As doenças negligenciadas são conseqüências marcantes do subdesenvolvimento que atinge diversas regiões do planeta. Dentre estas, destaca-se a Doença de Chagas, causada pelo parasita Trypanosoma cruzi, a qual afeta aproximadamente um quarto da população da América Latina e para qual os fármacos utilizados apresentam baixa eficácia, toxidez e sérios efeitos colaterais. Este quadro é agravado pela emergência de cepas resistentes, o que indica a grande necessidade de desenvolvimento de novos agentes quimioterápicos contra esta doença. A enzima gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) da via glicolítica do T. cruzi é um alvo macromolecular interessante devido ao seu papel essencial no metabolismo de tripanossomatídeos. Constitui o objetivo desta tese o desenvolvimento, a padronização e a validação de ensaios enzimáticos para a realização de extensivas triagens bioquímicas de modo a contribuir para a identificação de novos inibidores da GAPDH pertencentes a diversas classes químicas. Os compostos estudados são provenientes de síntese orgânica e de complexos inorgânicos de Rutênio, bem como de origem natural. Paralelamente, a realização do ensaio virtual em larga escala a partir de uma base de dados dirigida e da estrutura da GAPDH de T. cruzi resultou na identificação de um inibidor inédito da proteína alvo. Estudos do mecanismo de ação enzimático levaram à elucidação da modalidade de alguns inibidores identificados nesse estudo. / Parasitic diseases are a major global cause of illness, long-term disability, and death, with severe socio-economic consequences for millions of people worldwide. In Latin America, nearly one fourth of the population is infected by Trypanosoma cruzi, the causative agent of Chagas disease. The limited existing drug therapies suffer from a combination of drawbacks including poor efficacy, resistance and serious side effects. Therefore, there is an urgent need for new drugs that can overcome resistance and are safe and effective for use in human. The crucial dependence on glycolysis as a source of energy makes the glycolytic parasite enzymes promising targets for drug design. In this context, the enzyme glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) was identified as an attractive target for drug design. The development of standard enzymatic assays combined with extensive biological screening was the aim of this work and it has been contributing for the identification of novel GAPDH inhibitors. These compounds belong to several chemical classes from different sources, including organic synthesis, inorganic complexes and natural products. In addition, a virtual screening approach was applied in a focused database, previously filtered by drug-like properties, in order to identify new hits. This strategy resulted in the discovery of a novel scaffold with significant inhibitory activity against T. cruzi GAPDH. Kinetic and inhibition assays were conducted to shed light on the mechanism of action of the promising inhibitors.

As doenças negligenciadas são conseqüências marcantes do subdesenvolvimento que atinge diversas regiões do planeta. Dentre estas, destaca-se a Doença de Chagas, causada pelo parasita Trypanosoma cruzi, a qual afeta aproximadamente um quarto da população da América Latina e para qual os fármacos utilizados apresentam baixa eficácia, toxidez e sérios efeitos colaterais. Este quadro é agravado pela emergência de cepas resistentes, o que indica a grande necessidade de desenvolvimento de novos agentes quimioterápicos contra esta doença. A enzima gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) da via glicolítica do T. cruzi é um alvo macromolecular interessante devido ao seu papel essencial no metabolismo de tripanossomatídeos. Constitui o objetivo desta tese o desenvolvimento, a padronização e a validação de ensaios enzimáticos para a realização de extensivas triagens bioquímicas de modo a contribuir para a identificação de novos inibidores da GAPDH pertencentes a diversas classes químicas. Os compostos estudados são provenientes de síntese orgânica e de complexos inorgânicos de Rutênio, bem como de origem natural. Paralelamente, a realização do ensaio virtual em larga escala a partir de uma base de dados dirigida e da estrutura da GAPDH de T. cruzi resultou na identificação de um inibidor inédito da proteína alvo. Estudos do mecanismo de ação enzimático levaram à elucidação da modalidade de alguns inibidores identificados nesse estudo. / Parasitic diseases are a major global cause of illness, long-term disability, and death, with severe socio-economic consequences for millions of people worldwide. In Latin America, nearly one fourth of the population is infected by Trypanosoma cruzi, the causative agent of Chagas disease. The limited existing drug therapies suffer from a combination of drawbacks including poor efficacy, resistance and serious side effects. Therefore, there is an urgent need for new drugs that can overcome resistance and are safe and effective for use in human. The crucial dependence on glycolysis as a source of energy makes the glycolytic parasite enzymes promising targets for drug design. In this context, the enzyme glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) was identified as an attractive target for drug design. The development of standard enzymatic assays combined with extensive biological screening was the aim of this work and it has been contributing for the identification of novel GAPDH inhibitors. These compounds belong to several chemical classes from different sources, including organic synthesis, inorganic complexes and natural products. In addition, a virtual screening approach was applied in a focused database, previously filtered by drug-like properties, in order to identify new hits. This strategy resulted in the discovery of a novel scaffold with significant inhibitory activity against T. cruzi GAPDH. Kinetic and inhibition assays were conducted to shed light on the mechanism of action of the promising inhibitors.

