. Portanto, os domínios estruturais adicionados aos recombinantes de FGF2-18kDa não impediram que estas proteínas se ligassem e ativassem os FGFRs. Por outro lado, o recombinante His-FGF2-22,5 dispara apenas as vias de sinalização mitogênica em ambas as células Y1 e 3T3, mas este efeito biológico não é inibido por PD173074. Estes resultados sugerem que a seqüência N-terminal de 55 resíduos, rica em aminoácidos básicos, impede que o FGF2-22,5kDa se ligue e/ou ative os FGFRs. Entretanto, o recombinante His-FGF2-22,5ProA dispara a resposta antagônica característica do FGF2-18kDa. As implicações destes últimos resultados é que o domínio de ProA adicionado ao C-terminal torna o FGF2-22,5kDa um bom ligante dos FGFRs. A interação física entre ligante e receptor das formas recombinantes His-FGF2-18kDa (ou His-FGF2-18ProA) e FGF2-22,5kDa com os putativos FGFRs foi analisada através da técnica de SPR e os resultados mostram KDs aproximados (Kd18=21, 488.10-9 e Kd22,5=20,70393.10-9), enquanto que o número de sítios ligantes em vesículas microssomais das células é significantemente inferior para o FGF2-22,5kDa. Estes resultados são compatíveis com a existência de receptores diferentes para FGF2-18kDa e FGF2-22,5kDa, uma hipótese ainda a ser definitivamente corroborada. Em conclusão, o FGF2-18kDa, mesmo em formas recombinantes como proteína de fusão, dispara todos os efeitos biológicos descritos para FGF2, através dos FGFRs. Diferentemente, o FGF2-22,5kDa, como fator parácrino, só desencadeou a resposta mitogênica clássica de FGF2, provavelmente através de receptores diferentes dos FGFRs. Os resultados e conclusões desta tese têm um potencial indiscutivelmente relevante para a biologia molecular do câncer, com implicações possíveis em terapia oncológica / FGF2 (Fibroblast Growth Factor 2), the founder of the FGF family, has regulatory functions in mitogenesis, differentiation, morphogenesis and tissue repair. Multiple FGF2 molecular species, sharing a C-terminal sequence of 155 amino acids, are translated from different iniciation sites of the same mRNA. The smaller, the FGF2-18kD, is extracellularly released to bind to specific membrane receptors (FGFRs), performing paracrine and autocrine functions. On the other hand, the larger FGF2s (21, 22, 22.5 and 34kDa) are intracellular species that bind to unknown partners to play still undefined intracrine roles. The aim of this thesis was to produce recombinant species of FGF2-18kDa and FGF2-22,5kDa, in the form of fusion proteins, to analyze functions and signaling mechanisms. In mouse Y1 malignant cells, FGF2-18kD recombinants (FGF2-18kDa and His-FGF2-18kDaProA) triggered an antagonistic response activating mitogenic signaling pathways, but blocking the cell cycle. However, in non tumorigenic Balb3T3 fibroblasts, these same FGF2-18kD recombinants only elicited the classical mitogenic response. All biological effects of these FGF2-18kD recombinants were blocked by the specific inhibitor of FGFR-protein-tyrosine-kinases, PD173074, demonstrating that these responses are mediated by FGFRs. Therefore, the new peptide domains added to FGF2-18kD did not prevent these recombinant fusion proteins to bind and activate FGFRs. Conversely, the recombinant His-FGF2-22,5kDa triggered only mitogenic signaling pathways in both Y1 and Balb3T3 cells, a biological effect not inhibited by PD173074. These results suggested that the additional basic-rich N-terminal sequence of 55 amino acid residues, found in FGF2-22,5kDa, prevents this FGF2 species from binding and / or activate FGFRs. However, surprisingly, the recombinant His-FGF2-22kDaProA triggered the antagonistic response characteristic of FGF2-18kDa. These results imply that the ProA-domain added to the C-terminal end rendered the FGF2-22,5kDaProA a good ligand of FGFRs. The physical interaction between recombinants of both His-FGF2-18kD and His-FGF2-22kDa with putative FGFRs, analyzed by SPR, yielded close KD values (KD18=21, 5.10-9 e K D22,5=20,7.10-9), while the number of binding sites in cell microsomal vesicles were significantly lower for the His-FGF2-22,5kDa. These results are consistent with the existence of different receptors for FGF2 and FGF2-18kD-22,5kDa, a hypothesis that has yet to be definitively confirmed. In conclusion, FGF2-18kD, even as recombinant fusion proteins, triggered all biological effects of FGF2, through FGFRs. Conversely, the FGF2-22, 5kDa only triggered the classical mitogenic response, probably via receptors other than FGFRs. The results and conclusions of this thesis are potentially of great interest in cancer molecular biology, with implications in oncologic therapy.

