FGF2 (Fibroblast Growth Factor 2), o fundador da família FGF, tem funções regulatórias na mitogênese, diferenciação, morfogênese e reparo tecidual. Diversas espécies moleculares de FGF2 compartilham uma seqüência C-terminal comum de 155 aminoácidos, pois se originam de diferentes sítios de iniciação de leitura de um único mRNA. O menor, o FGF2-18kDa, é liberado extracelularmente para se ligar a receptores específicos (FGFRs) para disparar as funções parácrinas e autócrinas pelas quais este fator é conhecido. Por outro lado, as espécies maiores (FGF2-21, 22, 22,5 e 34kDa) são intracelulares se ligam a parceiros moleculares desconhecidos para exercer funções intrácrinas ainda indefinidas. O objetivo desta tese foi produzir espécies recombinantes do FGF2-18 e FGF2-22,5, na forma de proteínas de fusão, para analisar funções biológicas e mecanismos de sinalização. Nas células malignas Y1 de camundongo, os recombinantes de FGF2-18kDa (FGF2-18, His-FGF2-18 e His-FGF2-18-ProA) dispararam uma resposta antagônica estimulando as vias de sinalização mitogênica, mas bloqueando o ciclo celular. Nos fibroblastos não tumorigênicos Balb3T3, estes mesmos recombinantes de FGF2-18kDa dispararam apenas a resposta mitogênica clássica. Todos os efeitos biológicos destes recombinantes de FGF2-18kDa foram bloqueados pelo inibidor específico da proteína quinase de tirosina dos FGFRs, PD173074, demonstrando que são respostas intermediadas pelos FGFRs. Portanto, os domínios estruturais adicionados aos recombinantes de FGF2-18kDa não impediram que estas proteínas se ligassem e ativassem os FGFRs. Por outro lado, o recombinante His-FGF2-22,5 dispara apenas as vias de sinalização mitogênica em ambas as células Y1 e 3T3, mas este efeito biológico não é inibido por PD173074. Estes resultados sugerem que a seqüência N-terminal de 55 resíduos, rica em aminoácidos básicos, impede que o FGF2-22,5kDa se ligue e/ou ative os FGFRs. Entretanto, o recombinante His-FGF2-22,5ProA dispara a resposta antagônica característica do FGF2-18kDa. As implicações destes últimos resultados é que o domínio de ProA adicionado ao C-terminal torna o FGF2-22,5kDa um bom ligante dos FGFRs. A interação física entre ligante e receptor das formas recombinantes His-FGF2-18kDa (ou His-FGF2-18ProA) e FGF2-22,5kDa com os putativos FGFRs foi analisada através da técnica de SPR e os resultados mostram KDs aproximados (Kd18=21, 488.10-9 e Kd22,5=20,70393.10-9), enquanto que o número de sítios ligantes em vesículas microssomais das células é significantemente inferior para o FGF2-22,5kDa. Estes resultados são compatíveis com a existência de receptores diferentes para FGF2-18kDa e FGF2-22,5kDa, uma hipótese ainda a ser definitivamente corroborada. Em conclusão, o FGF2-18kDa, mesmo em formas recombinantes como proteína de fusão, dispara todos os efeitos biológicos descritos para FGF2, através dos FGFRs. Diferentemente, o FGF2-22,5kDa, como fator parácrino, só desencadeou a resposta mitogênica clássica de FGF2, provavelmente através de receptores diferentes dos FGFRs. Os resultados e conclusões desta tese têm um potencial indiscutivelmente relevante para a biologia molecular do câncer, com implicações possíveis em terapia oncológica / FGF2 (Fibroblast Growth Factor 2), the founder of the FGF family, has regulatory functions in mitogenesis, differentiation, morphogenesis and tissue repair. Multiple FGF2 molecular species, sharing a C-terminal sequence of 155 amino acids, are translated from different iniciation sites of the same mRNA. The smaller, the FGF2-18kD, is extracellularly released to bind to specific membrane receptors (FGFRs), performing paracrine and autocrine functions. On the other hand, the larger FGF2s (21, 22, 22.5 and 34kDa) are intracellular species that bind to unknown partners to play still undefined intracrine roles. The aim of this thesis was to produce recombinant species of FGF2-18kDa and FGF2-22,5kDa, in the form of fusion proteins, to analyze functions and signaling mechanisms. In mouse Y1 malignant cells, FGF2-18kD recombinants (FGF2-18kDa and His-FGF2-18kDaProA) triggered an antagonistic response activating mitogenic signaling pathways, but blocking the cell cycle. However, in non tumorigenic Balb3T3 fibroblasts, these same FGF2-18kD recombinants only elicited the classical mitogenic response. All biological effects of these FGF2-18kD recombinants were blocked by the specific inhibitor of FGFR-protein-tyrosine-kinases, PD173074, demonstrating that these responses are mediated by FGFRs. Therefore, the new peptide domains added to FGF2-18kD did not prevent these recombinant fusion proteins to bind and activate FGFRs. Conversely, the recombinant His-FGF2-22,5kDa triggered only mitogenic signaling pathways in both Y1 and Balb3T3 cells, a biological effect not inhibited by PD173074. These results suggested that the additional basic-rich N-terminal sequence of 55 amino acid residues, found in FGF2-22,5kDa, prevents this FGF2 species from binding and / or activate FGFRs. However, surprisingly, the recombinant His-FGF2-22kDaProA triggered the antagonistic response characteristic of FGF2-18kDa. These results imply that the ProA-domain added to the C-terminal end rendered the FGF2-22,5kDaProA a good ligand of FGFRs. The physical interaction between recombinants of both His-FGF2-18kD and His-FGF2-22kDa with putative FGFRs, analyzed by SPR, yielded close KD values (KD18=21, 5.10-9 e K D22,5=20,7.10-9), while the number of binding sites in cell microsomal vesicles were significantly lower for the His-FGF2-22,5kDa. These results are consistent with the existence of different receptors for FGF2 and FGF2-18kD-22,5kDa, a hypothesis that has yet to be definitively confirmed. In conclusion, FGF2-18kD, even as recombinant fusion proteins, triggered all biological effects of FGF2, through FGFRs. Conversely, the FGF2-22, 5kDa only triggered the classical mitogenic response, probably via receptors other than FGFRs. The results and conclusions of this thesis are potentially of great interest in cancer molecular biology, with implications in oncologic therapy.

FGFs compreendem um grande família de 24 proteínas, participando de processos chaves nos mais variados tecidos, tendo funções parácrina, autócrina e intrácrina, regulando mitogênese, diferenciação celular, morfogênese e cicatrização. Mas, a relação estrutura-função dos FGFs é pobremente entendida. O membro protótipo desta família é o FGF-2, que apresenta quatro isoformas moleculares incluindo a forma de 18 kDa que é secretada e se liga aos receptores específicos (FGFRs) e dispara uma complexa sinalização. As outras isoformas, de alto peso molecular (21, 22 e 22,5 kDa) são expressas por códons alternativos (CUG) e permanecem no interior da célula interagindo com parceiros moleculares desconhecidos. Para antecipar mecanismos e parceiros do FGF-2 HMW foi realizada modelagem molecular desta isoforma que mostrou: uma estrutura do N-terminal da proteína com motivo β→α&#8594β e manutenção do barril β. A busca por parceiros intracelulares, foi realizada através da técnica do duplo hibrido de levedura, usando um biblioteca de cDNA de cérebro de rato. Foram encontrados 4 possíveis parceiros: BRD2, UBE2I, BRPF1, PC4. Todas essas interações foram confirmadas através do crescimento da levedura em meio sem histidina, produção de β-galactosidase e ensaios de \"pull-down\" com GST. Analises por FACS confirmam que FGF2 não causa apoptose em células adrenais tumorais Y1 de camundongo, mas promovem um acumulo de células na fase S com bloqueio do ciclo celular e da proliferação, configurando uma forma de senescência. Resultados com as células humanas HEK-ER:Ras permitem fazer a seguinte generalização: FGF2 induz senescência em células malignas transformadas pelos oncogenes raso A superexpressão da proteína de fusão FGF-2(18kDa):protA, mas não a da FGF-2(22,5 kDa):protA, protege a célula Y1 da senescência induzida por FGF-2. Por outro lado, a superexpressão destas mesmas isoformas de FGF-2 fusionadas à proteína A em células imortalizadas Balb3T3 não causou transformação celular e nem alterou a