Submitted by Ricardo Cedraz Duque Moliterno (ricardo.moliterno@uefs.br) on 2017-08-08T21:31:24Z No. of bitstreams: 1 TESE_Odailson Paz - com ficha.pdf: 4071411 bytes, checksum: 033f0c18eb721e7010e1ddd7ec27e10c (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-08T21:31:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TESE_Odailson Paz - com ficha.pdf: 4071411 bytes, checksum: 033f0c18eb721e7010e1ddd7ec27e10c (MD5) Previous issue date: 2017-05-25 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior - CAPES / Adenosine receptors are considered as potential targets for the development of drugs against different pathologies because they are involved in several physiological pathways. Due to the role of adenosine receptors of subtype 2B (RA2B) in the process of sickling cell, antagonists capable of blocking RA2B may be lead compounds for the development of new therapeutic alternatives to treatment of patients with sickle cell anemia. Then, the objective of this work was to identify anti-sickle cell agents capable of blocking RA2B activity. To achieve this goal, was built a pharmacophore model (model 04) capable of differentiating true ligands false-positive (area under the ROC curve = 0.94) and to classify RA2B antagonists, not used in the calibration of the model, regarding their Biological activities pKi = 7.5-9.3 (high potency), 5.5-7.4 (intermediate potency) and 5.4-4.0 (low potency). This pharmacophore model allowed the selection of 33 lead-like compounds from the ZINC database, between them12 compounds presented anti-sickle cell activity. In vitro cell assay with an agonist (NECA) and a RA2B antagonist (MRS1754), suggest that the anti-sickle cell activity is related to modulation of RA2B. Compounds Z1139491704 (pEC50= 7,77?0,17), Z168278894 (pEC50= 7,64?0,09) e Z847449186 (pEC50= 7,66?0,21) have anti-sickling activity Higher than MRS1754 (pEC50= 7,63?0,12) and do not present cytotoxic activity at micromolar range. In sum, it can be concluded that the in silico strategy used succeeded in identifying compounds with probable action antagonists of RA2B that can be considered as prototypes for the development of drugs useful in the treatment of patients with sickle cell anemia. / Os receptores de adenosina s?o considerados como alvos potenciais para o desenvolvimento de f?rmacos contra diferentes patologias por estarem envolvidos em diversas vias fisiol?gicas. Devido ao papel dos receptores de adenosina do subtipo 2B (RA2B) no processo de falciza??o de hem?cias, antagonistas capazes de bloquear RA2B podem ser compostos prot?tipos para o desenvolvimento de novas alternativas terap?uticas para o tratamento de pacientes com anemia falciforme.Diante desse cen?rio, o objetivo desse trabalho foi identificar agentes antifalcizantes capazes de antagonizar a atividade do RA2B. Para alcan?ar esse objetivo foi constru?do um modelo farmacof?rico (modelo 04 - 3 caracter?sticas aceptor e 1 doador de liga??o de hidrog?nio e 3 centros hidrof?bicos) que ? capaz de diferenciar ligantes verdadeiros de falso-positivos (?rea sob a curva ROC= 0,94)e classificar antagonistas de RA2B,n?o utilizados na calibra??o do modelo, quanto as suas atividades biol?gicas(pKi= 7,5-9,3 (alta pot?ncia), 5,5-7,4 (pot?ncia intermedi?ria) e 5,4-4,0 (baixa pot?ncia)). Esse modelo farmacof?rico permitiu a sele??o de 33 compostos lead like do banco de dados ZINC database para avalia??o biol?gica, dos quais 12 apresentaram atividade antifalcizante.Testes in vitro com um agonista (NECA) e um antagonista de RA2B (MRS1754), sugerem que a atividade antifalcizante est? relacionada a modula??o de RA2B.Os compostosZ1139491704(pEC50= 7,77?0,17),Z168278894 (pEC50= 7,64?0,09) e Z847449186 (pEC50= 7,66?0,21)possuem atividade antifalcizante superior ao MRS1754 (pEC50=7,63?0,12)e n?o apresentam atividade citot?xica em concentra??es micromolares. Dessa forma, pode-se concluir que a estrat?gia in silico utilizada logrou sucesso em identificar compostos com prov?vel a??o antagonistas de RA2B que podem ser considerados como prot?tipos para o desenvolvimento de f?rmacos ?teis no tratamento de pacientes com anemia falciforme.