Submitted by Luciclea Silva (luci@ufpa.br) on 2018-11-07T17:44:17Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_Analisesensorplasmonico.pdf: 58582813 bytes, checksum: 62d54676129f2473b215396ee3ac3f92 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciclea Silva (luci@ufpa.br) on 2018-11-07T17:44:38Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_Analisesensorplasmonico.pdf: 58582813 bytes, checksum: 62d54676129f2473b215396ee3ac3f92 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-11-07T17:44:38Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_Analisesensorplasmonico.pdf: 58582813 bytes, checksum: 62d54676129f2473b215396ee3ac3f92 (MD5) Previous issue date: 2018-09-28 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / No presente trabalho, é apresentado um estudo teórico sobre um sensor de ressonância plasmônica na configuração de Emissão Acoplada por Plasma de Superfície (SPCE). Acoplado à estrutura do sensor, está um canal microfluídico contendo em suspensão partículas-alvo (nanopartículas de ouro funcionalizadas para atrair moléculas fluorescentes), que quando excitadas e imobilizadas sobre a estrutura do sensor, podem ser eficientemente modeladas como um arranjo planar de dipolos induzidos. A modelagem eletromagnética do dispositivo foi realizada através do potencial magnético, definido por meio da Função de Green Periódica (PGF) 3D. Os campos eletromagnéticos são apresentados em termos da representação espectral discreta através da série complexa dupla de Fourier, e para reduzir o número de termos nas séries, é proposto utilizar-se a identidade de Euler. Primeiramente, são apresentados resultados paramétricos de campo na estrutura do sensor e, em seguida, é feita a análise espectral do campo potencial magnético, onde se verificou o surgimento dos polos SPP e SW no domínio espectral. Para validação do método, foram realizadas análises do caso limite, em que as partículas se encontram distantes umas das outras, sendo comparadas com trabalhos publicados. Por fim, são apresentados resultados e discussões sobre a convergência das séries na PGF cossenoidal. Os resultados apresentam boa concordância, demonstrando que o método teórico da PGF 3D é eficiente, e pode ser utilizado como ferramenta no projeto deste dispositivo de sensoriamento. / In the present work, a theoretical study on a plasmon resonance sensor in the Surface Plasmon Coupled Emission (SPCE) configuration is presented. Coupled to the sensor structure is a microfluidic channel containing suspended target particles (gold nanoparticles functionalized to attract fluorescent molecules), which when excited and immobilized upon the sensor structure can be efficiently modeled as a planar array of induced dipoles. The electromagnetic modeling of the device was performed by the magnetic potential, defined by means of the Periodic Green Function (PGF) 3D. The electromagnetic fields are presented in terms of the discrete spectral representation by the complex double Fourier series, and to reduce the number of terms in the series, it is proposed the use the Euler identity. Firstly, parametric field results are presented in the sensor structure, and then the spectral analysis of the magnetic potential field is performed, where the SPP and SW poles appear in the spectral domain. For the validation of the method, the limit case was analyzed, in which the particles are distant from each other, and compared with published works. Finally, results and discussions about the convergence of series in the cosine PGF are presented. The results show good agreement, showing that the theoretical method of PGF 3D is efficient, and can be used as a tool in the design of this sensing device. / IFPA - Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Pará

FGF2 (Fibroblast Growth Factor 2), o fundador da família FGF, tem funções regulatórias na mitogênese, diferenciação, morfogênese e reparo tecidual. Diversas espécies moleculares de FGF2 compartilham uma seqüência C-terminal comum de 155 aminoácidos, pois se originam de diferentes sítios de iniciação de leitura de um único mRNA. O menor, o FGF2-18kDa, é liberado extracelularmente para se ligar a receptores específicos (FGFRs) para disparar as funções parácrinas e autócrinas pelas quais este fator é conhecido. Por outro lado, as espécies maiores (FGF2-21, 22, 22,5 e 34kDa) são intracelulares se ligam a parceiros moleculares desconhecidos para exercer funções intrácrinas ainda indefinidas. O objetivo desta tese foi produzir espécies recombinantes do FGF2-18 e FGF2-22,5, na forma de proteínas de fusão, para analisar funções biológicas e mecanismos de sinalização. Nas células malignas Y1 de camundongo, os recombinantes de FGF2-18kDa (FGF2-18, His-FGF2-18 e His-FGF2-18-ProA) dispararam uma resposta antagônica estimulando as vias de sinalização mitogênica, mas bloqueando o ciclo celular. Nos fibroblastos não tumorigênicos Balb3T3, estes mesmos