resposta mitogênica destas células ao FGF-2 recombinante adicionado ao meio de cultura. Células Y1 quando tratadas com FGF-2 recombinante produz ROS intracelular e libera anions superóxido no meio extracelular. Além disso, o anti-oxidante NAC protege estas células da indução de senescência induzida por FGF-2, sugerindo que ROS pode ser intermediário no disparo de senescência por FGF-2. / FGFs comprise a large fami1y of 24 proteins that play key roles in a number of tissues as local paracrine, autocrine and intracrine regulators of mitogenesis, cellular differentiation, organ morphogenesis and tissue repair. Structure-function relationship among FGFs is still poorly understood. FGF-2, the fami1y prototype member, exists as four molecular species. The 18 kDa form is released to the extracellular milieu and binds to specific receptors (FGFR), initiating a complex array of signals. Other isoforms of higher molecular weights (21, 22 and 22,5 kDa) are translated from alternative codons (CUG) and remain inside of the cell interacting with unknown partners. Aiming to anticipate mechanisms and partners, we modeled the FGF2-HMW molecule, showing that the protein displays β→α&#8594β motif in the N-terminal region and maintains the β-barrel structure common to ali FGFs. By the yeast two-hybrid method, using a cDNA rat brain library, we found four possible partners for FGF2-HMW: BRD2, UBE2I, BRP1 and PC4. Ali partners were confirmed by yeast growth without histidine, production of β-galactosidase and \"pull-down\" assays with GST. FACS analyses confirmed that FGF2 does not cause apoptosis in mouse Y1 adrenal tumor cells. But, FGF2 inhibited S phase progression blocking cell cycle and proliferation, characterizing a form of senescence. In addition, results obtained with the human HEK-ER:Ras cells support the following general statement: FGF2 triggers senescence in malignant cells transformed by ras oncogenes. Ectopic expression of the fusion protein FGF-2(18 kDa):protA, but not of FGF-2(22,s kDa):protA, protected Y1 cells senescence induced by FGF-2. On the other hand, ectopic expression of FGF-2 isoforms fusioned to protA in Balb3T3 immortalized cells did not cause transformation and neither modified the mitogenic response of this cell to recombinant FGF2. Recombinant FGF-2 stimules Y1 cells to produce intracellular ROS and to release superoxide anions into intracellular medium. Moreover, the ROS scavenger NAC protect Y1 cells from senescence induced by FGF-2, suggesting that ROS may be mediate senescence triggering induced by FGF-2.

A troponina (Tn) regula a contração do músculo estriado esquelético de vertebrados. Ela é composta de três subunidades: troponina I (TnI), troponina C (TnC) e troponina T (TnT). A TnI tem a função inibitória que é neutralizada pela ligação de Ca2+ nos sítios regulatórios do N-domínio da TnC, e a TnT posiciona o complexo no filamento fino. Para monitorar o sinal do Ca2+ sendo transmitido da TnC para a TnI as propriedades espectrais únicas do 5-hidroxitriptofano (5HW) foram utilizadas. O 5HW foi incorporado em mutantes pontuais de TnI com um único códon para triptofano. Foram identificadas duas sondas espectrais intrínsecas na TnI capazes de detectar a ligação de Ca2+ na Tn: as TnIs com 5HW nas posições 100 e 121. Complexos troponina reconstituídos com estes mutantes fluorescentes de TnI, Tn-TnIF100HW e Tn-TnIM121HW, apresentaram respectivamente 12 e 70 % de aumento na intensidade do espectro de emissão devido à ligação de Ca2+ na TnC. Nos complexos binários (TnC-TnI) as TnIs com 5HW nas posições 106 e 121 também captam a ligação do Ca2+ na TnC. A análise da fluorescência destas sondas demonstrou que: 1) as regiões da TnI que respondem ao N-domínio regulatório da TnC ocupado com Ca2+ são a região inibitória da TnI, resíduos 96 até 116, e a região vizinha que inclui a posição 121 da TnI; 2) mutações pontuais e a incorporação de 5HW na TnI podem afetar tanto a afinidade como a cooperatividade da ligação de Ca2+ na TnC, confirmando o papel da TnI em modular a afinidade da