Os receptores dos hormônios da tireóide (TRs) são fatores de transcrição envolvidos na diferenciação celular, metabolismo e funções fisiológicas da maioria dos tecidos. Muitos estudos mostram que diversos efeitos farmacológicos mediados pelos TRs podem ser benéficos na farmacoterapia, especialmente aqueles mediados pelo TR que podem ser úteis em condições médicas importantes como obesidade, hipercolesterolemia e diabetes. Além disso, a descoberta que o TR é a isoforma predominante no coração, mediando a maioria dos efeitos cardiovasculares prejudiciais, estimulou a pesquisa por ligantes seletivos para o TR que poderiam ser utilizados em quadros clínicos importantes com perfil de segurança aceitável. Foi realizado um estudo das relações quantitativas entre a estrutura e atividade (QSAR) de um conjunto de compostos com atividade biológica descrita para TR e TR, que gerou modelos de Holograma QSAR com elevada consistência interna e externa, apresentando bom poder de correlação e predição das propriedades biológicas. Também foi realizado um minucioso estudo de triagem virtual, que propiciou a seleção de 7 compostos que foram adquiridos para terem suas atividades biológicas avaliadas. Ensaios de transfecção e gene repórter foram estabelecidos e utilizados na avaliação da atividade biológica dos compostos selecionados pelo ensaio virtual. Finalmente, um ensaio utilizando ressonância plasmônica de superfície (SPR) foi desenvolvido e utilizado para avaliar a atividade agonista desses compostos, e que pode ser útil para avaliar a atividade de novos ligantes. A técnica de SPR também foi empregada em um cuidadoso estudo da interação do TR com seus correguladores, que incluiu estudos cinéticos e termodinâmicos, propiciando a determinação das taxas cinéticas e parâmetros termodinâmicos para a interação do complexo TR-T3 com peptídeos derivados de dois de seus correguladores. Os resultados obtidos são relevantes e devem ser considerados no planejamento de futuros experimentos utilizando o LBD de TR e agonistas. / The thyroid hormone receptors (TRs) are transcriptional factors involved in cell differentiation, development, metabolism and physiological function of most tissues. Many lines of evidence show that several pharmacological actions of TRs might be beneficial in medical therapy, specially those mediated by TR that target important medical conditions like obesity, hypercholesterolemia and diabetes. Additionally, the findings that TR is the predominant isoform in the heart and mediates most of the TRs deleterious cardiovascular effects, stimulated the research for selective TR ligands which could address important medical needs with an acceptable safety profile. In this PhD thesis, studies of the quantitative structure-activity relationships (QSAR) of a dataset of compounds with reported biologic activity for both TR and TR were performed, and statistically significant Hologram QSAR models with good predictive ability for untested compounds were created. In parallel, a careful virtual screening procedure was executed, leading to the selection of 7 compounds which were purchased for the evaluation of their biological activities. Cell transfection and reporter gene assays were developed, validated and used to evaluate the biological activities of these compounds. Finally, a surface plasmon resonance (SPR) assay was developed and used to assess the agonistic activity of these compounds. The SPR technique was also employed in a careful study of the interaction between the ligand binding domain of TR and peptides derived from its coregulators, which included the determination of the kinetic and thermodynamic parameters for this interaction. The results suggest that flexibility plays an important role in the interaction between the receptor and its coregulators, and point out important aspects of experimental design that should be addressed when using TR LBD and its agonists. Furthermore, the methodology described here may be useful for the identification of new TR ligands.