recombinantes de FGF2-18kDa dispararam apenas a resposta mitogênica clássica. Todos os efeitos biológicos destes recombinantes de FGF2-18kDa foram bloqueados pelo inibidor específico da proteína quinase de tirosina dos FGFRs, PD173074, demonstrando que são respostas intermediadas pelos FGFRs. Portanto, os domínios estruturais adicionados aos recombinantes de FGF2-18kDa não impediram que estas proteínas se ligassem e ativassem os FGFRs. Por outro lado, o recombinante His-FGF2-22,5 dispara apenas as vias de sinalização mitogênica em ambas as células Y1 e 3T3, mas este efeito biológico não é inibido por PD173074. Estes resultados sugerem que a seqüência N-terminal de 55 resíduos, rica em aminoácidos básicos, impede que o FGF2-22,5kDa se ligue e/ou ative os FGFRs. Entretanto, o recombinante His-FGF2-22,5ProA dispara a resposta antagônica característica do FGF2-18kDa. As implicações destes últimos resultados é que o domínio de ProA adicionado ao C-terminal torna o FGF2-22,5kDa um bom ligante dos FGFRs. A interação física entre ligante e receptor das formas recombinantes His-FGF2-18kDa (ou His-FGF2-18ProA) e FGF2-22,5kDa com os putativos FGFRs foi analisada através da técnica de SPR e os resultados mostram KDs aproximados (Kd18=21, 488.10-9 e Kd22,5=20,70393.10-9), enquanto que o número de sítios ligantes em vesículas microssomais das células é significantemente inferior para o FGF2-22,5kDa. Estes resultados são compatíveis com a existência de receptores diferentes para FGF2-18kDa e FGF2-22,5kDa, uma hipótese ainda a ser definitivamente corroborada. Em conclusão, o FGF2-18kDa, mesmo em formas recombinantes como proteína de fusão, dispara todos os efeitos biológicos descritos para FGF2, através dos FGFRs. Diferentemente, o FGF2-22,5kDa, como fator parácrino, só desencadeou a resposta mitogênica clássica de FGF2, provavelmente através de receptores diferentes dos FGFRs. Os resultados e conclusões desta tese têm um potencial indiscutivelmente relevante para a biologia molecular do câncer, com implicações possíveis em terapia oncológica / FGF2 (Fibroblast Growth Factor 2), the founder of the FGF family, has regulatory functions in mitogenesis, differentiation, morphogenesis and tissue repair. Multiple FGF2 molecular species, sharing a C-terminal sequence of 155 amino acids, are translated from different iniciation sites of the same mRNA. The smaller, the FGF2-18kD, is extracellularly released to bind to specific membrane receptors (FGFRs), performing paracrine and autocrine functions. On the other hand, the larger FGF2s (21, 22, 22.5 and 34kDa) are intracellular species that bind to unknown partners to play still undefined intracrine roles. The aim of this thesis was to produce recombinant species of FGF2-18kDa and FGF2-22,5kDa, in the form of fusion proteins, to analyze functions and signaling mechanisms. In mouse Y1 malignant cells, FGF2-18kD recombinants (FGF2-18kDa and His-FGF2-18kDaProA) triggered an antagonistic response activating mitogenic signaling pathways, but blocking the cell cycle. However, in non tumorigenic Balb3T3 fibroblasts, these same FGF2-18kD recombinants only elicited the classical mitogenic response. All biological effects of these FGF2-18kD recombinants were blocked by the specific inhibitor of FGFR-protein-tyrosine-kinases, PD173074, demonstrating that these responses are mediated by FGFRs. Therefore, the new peptide domains added to FGF2-18kD did not prevent these recombinant fusion proteins to bind and activate FGFRs. Conversely, the recombinant His-FGF2-22,5kDa triggered only mitogenic signaling pathways in both Y1 and Balb3T3 cells, a biological effect not inhibited by PD173074. These results suggested that the additional basic-rich N-terminal sequence of 55 amino acid residues, found in FGF2-22,5kDa, prevents this FGF2 species from binding and / or activate FGFRs. However, surprisingly, the recombinant His-FGF2-22kDaProA triggered the antagonistic response characteristic of FGF2-18kDa. These results imply that the ProA-domain added to the C-terminal end rendered the FGF2-22,5kDaProA a good ligand of FGFRs. The physical interaction between recombinants of both His-FGF2-18kD and His-FGF2-22kDa with putative FGFRs, analyzed by SPR, yielded close KD values (KD18=21, 5.10-9 e K D22,5=20,7.10-9), while the number of binding sites in cell microsomal vesicles were significantly lower for the His-FGF2-22,5kDa. These results are consistent with the existence of different receptors for FGF2 and FGF2-18kD-22,5kDa, a hypothesis that has yet to be definitively confirmed. In conclusion, FGF2-18kD, even as recombinant fusion proteins, triggered all biological effects of FGF2, through FGFRs. Conversely, the FGF2-22, 5kDa only triggered the classical mitogenic response, probably via receptors other than FGFRs. The results and conclusions of this thesis are potentially of great interest in cancer molecular biology, with implications in oncologic therapy.