TnC por Ca2+; 3) as constantes de dissociação de Ca2+ surpreendentemente altas, Kd ~ 10-8 M, calculadas a partir dos sinais das sondas na região inibitória da TnI, sugerem a possibilidade de que os sítios do domínio N-terminal da TnC sejam os sítios de ligação de Ca2+ de maior afinidade no complexo troponina. / Vertebrate striated muscle contraction is regulated by troponin (Tn). Tn is composed of three subunits: troponin I (TnI), troponin C (TnC) and troponin T (TnT). TnI has an inhibitory role that is neutralized by calcium binding to the regulatory sites in the N-domain of TnC, and TnT positions the troponin complex on the thin filament. In order to follow the Ca2+ induced conformational change that is transmitted from TnC to TnI, the unique spectral properties of 5-hydroxytryptophan (5HW) incorporated as point-mutants of TnI were used. It was possible to identify two new TnI intrinsic spectral probes sensitive to Ca2+ binding to Tn: TnI with single 5HW at positions 100 and 121. Trimeric troponin complexes reconstituted with two fluorescent mutants of TnI, Tn-TnIF100HW and Tn-TnIM121HW, showed respectively 12 and 70 % increase in the emission spectra when Ca2+ bound to TnC. In the binary complexes (TnC-TnI) two TnIs with 5HW at positions 106 and 121 were also sensitive to Ca2+ binding to TnC. Fluorescence analysis of these probes showed: 1) the regions in TnI that respond to Ca2+ binding to the regulatory N-domain of TnC are the inhibitory region of TnI (residues 96 to 116), and a neighbor region that includes position 121; 2) point mutations and incorporation of 5HW in TnI can affect both the affinity and the cooperativity of Ca2+ binding to TnC, confirming the role of TnI as a modulator of the Ca2+ affinity of TnC; 3) the high dissociation constant for sites in the N-terminal domain of TnC (Kd ~ 10-8 M), derived from data using probes in the inhibitory region of TnI suggested the possibility that these sites are the high affinity Ca2+ binding sites in the troponin complex.

FGF2 (Fibroblast Growth Factor 2), o fundador da família FGF, tem funções regulatórias na mitogênese, diferenciação, morfogênese e reparo tecidual. Diversas espécies moleculares de FGF2 compartilham uma seqüência C-terminal comum de 155 aminoácidos, pois se originam de diferentes sítios de iniciação de leitura de um único mRNA. O menor, o FGF2-18kDa, é liberado extracelularmente para se ligar a receptores específicos (FGFRs) para disparar as funções parácrinas e autócrinas pelas quais este fator é conhecido. Por outro lado, as espécies maiores (FGF2-21, 22, 22,5 e 34kDa) são intracelulares se ligam a parceiros moleculares desconhecidos para exercer funções intrácrinas ainda indefinidas. O objetivo desta tese foi produzir espécies recombinantes do FGF2-18 e FGF2-22,5, na forma de proteínas de fusão, para analisar funções biológicas e mecanismos de sinalização. Nas células malignas Y1 de camundongo, os recombinantes de FGF2-18kDa (FGF2-18, His-FGF2-18 e His-FGF2-18-ProA) dispararam uma resposta antagônica estimulando as vias de sinalização mitogênica, mas bloqueando o ciclo celular. Nos fibroblastos não tumorigênicos Balb3T3, estes mesmos recombinantes de FGF2-18kDa dispararam apenas a resposta mitogênica clássica. Todos os efeitos biológicos destes recombinantes de FGF2-18kDa foram bloqueados pelo inibidor específico da proteína quinase de tirosina dos FGFRs, PD173074, demonstrando que são respostas intermediadas pelos FGFRs. Portanto, os domínios estruturais adicionados aos recombinantes de FGF2-18kDa não impediram que estas proteínas se ligassem e ativassem os FGFRs. Por outro lado, o recombinante His-FGF2-22,5 dispara apenas as vias de sinalização mitogênica em ambas as células Y1 e 3T3, mas este efeito biológico não é inibido por PD173074. Estes resultados sugerem que a seqüência N-terminal de 55 resíduos, rica em aminoácidos básicos, impede que o FGF2-22,5kDa se ligue e/ou ative os FGFRs. Entretanto, o recombinante His-FGF2-22,5ProA dispara a resposta antagônica característica do FGF2-18kDa. As implicações