Os receptores dos hormônios da tireóide (TRs) são fatores de transcrição envolvidos na diferenciação celular, metabolismo e funções fisiológicas da maioria dos tecidos. Muitos estudos mostram que diversos efeitos farmacológicos mediados pelos TRs podem ser benéficos na farmacoterapia, especialmente aqueles mediados pelo TR que podem ser úteis em condições médicas importantes como obesidade, hipercolesterolemia e diabetes. Além disso, a descoberta que o TR é a isoforma predominante no coração, mediando a maioria dos efeitos cardiovasculares prejudiciais, estimulou a pesquisa por ligantes seletivos para o TR que poderiam ser utilizados em quadros clínicos importantes com perfil de segurança aceitável. Foi realizado um estudo das relações quantitativas entre a estrutura e atividade (QSAR) de um conjunto de compostos com atividade biológica descrita para TR e TR, que gerou modelos de Holograma QSAR com elevada consistência interna e externa, apresentando bom poder de correlação e predição das propriedades biológicas. Também foi realizado um minucioso estudo de triagem virtual, que propiciou a seleção de 7 compostos que foram adquiridos para terem suas atividades biológicas avaliadas. Ensaios de transfecção e gene repórter foram estabelecidos e utilizados na avaliação da atividade biológica dos compostos selecionados pelo ensaio virtual. Finalmente, um ensaio utilizando ressonância plasmônica de superfície (SPR) foi desenvolvido e utilizado para avaliar a atividade agonista desses compostos, e que pode ser útil para avaliar a atividade de novos ligantes. A técnica de SPR também foi empregada em um cuidadoso estudo da interação do TR com seus correguladores, que incluiu estudos cinéticos e termodinâmicos, propiciando a determinação das taxas cinéticas e parâmetros termodinâmicos para a interação do complexo TR-T3 com peptídeos derivados de dois de seus correguladores. Os resultados obtidos são relevantes e devem ser considerados no planejamento de futuros experimentos utilizando o LBD de TR e agonistas. / The thyroid hormone receptors (TRs) are transcriptional factors involved in cell differentiation, development, metabolism and physiological function of most tissues. Many lines of evidence show that several pharmacological actions of TRs might be beneficial in medical therapy, specially those mediated by TR that target important medical conditions like obesity, hypercholesterolemia and diabetes. Additionally, the findings that TR is the predominant isoform in the heart and mediates most of the TRs deleterious cardiovascular effects, stimulated the research for selective TR ligands which could address important medical needs with an acceptable safety profile. In this PhD thesis, studies of the quantitative structure-activity relationships (QSAR) of a dataset of compounds with reported biologic activity for both TR and TR were performed, and statistically significant Hologram QSAR models with good predictive ability for untested compounds were created. In parallel, a careful virtual screening procedure was executed, leading to the selection of 7 compounds which were purchased for the evaluation of their biological activities. Cell transfection and reporter gene assays were developed, validated and used to evaluate the biological activities of these compounds. Finally, a surface plasmon resonance (SPR) assay was developed and used to assess the agonistic activity of these compounds. The SPR technique was also employed in a careful study of the interaction between the ligand binding domain of TR and peptides derived from its coregulators, which included the determination of the kinetic and thermodynamic parameters for this interaction. The results suggest that flexibility plays an important role in the interaction between the receptor and its coregulators, and point out important aspects of experimental design that should be addressed when using TR LBD and its agonists. Furthermore, the methodology described here may be useful for the identification of new TR ligands.