A digoxina é um dos medicamentos indicados para o tratamento de falência cardíaca. Possui janela terapêutica estreita, sendo responsável por casos de intoxicação. O único antídoto disponível para a desintoxicação é o anticorpo policlonal DigiFab®, no formato Fab. O seu uso é eficaz, porém de custo elevado. Clones bacterianos produtores de fragmento Fab monoclonal anti-digoxina foram obtidos previamente pelo nosso grupo, pela técnica de phage display. Neste trabalho as variantes Fab dos 4 clones foram expressas em E.coli para estabelecer o método para a purificação. Com a obtenção dos fragmentos Fab purificados, foi caracterizada a sua afinidade ao antígeno e especificidade, em ensaios de inibição por digoxina, digitoxina, digoxigenina e ouabaina. Os parâmetros cinéticos da ligação dos fragmentos Fab dos 4 clones e do DigiFab® foram avaliados por SPR. Nas condições experimentais, não foram verificadas diferenças significativas entre os produtos dos 4 clones e o comercial, demonstrando o potencial dos fragmentos Fab monoclonais obtidos como antídoto à digoxina. / Digoxin is a medication indicated for heart failure treatment. Its therapeutic window is narrow, being responsible for intoxication cases. The only antidote available for the detoxification is a polyclonal antibody - DigiFab® in Fab format. Its use is effective, but costly. Bacterial clones producing anti-digoxin monoclonal Fab fragments were previously obtained by our group using phage display technology. In this work the Fab variants of the 4 clones were expressed in E.coli to establish the purification method. The purified fragments were characterized regarding the affinity to the antigen and the specificity through inhibition assays with digoxin, digitoxin, digoxigenin and ouabain. The binding kinetic parameters of Fab fragments of the 4 clones and the commercial product to Dig-BSA conjugate were assessed by SPR. Under the experimental conditions no significant differences were observed among the 4 clones and the commercial product, demonstrating the potential of monoclonal Fab fragments as an antidote to digoxin.

O objetivo deste trabalho foi desenvolver biosensores de membranas baseados na técnica de Ressonância Plasmônica de Superfície (SPR) e aplicá-los no estudo da interação do citocromo c (cit c) com modelos de membranas. SPR é uma técnica ótica, que através de medidas de variações de índice de refração (n) próximas a uma interface mensura com alta sensibilidade a adsorção ou ligação de moléculas. Inicialmente desenvolvemos um sistema de gradiente de fluxo acoplado ao SPR, denominado FIG-SPR, e demonstramos a determinação automatizada da variação de n em função da concentração (dn/dC) de diferentes compostos e biopolímeros. O desenvolvimento dos biosensores de membranas iniciou-se com o estudo dos fatores que afetam a formação de uma membrana de bicamada híbrida (HBM). HBMs são compostas de uma monocamada de alcanotiol adsorvida sobre o ouro, e sobre esta uma camada fosfolipídica. A formação da HBM depende da fusão de vesículas em superfícies hidrofóbicas e que não é bem compreendido no nível molecular. Nossos estudos mostraram que na presença de cálcio e espermina a formação da HBM é favorecida, de tal forma que a monocamada de fosfolipídio alcança valores de espessura próximos àqueles previstos, cerca de 20 Å\'. Além disso, mostramos que em soluções de baixa força iônica a camada lipídica não é homogênea. Demonstramos também que a presença de cálcio na concentração 150 mM diminui o tempo de formação da monocamada lipídica cerca de 14 vezes quando comparado ao tempo indicado na literatura. A homogeneidade da HBM e a carga superficial da mesma foram verificadas com a adsorção e a dissociação de cit c e de albumina bovina (BSA). Utilizando HBMs de composição lipídica variada demonstramos a adsorção e a dissociação de cit c induzida por cálcio em HBMs mistas, incluindo um modelo mimético da membrana mitocondrial interna (IMM) constituído de fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina e cardiolipina (PC/PE/CL) na proporção (4,5:3,5:2,0). Demonstramos que a adsorção de cit c nativo segue um perfil cooperativo e padrões esperados de variação de afinidade e cooperatividade em pHs 6,8, 7,4 e 8,0. Um modelo matemático foi desenvolvido para tratar as curvas de ligação de cit c, que é uma adaptação do modelo de Hill para adsorção de proteínas em superfícies. Os resultados de SPR juntamente com dados obtidos por Microscopia de Força Atômica (AFM) sugerem que a ligação cooperativa de cit c com HBM ocorre devido à reorganização das moléculas de CL e formação de domínios fosfolipídicos. O tratamento dos resultados cinéticos da dissociação de cit c por cálcio indica a existência de duas constantes de velocidade de dissociação (kd), sendo a primeira constante (kd1) relacionada à perda das interações eletrostáticas entre a proteína e a HBM, e a segunda (kd2) à perda das interações hidrofóbicas. Além disso, a dissociação do cit c do modelo estudado requer uma concentração mínima de cálcio de 30 µM para se tornar significativa. O estudo da interação entre moléculas de cit c foto-oxidadas (citc405) e a HBM de PC/PE/CL sugerem que ela ocorre com menor