destes últimos resultados é que o domínio de ProA adicionado ao C-terminal torna o FGF2-22,5kDa um bom ligante dos FGFRs. A interação física entre ligante e receptor das formas recombinantes His-FGF2-18kDa (ou His-FGF2-18ProA) e FGF2-22,5kDa com os putativos FGFRs foi analisada através da técnica de SPR e os resultados mostram KDs aproximados (Kd18=21, 488.10-9 e Kd22,5=20,70393.10-9), enquanto que o número de sítios ligantes em vesículas microssomais das células é significantemente inferior para o FGF2-22,5kDa. Estes resultados são compatíveis com a existência de receptores diferentes para FGF2-18kDa e FGF2-22,5kDa, uma hipótese ainda a ser definitivamente corroborada. Em conclusão, o FGF2-18kDa, mesmo em formas recombinantes como proteína de fusão, dispara todos os efeitos biológicos descritos para FGF2, através dos FGFRs. Diferentemente, o FGF2-22,5kDa, como fator parácrino, só desencadeou a resposta mitogênica clássica de FGF2, provavelmente através de receptores diferentes dos FGFRs. Os resultados e conclusões desta tese têm um potencial indiscutivelmente relevante para a biologia molecular do câncer, com implicações possíveis em terapia oncológica / FGF2 (Fibroblast Growth Factor 2), the founder of the FGF family, has regulatory functions in mitogenesis, differentiation, morphogenesis and tissue repair. Multiple FGF2 molecular species, sharing a C-terminal sequence of 155 amino acids, are translated from different iniciation sites of the same mRNA. The smaller, the FGF2-18kD, is extracellularly released to bind to specific membrane receptors (FGFRs), performing paracrine and autocrine functions. On the other hand, the larger FGF2s (21, 22, 22.5 and 34kDa) are intracellular species that bind to unknown partners to play still undefined intracrine roles. The aim of this thesis was to produce recombinant species of FGF2-18kDa and FGF2-22,5kDa, in the form of fusion proteins, to analyze functions and signaling mechanisms. In mouse Y1 malignant cells, FGF2-18kD recombinants (FGF2-18kDa and His-FGF2-18kDaProA) triggered an antagonistic response activating mitogenic signaling pathways, but blocking the cell cycle. However, in non tumorigenic Balb3T3 fibroblasts, these same FGF2-18kD recombinants only elicited the classical mitogenic response. All biological effects of these FGF2-18kD recombinants were blocked by the specific inhibitor of FGFR-protein-tyrosine-kinases, PD173074, demonstrating that these responses are mediated by FGFRs. Therefore, the new peptide domains added to FGF2-18kD did not prevent these recombinant fusion proteins to bind and activate FGFRs. Conversely, the recombinant His-FGF2-22,5kDa triggered only mitogenic signaling pathways in both Y1 and Balb3T3 cells, a biological effect not inhibited by PD173074. These results suggested that the additional basic-rich N-terminal sequence of 55 amino acid residues, found in FGF2-22,5kDa, prevents this FGF2 species from binding and / or activate FGFRs. However, surprisingly, the recombinant His-FGF2-22kDaProA triggered the antagonistic response characteristic of FGF2-18kDa. These results imply that the ProA-domain added to the C-terminal end rendered the FGF2-22,5kDaProA a good ligand of FGFRs. The physical interaction between recombinants of both His-FGF2-18kD and His-FGF2-22kDa with putative FGFRs, analyzed by SPR, yielded close KD values (KD18=21, 5.10-9 e K D22,5=20,7.10-9), while the number of binding sites in cell microsomal vesicles were significantly lower for the His-FGF2-22,5kDa. These results are consistent with the existence of different receptors for FGF2 and FGF2-18kD-22,5kDa, a hypothesis that has yet to be definitively confirmed. In conclusion, FGF2-18kD, even as recombinant fusion proteins, triggered all biological effects of FGF2, through FGFRs. Conversely, the FGF2-22, 5kDa only triggered the classical mitogenic response, probably via receptors other than FGFRs. The results and conclusions of this thesis are potentially of great interest in cancer molecular biology, with implications in oncologic therapy.