A doença de Chagas, causada pelo protozoário flagelado Trypanosoma cruzi, é uma doença tropical que enseja morte/morbidade de milhões de pessoas na América Latina. Por processos migratórios, vem-se estendendo ao sul dos Estados Unidos, Canadá, Europa, Austrália e Japão. Essa doença tem sido considerada super-negligenciada pela indústria farmacêutica, já que os dois fármacos disponíveis para o seu tratamento foram introduzidos há mais de quarenta anos e apresentam baixa eficácia com vários efeitos colaterais severos. Mais recentemente, a Organização Mundial da Saúde considerou a doença de Chagas, dentre outras, como a doença da pobreza! Com esse cenário completamente desfavorável aos portadores da doença, é necessária a descoberta, desenvolvimento e introdução de novos fármacos para o tratamento eficiente e seguro da doença de Chagas. <br />Dentro desse contexto, este trabalho representa uma importante contribuição para o entendimento das razões moleculares da ação farmacológica de substâncias químicas bioativas de interesse à farmacoterapia da doença de Chagas. Ao nível molecular, a enzima pertencente à via de síntese de novo de nucleotídeos de pirimidinas, diidroorotato desidrogenase do Trypanosoma cruzi (TcDHODH), é um alvo promissor para a descoberta e desenvolvimento de candidatos a fármacos de interesse para o tratamento da doença de Chagas. <br />Os conceitos e ferramentas da química medicinal computacional, tais como os ensaios virtuais in silico, foram usados para a identificação de inibidores da TcDHODH. Vinte e seis substâncias inéditas como inibidores da TcDHODH foram adquiridos comercialmente e avaliados experimentalmente através da Calorimetria de Titulação Isotérmica (ITC) para a determinação do mecanismo de inibição e da constante cinética de afinidade (Kiapp). <br />Na etapa de docagem molecular, o objetivo era identificar moléculas que apresentassem uma boa afinidade pelo sítio ativo da enzima TcDHODH. A primeira série de ligantes selecionados dos métodos in silico, apresentou inibição enzimática na concentração de micromolar com eficiência média de ligante de 0,50 kcal mol-1 átomo-1. Devido à baixa massa molecular (aproximadamente 200 kDa) e a alta eficiência de ligante, essa série foi considerada como constituída de excelentes substâncias com elevado poder de reconhecimento biomolecular. Por isso, foram caracterizadas como substâncias passíveis de otimização no processo do-ligante-para-substância matriz. <br />As enzimas TcDHODH e DHODH de Leishmania major (LmDHODH) têm sítios ativos com elevado grau de similaridade. Portanto, usando a enzima LmDHODH como padrão de substituição da TcDHODH é possível fazer a descrição do modo de interação do co-complexo TcDHODH-inibidor. O modo de ação descrito através da resolução da estrutura cristalográfica de raios-X, além de validar ortogonalmente os resultados cinéticos obtidos por ITC - que identificou as substâncias como inibidores competitivos (por interação direta no sítio ativo da enzima TcDHODH), geraram hipóteses farmacofóricas para a busca de novas moléculas (chamadas de segunda geração), agora com padrão superior de reconhecimento molecular do sítio da TcDHODH. Para validar complementarmente a hipótese, foi demonstrado que os inibidores da TcDHODH inibem, similarmente, a LmDHODH. <br />Uma análise cuidadosa da estrutura tridimensional da enzima TcDHODH, demostrou a possibilidade de ocupação do sítio S2 que se estende além da região do sítio catalítico S1, permitindo assim o aumento da afinidade biomolecular com os inibidores. Além disso, o sítio S2 não é encontrado na estrutura da proteína de humanos (HsDHODH), podendo ser uma região passível de seletividade frente à enzima TcDHODH. <br />O emprego adequado dessa hipótese resultou na otimização dos ligantes identificados previamente para substâncias mais potentes que inibiram a enzima de forma competitiva em relação ao substrato diidroorotato (DHO) em valores Kiapp de 121 &plusmn; 14 nM e 190 &plusmn; 10 nM. <br />A técnica de ITC foi fundamental no processo de descoberta de inibidores enzimáticos, pois se mostrou extremamente susceptível à determinação da interação intermolecular enzima-inibidor, permitindo acompanhar a cinética da reação e obter os valores da constante de afinidade de maneira precisa e acurada. Com isso, a taxa de acerto obtida nesta tese foi de 46%, considerando-se apenas as substâncias com valores de Ki app < 100 &micro;M. Esse é um número favoravelmente apreciável, já que na literatura ele gira em torno de 1-10% quando o planejamento in silico é realizado, quando comparado às taxas de acerto dos métodos de ensaio em larga escala (HTS), entre 0-2 %, os resultados alcançados neste trabalho são ainda mais significativos. <br />Além disso, as substâncias químicas selecionadas através da integração de métodos in silico e biocalorimétricos apresentam elevado grau de complexidade no processo biomolecular de interação enzima-ligante, que permite classificá-las para as fases seguintes