afinidade, nos três pHs estudados, se comparados aos resultados com cit c nativo. Além disso, nossos resultados sugerem que o citc405 não é facilmente dissociado por cálcio devido à perda da cooperatividade na interação. Possíveis implicações em eventos celulares destas descobertas, como a liberação do cit c da IMM e a iniciação da apoptose, são discutidas / The aim of this work was to develop membrane biosensors based on Surface Plasmon Resonance (SPR) and to apply them to study the interactions between cytochrome c (cyt c) and model membranes. SPR is an optical technique that provides high-sensitivity measurements of refractive index (n), allowing the characterization of the adsorption and desorption of molecules near interfaces. Initially we developed a flow gradient system connected to SPR, which was called FIG-SPR, and demonstrated the automated determination of the concentration gradient of refractive index (dn/dC) of different materials and biopolymers. The development of the membrane biosensors was initiated by studying the factors that affect the formation of a hybrid bilayer membrane (HBM). HBMs are composed of two monolayers: an alcanethiol monolayer adsorbed on gold over which is adsorbed a layer of phospholipids. The formation of an HBM depends on the fusion of phospholipid vesicles on hydrophobic surfaces, a process that is not well understood at the molecular level. Our results showed that in the presence of calcium and spermine the complete formation of an HBM is facilitated, i.e., the phospholipid monolayer reaches the expected thickness of about 20Å\'. However, in low ionic strength solutions the lipid layer that is formed is not homogeneous. We have also demonstrated that in the presence of 150 mM of calcium the time necessary for the formation of the lipid monolayer is reduced 14 times when compared to the times suggested in the literature. The homogeneity of the HBM and its superficial charge were verified with the adsorption and desorption of cyt c and bovine serum albumine (BSA). The adsorption and desorption of cyt c in different HBMs were studied including a model of the internal mitochondrial membrane (IMM), which is made of phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine and cardiolipin (PC/PE/CL) in the ratio (4,5: 3,5: 2,0). We demonstrated that the adsorption of native cyt c follows a cooperative profile showing expected changes in affinity and cooperativity in different solution pHs of 6,8, 7,4 and 8,0. A mathematical model, which is an adaptation of the Hill model for adsorption of proteins in surfaces, was developed to treat the binding curves of cyt c. The results of SPR together with those obtained by Atomic Force Microscopy (AFM) suggested that the cooperative binding of cyt c in HBMs occurs due to the reorganization of CL molecules and formation of phospholipid domains. The kinetic results of the dissociation of cyt c induced by calcium indicates the existence of two velocity constants (kd), being the larger (kd1) related to the dissociation of cyt c interacting electrostatically with the HBM, and the smaller (kd2) related to the dissociation of cyt c interacting hydrophobically with the HBM. Moreover, the dissociation of cyt c from the HBM requires a minimum calcium concentration of 30 µM. The study of the interaction between photo-oxidized cyt c molecules (cytc405) and the PC/PE/CL HBM suggests that it occurs with smaller affinity when compared with the results obtained with the native cyt c. Moreover, cytc405 is not easily dissociated by calcium due to the loss of the interaction cooperativity with the HBM. Possible implications of these discoveries in cellular events, such as the release of cyt c from the IMM and the initiation of apoptosis, are discussed

Os receptores dos hormônios da tireóide (TRs) são fatores de transcrição envolvidos na diferenciação celular, metabolismo e funções fisiológicas da maioria dos tecidos. Muitos estudos mostram que diversos efeitos farmacológicos mediados pelos TRs podem ser benéficos na farmacoterapia, especialmente aqueles mediados pelo TR que podem ser úteis em condições médicas importantes como obesidade, hipercolesterolemia e diabetes. Além disso, a descoberta que o TR é a isoforma predominante no coração, mediando a maioria dos efeitos cardiovasculares prejudiciais, estimulou a pesquisa por ligantes seletivos para o TR que poderiam ser utilizados em quadros clínicos importantes com perfil de segurança aceitável. Foi realizado um estudo das relações quantitativas entre a estrutura e atividade (QSAR) de um conjunto de compostos com atividade biológica descrita para TR e TR, que gerou modelos de Holograma QSAR com elevada consistência interna e externa, apresentando bom poder de correlação e predição das propriedades biológicas. Também foi realizado um minucioso estudo de triagem virtual, que propiciou a seleção de 7 compostos que foram adquiridos para terem suas atividades biológicas avaliadas. Ensaios de transfecção e gene repórter foram estabelecidos e utilizados na avaliação da atividade biológica dos compostos selecionados pelo ensaio virtual. Finalmente, um ensaio utilizando ressonância plasmônica de superfície (SPR) foi desenvolvido