FGFs compreendem um grande família de 24 proteínas, participando de processos chaves nos mais variados tecidos, tendo funções parácrina, autócrina e intrácrina, regulando mitogênese, diferenciação celular, morfogênese e cicatrização. Mas, a relação estrutura-função dos FGFs é pobremente entendida. O membro protótipo desta família é o FGF-2, que apresenta quatro isoformas moleculares incluindo a forma de 18 kDa que é secretada e se liga aos receptores específicos (FGFRs) e dispara uma complexa sinalização. As outras isoformas, de alto peso molecular (21, 22 e 22,5 kDa) são expressas por códons alternativos (CUG) e permanecem no interior da célula interagindo com parceiros moleculares desconhecidos. Para antecipar mecanismos e parceiros do FGF-2 HMW foi realizada modelagem molecular desta isoforma que mostrou: uma estrutura do N-terminal da proteína com motivo β→α&#8594β e manutenção do barril β. A busca por parceiros intracelulares, foi realizada através da técnica do duplo hibrido de levedura, usando um biblioteca de cDNA de cérebro de rato. Foram encontrados 4 possíveis parceiros: BRD2, UBE2I, BRPF1, PC4. Todas essas interações foram confirmadas através do crescimento da levedura em meio sem histidina, produção de β-galactosidase e ensaios de \"pull-down\" com GST. Analises por FACS confirmam que FGF2 não causa apoptose em células adrenais tumorais Y1 de camundongo, mas promovem um acumulo de células na fase S com bloqueio do ciclo celular e da proliferação, configurando uma forma de senescência. Resultados com as células humanas HEK-ER:Ras permitem fazer a seguinte generalização: FGF2 induz senescência em células malignas transformadas pelos oncogenes raso A superexpressão da proteína de fusão FGF-2(18kDa):protA, mas não a da FGF-2(22,5 kDa):protA, protege a célula Y1 da senescência induzida por FGF-2. Por outro lado, a superexpressão destas mesmas isoformas de FGF-2 fusionadas à proteína A em células imortalizadas Balb3T3 não causou transformação celular e nem alterou a resposta mitogênica destas células ao FGF-2 recombinante adicionado ao meio de cultura. Células Y1 quando tratadas com FGF-2 recombinante produz ROS intracelular e libera anions superóxido no meio extracelular. Além disso, o anti-oxidante NAC protege estas células da indução de senescência induzida por FGF-2, sugerindo que ROS pode ser intermediário no disparo de senescência por FGF-2. / FGFs comprise a large fami1y of 24 proteins that play key roles in a number of tissues as local paracrine, autocrine and intracrine regulators of mitogenesis, cellular differentiation, organ morphogenesis and tissue repair. Structure-function relationship among FGFs is still poorly understood. FGF-2, the fami1y prototype member, exists as four molecular species. The 18 kDa form is released to the extracellular milieu and binds to specific receptors (FGFR), initiating a complex array of signals. Other isoforms of higher molecular weights (21, 22 and 22,5 kDa) are translated from alternative codons (CUG) and remain inside of the cell interacting with unknown partners. Aiming to anticipate mechanisms and partners, we modeled the FGF2-HMW molecule, showing that the protein displays β→α&#8594β motif in the N-terminal region and maintains the β-barrel structure common to ali FGFs. By the yeast two-hybrid method, using a cDNA rat brain library, we found four possible partners for FGF2-HMW: BRD2, UBE2I, BRP1 and PC4. Ali partners were confirmed by yeast growth without histidine, production of β-galactosidase and \"pull-down\" assays with GST. FACS analyses confirmed that FGF2 does not cause apoptosis in mouse Y1 adrenal tumor cells. But, FGF2 inhibited S phase progression blocking cell cycle and proliferation, characterizing a form of senescence. In addition, results obtained with the human HEK-ER:Ras cells support the following general statement: FGF2 triggers senescence in malignant cells transformed by ras oncogenes. Ectopic expression of the fusion protein FGF-2(18 kDa):protA, but not of FGF-2(22,s kDa):protA, protected Y1 cells senescence induced by FGF-2. On the other hand, ectopic expression of FGF-2 isoforms fusioned to protA in Balb3T3 immortalized cells did not cause transformation and neither modified the mitogenic response of this cell to recombinant FGF2. Recombinant FGF-2 stimules Y1 cells to produce intracellular ROS and to release superoxide anions into intracellular medium. Moreover, the ROS scavenger NAC protect Y1 cells from senescence induced by FGF-2, suggesting that ROS may be mediate senescence triggering induced by FGF-2.