da gênese planejada de fármacos. / American trypanosomiasis or Chagas disease, caused by the haemoflagellate Trypanosoma cruzi, is a tropical disease that affects millions of people in Latin America. Epidemiology of Chagas disease in non-endemic countries is attained by immigration as the disease also affects people in the United States, Canada, Europe, Australia and Japan. However, the United States are not to be written off as an area of nonendemicity for Chagas disease like Europe or Asia because the southern states have enzootic T. cruzi transmission that involves triatomine species and hosts such as raccoons, opossums, and domestic dogs. Even though, this disease has been considered as a super-neglected from the big Pharma Industry viewpoint since the only available drugs for its treatment were introduced in the market more than forty years ago and worsen is that they have low efficacy and cause various severe side effects. <br />Although the current clinical scenario is of course discouraging and is far from being even a soothing treatment for those who suffer from the disease, it prompt ones to set efforts towards the need of discovering and developing new efficacious and safe drugs to treat Chagas disease. <br />Our research group covers the concept of enzymes acting as targets for the action of drugs. Once T. cruzi has many druggable targets, the dihydroorotate dehydrogenase enzyme (TcDHODH) that belongs to the de novo pyrimidine nucleotide synthetic pathway has been chosen for the search of new inhibitors that may be of use in the treatment of Chagas disease. To accomplish with this and considering that inhibitors are molecules that decrease enzyme activity leading to parasite death, we used the concepts and tools of modern computational medicinal chemistry such as in silico screening of small molecules that bind to the active site of the TcDHODH. <br />After a thoroughly program of virtually screening thousands of compounds, 26 were purchased from commercially available sources and experimentally assayed against the TcDHODH using Isothermal Titration Calorimetry (ITC) in order to determine the mechanism of inhibition and the kinetic affinity constant (Kiapp). <br />The first series of inhibitors selected from our in silico strategy were evaluated by ITC to yield compounds that inhibited the TcDHODH in the micromolar concentration range with an average of 0.50 kcal mol-1 atom-1 ligand efficiency (LE). Because the assayed compounds have low molecular weight (ca. 200 kDa) and high LE, which bring them to the specific bimolecular pattern recognition all of them were considered good inhibitors capable of being selected to enter the hit-to-lead optimization process. <br />The detailed description of the ligand-enzyme mode of binding (MOB) is thoroughly accomplished by solving the X ray crystal structure of the surrogate Leishmania major DHODH enzyme (LmDHODH), which has a high degree of similarity with the enzyme TcDHODH. The MOB credited to be in the active site of the TcDHODH orthogonally validated the ITC kinetic experimental data obtained for all ligands as competitive inhibitors that interact at the active site of the TcDHODH and helped to generate pharmacophoric hypotheses for the search of new second generation molecules acting against the enzyme TcDHODH.  Analyzing the 3D structure of the TcDHODH along with its surrogate LmDHODH, we envisaged the possibility of compounds to extend their side chain beyond the region of the catalytic site (called S1), and interacting in a region called S2, so to increase binding affinity. Moreover, the TcDHODH S2 site that is not found in the 3D protein structure of humans (HsDHODH) is likely to offer new insights for the search of inhibitors whose binding to this S2 site can pave the roads towards the needed structural basis for selective inhibition of TcDHODH. <br />The most potent compounds inhibited the enzyme competitively with respect to the substrate dihydroorotate (DHO) at Kiapp values of 121 &plusmn; 14 nM and 190 &plusmn; 10 nM, which constitutes high affinity TcDHODH inhibitors. The ITC technique was pivotal to this process of enzyme inhibitors discovery, because it proved to be extremely sensitive thus allowing to monitor the kinetics of the reaction and to obtain precise and accurate values of affinity constants. <br />The hit rate obtained in this work, considering only those compounds with Kiapp < 100 &micro;M, was 46%. This is a really high number, since literature values range from 1 to 10% when the planning new inhibitors via in silico methods when compared to the success rates obtained by the methods of testing on large scales (HTS), 0-2 %, the results achieved in this work are even more significant. Moreover, the compounds selected through the integration of in silico and calorimetric methods showed a high degree of complexity in the process of bimolecular enzyme-ligand recognition, which allows to pass them to the next phase of the drug design process.