e utilizado para avaliar a atividade agonista desses compostos, e que pode ser útil para avaliar a atividade de novos ligantes. A técnica de SPR também foi empregada em um cuidadoso estudo da interação do TR com seus correguladores, que incluiu estudos cinéticos e termodinâmicos, propiciando a determinação das taxas cinéticas e parâmetros termodinâmicos para a interação do complexo TR-T3 com peptídeos derivados de dois de seus correguladores. Os resultados obtidos são relevantes e devem ser considerados no planejamento de futuros experimentos utilizando o LBD de TR e agonistas. / The thyroid hormone receptors (TRs) are transcriptional factors involved in cell differentiation, development, metabolism and physiological function of most tissues. Many lines of evidence show that several pharmacological actions of TRs might be beneficial in medical therapy, specially those mediated by TR that target important medical conditions like obesity, hypercholesterolemia and diabetes. Additionally, the findings that TR is the predominant isoform in the heart and mediates most of the TRs deleterious cardiovascular effects, stimulated the research for selective TR ligands which could address important medical needs with an acceptable safety profile. In this PhD thesis, studies of the quantitative structure-activity relationships (QSAR) of a dataset of compounds with reported biologic activity for both TR and TR were performed, and statistically significant Hologram QSAR models with good predictive ability for untested compounds were created. In parallel, a careful virtual screening procedure was executed, leading to the selection of 7 compounds which were purchased for the evaluation of their biological activities. Cell transfection and reporter gene assays were developed, validated and used to evaluate the biological activities of these compounds. Finally, a surface plasmon resonance (SPR) assay was developed and used to assess the agonistic activity of these compounds. The SPR technique was also employed in a careful study of the interaction between the ligand binding domain of TR and peptides derived from its coregulators, which included the determination of the kinetic and thermodynamic parameters for this interaction. The results suggest that flexibility plays an important role in the interaction between the receptor and its coregulators, and point out important aspects of experimental design that should be addressed when using TR LBD and its agonists. Furthermore, the methodology described here may be useful for the identification of new TR ligands.

Submitted by Luciclea Silva (luci@ufpa.br) on 2018-12-12T13:15:28Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_Nanoantena óptica plasmonica.pdf: 23349313 bytes, checksum: 457f78e800d1a6964cd87f3417bc783d (MD5) / Approved for entry into archive by Luciclea Silva (luci@ufpa.br) on 2018-12-12T13:15:51Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_Nanoantena óptica plasmonica.pdf: 23349313 bytes, checksum: 457f78e800d1a6964cd87f3417bc783d (MD5) / Made available in DSpace on 2018-12-12T13:15:51Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_Nanoantena óptica plasmonica.pdf: 23349313 bytes, checksum: 457f78e800d1a6964cd87f3417bc783d (MD5) Previous issue date: 2018-10-11 / Neste trabalho é analisado um novo modelo de nanoantena óptica plasmônica. A nanoantena denominada dipolo-espira é obtida pela combinação de uma antena dipolo cilíndrica e uma espira parasita cilíndrica. Este novo modelo de antena é investigado e aplicado em nanocircuito óptico plasmônico e em nanoenlace óptico sem fio. A modelagem da antena e de suas aplicações são feitas pelo Método dos Momentos (MoM) linear. Para a nanoantena, são investigadas a impedância de entrada, coeficiente de reflexão, largura de banda, eficiência de radiação, ganho, campo elétrico próximo, diagrama de radiação e o efeito de um substrato de dióxido de silício nas propriedades ressonantes da antena. Contudo, o foco principal é a largura de banda. Para o nanocircuito, é investigado o casamento de impedância, aplicando o conceito de casamento de impedância em analogia com a teoria de radiofrequência, variando os parâmetros da antena emissora. Para o nanoenlace, é analisada a potência recebida na carga em função da frequência e distância entre transmissor e receptor. Além disso, é feita uma comparação da perda com a distância do nanoenlace com uma linha de transmissão óptica bifilar. Os resultados mostram que a antena dipolo-espira apresenta característica evidente de largura de banda larga, com valores de até 45.4 % e, no geral, esta largura de banda esteve entre 36.7 e 45.4 %. Esta antena aplicada a nanocircuito pode melhorar o grau de casamento de impedância (coeficiente de reflexão de tensão mínimo de −25 dB) em relação às antenas dipolo. Além disso, ao utilizá-la em nanoenlace óptico sem fio pode-se aumentar a largura de banda operacional na faixa de 179.1 a 202.5 THz, em comparação com nanoenlace convencional baseado apenas em antenas dipolo. Além do mais, os nanoenlaces sem fio, baseados em antenas dipolo-espira ou dipolo, são mais adequados do que nanoenlace com fio para distâncias acima de aproximadamente 22 μm.