A troponina (Tn) regula a contração do músculo estriado esquelético de vertebrados. Ela é composta de três subunidades: troponina I (TnI), troponina C (TnC) e troponina T (TnT). A TnI tem a função inibitória que é neutralizada pela ligação de Ca2+ nos sítios regulatórios do N-domínio da TnC, e a TnT posiciona o complexo no filamento fino. Para monitorar o sinal do Ca2+ sendo transmitido da TnC para a TnI as propriedades espectrais únicas do 5-hidroxitriptofano (5HW) foram utilizadas. O 5HW foi incorporado em mutantes pontuais de TnI com um único códon para triptofano. Foram identificadas duas sondas espectrais intrínsecas na TnI capazes de detectar a ligação de Ca2+ na Tn: as TnIs com 5HW nas posições 100 e 121. Complexos troponina reconstituídos com estes mutantes fluorescentes de TnI, Tn-TnIF100HW e Tn-TnIM121HW, apresentaram respectivamente 12 e 70 % de aumento na intensidade do espectro de emissão devido à ligação de Ca2+ na TnC. Nos complexos binários (TnC-TnI) as TnIs com 5HW nas posições 106 e 121 também captam a ligação do Ca2+ na TnC. A análise da fluorescência destas sondas demonstrou que: 1) as regiões da TnI que respondem ao N-domínio regulatório da TnC ocupado com Ca2+ são a região inibitória da TnI, resíduos 96 até 116, e a região vizinha que inclui a posição 121 da TnI; 2) mutações pontuais e a incorporação de 5HW na TnI podem afetar tanto a afinidade como a cooperatividade da ligação de Ca2+ na TnC, confirmando o papel da TnI em modular a afinidade da TnC por Ca2+; 3) as constantes de dissociação de Ca2+ surpreendentemente altas, Kd ~ 10-8 M, calculadas a partir dos sinais das sondas na região inibitória da TnI, sugerem a possibilidade de que os sítios do domínio N-terminal da TnC sejam os sítios de ligação de Ca2+ de maior afinidade no complexo troponina. / Vertebrate striated muscle contraction is regulated by troponin (Tn). Tn is composed of three subunits: troponin I (TnI), troponin C (TnC) and troponin T (TnT). TnI has an inhibitory role that is neutralized by calcium binding to the regulatory sites in the N-domain of TnC, and TnT positions the troponin complex on the thin filament. In order to follow the Ca2+ induced conformational change that is transmitted from TnC to TnI, the unique spectral properties of 5-hydroxytryptophan (5HW) incorporated as point-mutants of TnI were used. It was possible to identify two new TnI intrinsic spectral probes sensitive to Ca2+ binding to Tn: TnI with single 5HW at positions 100 and 121. Trimeric troponin complexes reconstituted with two fluorescent mutants of TnI, Tn-TnIF100HW and Tn-TnIM121HW, showed respectively 12 and 70 % increase in the emission spectra when Ca2+ bound to TnC. In the binary complexes (TnC-TnI) two TnIs with 5HW at positions 106 and 121 were also sensitive to Ca2+ binding to TnC. Fluorescence analysis of these probes showed: 1) the regions in TnI that respond to Ca2+ binding to the regulatory N-domain of TnC are the inhibitory region of TnI (residues 96 to 116), and a neighbor region that includes position 121; 2) point mutations and incorporation of 5HW in TnI can affect both the affinity and the cooperativity of Ca2+ binding to TnC, confirming the role of TnI as a modulator of the Ca2+ affinity of TnC; 3) the high dissociation constant for sites in the N-terminal domain of TnC (Kd ~ 10-8 M), derived from data using probes in the inhibitory region of TnI suggested the possibility that these sites are the high affinity Ca2+ binding sites in the troponin complex.