A doença de Chagas, causada pelo protozoário flagelado Trypanosoma cruzi, é uma doença tropical que enseja morte/morbidade de milhões de pessoas na América Latina. Por processos migratórios, vem-se estendendo ao sul dos Estados Unidos, Canadá, Europa, Austrália e Japão. Essa doença tem sido considerada super-negligenciada pela indústria farmacêutica, já que os dois fármacos disponíveis para o seu tratamento foram introduzidos há mais de quarenta anos e apresentam baixa eficácia com vários efeitos colaterais severos. Mais recentemente, a Organização Mundial da Saúde considerou a doença de Chagas, dentre outras, como a doença da pobreza! Com esse cenário completamente desfavorável aos portadores da doença, é necessária a descoberta, desenvolvimento e introdução de novos fármacos para o tratamento eficiente e seguro da doença de Chagas. <br />Dentro desse contexto, este trabalho representa uma importante contribuição para o entendimento das razões moleculares da ação farmacológica de substâncias químicas bioativas de interesse à farmacoterapia da doença de Chagas. Ao nível molecular, a enzima pertencente à via de síntese de novo de nucleotídeos de pirimidinas, diidroorotato desidrogenase do Trypanosoma cruzi (TcDHODH), é um alvo promissor para a descoberta e desenvolvimento de candidatos a fármacos de interesse para o tratamento da doença de Chagas. <br />Os conceitos e ferramentas da química medicinal computacional, tais como os ensaios virtuais in silico, foram usados para a identificação de inibidores da TcDHODH. Vinte e seis substâncias inéditas como inibidores da TcDHODH foram adquiridos comercialmente e avaliados experimentalmente através da Calorimetria de Titulação Isotérmica (ITC) para a determinação do mecanismo de inibição e da constante cinética de afinidade (Kiapp). <br />Na etapa de docagem molecular, o objetivo era identificar moléculas que apresentassem uma boa afinidade pelo sítio ativo da enzima TcDHODH. A primeira série de ligantes selecionados dos métodos in silico, apresentou inibição enzimática na concentração de micromolar com eficiência média de ligante de 0,50 kcal mol-1 átomo-1. Devido à baixa massa molecular (aproximadamente 200 kDa) e a alta eficiência de ligante, essa série foi considerada como constituída de excelentes substâncias com elevado poder de reconhecimento biomolecular. Por isso, foram caracterizadas como substâncias passíveis de otimização no processo do-ligante-para-substância matriz. <br />As enzimas TcDHODH e DHODH de Leishmania major (LmDHODH) têm sítios ativos com elevado grau de similaridade. Portanto, usando a enzima LmDHODH como padrão de substituição da TcDHODH é possível fazer a descrição do modo de interação do co-complexo TcDHODH-inibidor. O modo de ação descrito através da resolução da estrutura cristalográfica de raios-X, além de validar ortogonalmente os resultados cinéticos obtidos por ITC - que identificou as substâncias como inibidores competitivos (por interação direta no sítio ativo da enzima TcDHODH), geraram hipóteses farmacofóricas para a busca de novas moléculas (chamadas de segunda geração), agora com padrão superior de reconhecimento molecular do sítio da TcDHODH. Para validar complementarmente a hipótese, foi demonstrado que os inibidores da TcDHODH inibem, similarmente, a LmDHODH. <br />Uma análise cuidadosa da estrutura tridimensional da enzima TcDHODH, demostrou a possibilidade de ocupação do sítio S2 que se estende além da região do sítio catalítico S1, permitindo assim o aumento da afinidade biomolecular com os inibidores. Além disso, o sítio S2 não é encontrado na estrutura da proteína de humanos (HsDHODH), podendo ser uma região passível de seletividade frente à enzima TcDHODH. <br />O emprego adequado dessa hipótese resultou na otimização dos ligantes identificados previamente para substâncias mais potentes que inibiram a enzima de forma competitiva em relação ao substrato diidroorotato (DHO) em valores Kiapp de 121 &plusmn; 14 nM e 190 &plusmn; 10 nM. <br />A técnica de ITC foi fundamental no processo de descoberta de inibidores enzimáticos, pois se mostrou extremamente susceptível à determinação da interação intermolecular enzima-inibidor, permitindo acompanhar a cinética da reação e obter os valores da constante de afinidade de maneira precisa e acurada. Com isso, a taxa de acerto obtida nesta tese foi de 46%, considerando-se apenas as substâncias com valores de Ki app < 100 &micro;M. Esse é um número favoravelmente apreciável, já que na literatura ele gira em torno de 1-10% quando o planejamento in silico é realizado, quando comparado às taxas de acerto dos métodos de ensaio em larga escala (HTS), entre 0-2 %, os resultados alcançados neste trabalho são ainda mais significativos. <br />Além disso, as substâncias químicas selecionadas através da integração de métodos in silico e biocalorimétricos apresentam elevado grau de complexidade no processo biomolecular de interação enzima-ligante, que permite classificá-las para as fases seguintes