Os receptores dos hormônios da tireóide (TRs) são fatores de transcrição envolvidos na diferenciação celular, metabolismo e funções fisiológicas da maioria dos tecidos. Muitos estudos mostram que diversos efeitos farmacológicos mediados pelos TRs podem ser benéficos na farmacoterapia, especialmente aqueles mediados pelo TR que podem ser úteis em condições médicas importantes como obesidade, hipercolesterolemia e diabetes. Além disso, a descoberta que o TR é a isoforma predominante no coração, mediando a maioria dos efeitos cardiovasculares prejudiciais, estimulou a pesquisa por ligantes seletivos para o TR que poderiam ser utilizados em quadros clínicos importantes com perfil de segurança aceitável. Foi realizado um estudo das relações quantitativas entre a estrutura e atividade (QSAR) de um conjunto de compostos com atividade biológica descrita para TR e TR, que gerou modelos de Holograma QSAR com elevada consistência interna e externa, apresentando bom poder de correlação e predição das propriedades biológicas. Também foi realizado um minucioso estudo de triagem virtual, que propiciou a seleção de 7 compostos que foram adquiridos para terem suas atividades biológicas avaliadas. Ensaios de transfecção e gene repórter foram estabelecidos e utilizados na avaliação da atividade biológica dos compostos selecionados pelo ensaio virtual. Finalmente, um ensaio utilizando ressonância plasmônica de superfície (SPR) foi desenvolvido e utilizado para avaliar a atividade agonista desses compostos, e que pode ser útil para avaliar a atividade de novos ligantes. A técnica de SPR também foi empregada em um cuidadoso estudo da interação do TR com seus correguladores, que incluiu estudos cinéticos e termodinâmicos, propiciando a determinação das taxas cinéticas e parâmetros termodinâmicos para a interação do complexo TR-T3 com peptídeos derivados de dois de seus correguladores. Os resultados obtidos são relevantes e devem ser considerados no planejamento de futuros experimentos utilizando o LBD de TR e agonistas. / The thyroid hormone receptors (TRs) are transcriptional factors involved in cell differentiation, development, metabolism and physiological function of most tissues. Many lines of evidence show that several pharmacological actions of TRs might be beneficial in medical therapy, specially those mediated by TR that target important medical conditions like obesity, hypercholesterolemia and diabetes. Additionally, the findings that TR is the predominant isoform in the heart and mediates most of the TRs deleterious cardiovascular effects, stimulated the research for selective TR ligands which could address important medical needs with an acceptable safety profile. In this PhD thesis, studies of the quantitative structure-activity relationships (QSAR) of a dataset of compounds with reported biologic activity for both TR and TR were performed, and statistically significant Hologram QSAR models with good predictive ability for untested compounds were created. In parallel, a careful virtual screening procedure was executed, leading to the selection of 7 compounds which were purchased for the evaluation of their biological activities. Cell transfection and reporter gene assays were developed, validated and used to evaluate the biological activities of these compounds. Finally, a surface plasmon resonance (SPR) assay was developed and used to assess the agonistic activity of these compounds. The SPR technique was also employed in a careful study of the interaction between the ligand binding domain of TR and peptides derived from its coregulators, which included the determination of the kinetic and thermodynamic parameters for this interaction. The results suggest that flexibility plays an important role in the interaction between the receptor and its coregulators, and point out important aspects of experimental design that should be addressed when using TR LBD and its agonists. Furthermore, the methodology described here may be useful for the identification of new TR ligands.

O objetivo deste trabalho foi desenvolver biosensores de membranas baseados na técnica de Ressonância Plasmônica de Superfície (SPR) e aplicá-los no estudo da interação do citocromo c (cit c) com modelos de membranas. SPR é uma técnica ótica, que através de medidas de variações de índice de refração (n) próximas a uma interface mensura com alta sensibilidade a adsorção ou ligação de moléculas. Inicialmente desenvolvemos um sistema de gradiente de fluxo acoplado ao SPR, denominado FIG-SPR, e demonstramos a determinação automatizada da variação de n em função da concentração (dn/dC) de diferentes compostos e biopolímeros. O desenvolvimento dos biosensores de membranas iniciou-se com o estudo dos fatores que afetam a formação de uma membrana de bicamada híbrida (HBM). HBMs são compostas de uma monocamada de alcanotiol adsorvida sobre o ouro, e sobre esta uma camada fosfolipídica. A formação da HBM depende da fusão de vesículas em superfícies hidrofóbicas e que não é bem compreendido no nível molecular. Nossos estudos mostraram que na presença de cálcio e espermina a formação da HBM é favorecida, de tal forma que a monocamada de fosfolipídio alcança valores de espessura próximos àqueles previstos, cerca de 20 Å\'. Além disso, mostramos que em soluções de baixa força iônica a camada lipídica não é homogênea. Demonstramos também que a presença de cálcio na concentração 150 mM diminui o tempo de formação da monocamada lipídica cerca de 14 vezes quando comparado ao tempo indicado na literatura. A homogeneidade da HBM e a carga superficial da mesma foram verificadas com a adsorção e a dissociação de cit c e de albumina bovina (BSA). Utilizando HBMs de composição lipídica variada demonstramos a adsorção e a dissociação de cit c induzida por cálcio em HBMs mistas, incluindo um modelo mimético da membrana mitocondrial interna (IMM) constituído de fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina e cardiolipina (PC/PE/CL) na proporção (4,5:3,5:2,0). Demonstramos que a adsorção de cit c nativo segue um perfil cooperativo e padrões esperados de variação de afinidade e cooperatividade em pHs 6,8, 7,4 e 8,0. Um modelo matemático foi desenvolvido para tratar as curvas de ligação de cit c, que é uma adaptação do modelo de Hill para adsorção de proteínas em superfícies. Os resultados de SPR juntamente com dados obtidos por Microscopia de Força Atômica (AFM) sugerem que a ligação cooperativa de cit c com HBM ocorre devido à reorganização das moléculas de CL e formação de domínios fosfolipídicos. O tratamento dos resultados cinéticos da dissociação de cit c por cálcio indica a existência de duas constantes de velocidade de dissociação (kd), sendo a primeira constante (kd1) relacionada à perda das interações eletrostáticas entre a proteína e a HBM, e a segunda (kd2) à perda das interações hidrofóbicas. Além disso, a dissociação do cit c do modelo estudado requer uma concentração mínima de cálcio de 30 µM para se tornar significativa. O estudo da interação entre moléculas de cit c foto-oxidadas (citc405) e a HBM de PC/PE/CL sugerem que ela ocorre com menor afinidade, nos três pHs estudados, se comparados aos resultados com cit c nativo. Além disso, nossos resultados sugerem que o citc405 não é facilmente dissociado por cálcio devido à perda da cooperatividade na interação. Possíveis implicações em eventos celulares destas descobertas, como a liberação do cit c da IMM e a iniciação da apoptose, são discutidas / The aim of this work was to develop membrane biosensors based on Surface Plasmon Resonance (SPR) and to apply them to study the interactions between cytochrome c (cyt c) and model membranes. SPR is an optical technique that provides high-sensitivity measurements of refractive index (n), allowing the characterization of the adsorption and desorption of molecules near interfaces. Initially we developed a flow gradient system connected to SPR, which was called FIG-SPR, and demonstrated the automated determination of the concentration gradient of refractive index (dn/dC) of different materials and biopolymers. The development of the membrane biosensors was initiated by studying the factors that affect the formation of a hybrid bilayer membrane (HBM). HBMs are composed of two monolayers: an alcanethiol monolayer adsorbed on gold over which is adsorbed a layer of phospholipids. The formation of an HBM depends on the fusion of phospholipid vesicles on hydrophobic surfaces, a process that is not well understood at the molecular level. Our results showed that in the presence of calcium and spermine the complete formation of an HBM is facilitated, i.e., the phospholipid monolayer reaches the expected thickness of about 20Å\'. However, in low ionic strength solutions the lipid layer that is formed is not homogeneous. We have also demonstrated that in the presence of 150 mM of calcium the time necessary for the formation of the lipid monolayer is reduced 14 times when compared to the times suggested in the literature. The homogeneity of the HBM and its superficial charge were verified with the adsorption and desorption of cyt c and bovine serum albumine (BSA). The adsorption and desorption of cyt c in different HBMs were studied including a model of the internal mitochondrial membrane (IMM), which is made of phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine and cardiolipin (PC/PE/CL) in the ratio (4,5: 3,5: 2,0). We demonstrated that the adsorption of native cyt c follows a cooperative profile showing expected changes in affinity and cooperativity in different solution pHs of 6,8, 7,4 and 8,0. A mathematical model, which is an adaptation of the Hill model for adsorption of proteins in surfaces, was developed to treat the binding curves of cyt c. The results of SPR together with those obtained by Atomic Force Microscopy (AFM) suggested that the cooperative binding of cyt c in HBMs occurs due to the reorganization of CL molecules and formation of phospholipid domains. The kinetic results of the dissociation of cyt c induced by calcium indicates the existence of two velocity constants (kd), being the larger (kd1) related to the dissociation of cyt c interacting electrostatically with the HBM, and the smaller (kd2) related to the dissociation of cyt c interacting hydrophobically with the HBM. Moreover, the dissociation of cyt c from the HBM requires a minimum calcium concentration of 30 µM. The study of the interaction between photo-oxidized cyt c molecules (cytc405) and the PC/PE/CL HBM suggests that it occurs with smaller affinity when compared with the results obtained with the native cyt c. Moreover, cytc405 is not easily dissociated by calcium due to the loss of the interaction cooperativity with the HBM. Possible implications of these discoveries in cellular events, such as the release of cyt c from the IMM and the initiation of apoptosis, are discussed