da gênese planejada de fármacos. / American trypanosomiasis or Chagas disease, caused by the haemoflagellate Trypanosoma cruzi, is a tropical disease that affects millions of people in Latin America. Epidemiology of Chagas disease in non-endemic countries is attained by immigration as the disease also affects people in the United States, Canada, Europe, Australia and Japan. However, the United States are not to be written off as an area of nonendemicity for Chagas disease like Europe or Asia because the southern states have enzootic T. cruzi transmission that involves triatomine species and hosts such as raccoons, opossums, and domestic dogs. Even though, this disease has been considered as a super-neglected from the big Pharma Industry viewpoint since the only available drugs for its treatment were introduced in the market more than forty years ago and worsen is that they have low efficacy and cause various severe side effects. <br />Although the current clinical scenario is of course discouraging and is far from being even a soothing treatment for those who suffer from the disease, it prompt ones to set efforts towards the need of discovering and developing new efficacious and safe drugs to treat Chagas disease. <br />Our research group covers the concept of enzymes acting as targets for the action of drugs. Once T. cruzi has many druggable targets, the dihydroorotate dehydrogenase enzyme (TcDHODH) that belongs to the de novo pyrimidine nucleotide synthetic pathway has been chosen for the search of new inhibitors that may be of use in the treatment of Chagas disease. To accomplish with this and considering that inhibitors are molecules that decrease enzyme activity leading to parasite death, we used the concepts and tools of modern computational medicinal chemistry such as in silico screening of small molecules that bind to the active site of the TcDHODH. <br />After a thoroughly program of virtually screening thousands of compounds, 26 were purchased from commercially available sources and experimentally assayed against the TcDHODH using Isothermal Titration Calorimetry (ITC) in order to determine the mechanism of inhibition and the kinetic affinity constant (Kiapp). <br />The first series of inhibitors selected from our in silico strategy were evaluated by ITC to yield compounds that inhibited the TcDHODH in the micromolar concentration range with an average of 0.50 kcal mol-1 atom-1 ligand efficiency (LE). Because the assayed compounds have low molecular weight (ca. 200 kDa) and high LE, which bring them to the specific bimolecular pattern recognition all of them were considered good inhibitors capable of being selected to enter the hit-to-lead optimization process. <br />The detailed description of the ligand-enzyme mode of binding (MOB) is thoroughly accomplished by solving the X ray crystal structure of the surrogate Leishmania major DHODH enzyme (LmDHODH), which has a high degree of similarity with the enzyme TcDHODH. The MOB credited to be in the active site of the TcDHODH orthogonally validated the ITC kinetic experimental data obtained for all ligands as competitive inhibitors that interact at the active site of the TcDHODH and helped to generate pharmacophoric hypotheses for the search of new second generation molecules acting against the enzyme TcDHODH.  Analyzing the 3D structure of the TcDHODH along with its surrogate LmDHODH, we envisaged the possibility of compounds to extend their side chain beyond the region of the catalytic site (called S1), and interacting in a region called S2, so to increase binding affinity. Moreover, the TcDHODH S2 site that is not found in the 3D protein structure of humans (HsDHODH) is likely to offer new insights for the search of inhibitors whose binding to this S2 site can pave the roads towards the needed structural basis for selective inhibition of TcDHODH. <br />The most potent compounds inhibited the enzyme competitively with respect to the substrate dihydroorotate (DHO) at Kiapp values of 121 &plusmn; 14 nM and 190 &plusmn; 10 nM, which constitutes high affinity TcDHODH inhibitors. The ITC technique was pivotal to this process of enzyme inhibitors discovery, because it proved to be extremely sensitive thus allowing to monitor the kinetics of the reaction and to obtain precise and accurate values of affinity constants. <br />The hit rate obtained in this work, considering only those compounds with Kiapp < 100 &micro;M, was 46%. This is a really high number, since literature values range from 1 to 10% when the planning new inhibitors via in silico methods when compared to the success rates obtained by the methods of testing on large scales (HTS), 0-2 %, the results achieved in this work are even more significant. Moreover, the compounds selected through the integration of in silico and calorimetric methods showed a high degree of complexity in the process of bimolecular enzyme-ligand recognition, which allows to pass them to the next phase of the drug design process.