Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-06-28T09:33:23Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1338198 bytes, checksum: 5403979ea8250d61a6a0c78ac9f2e904 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-28T09:33:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1338198 bytes, checksum: 5403979ea8250d61a6a0c78ac9f2e904 (MD5) Previous issue date: 2008-07-30 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Quando em alta densidade populacional, muitas bactérias são capazes de coordenar a expressão de genes via produção e recepção de sinais químicos, por meio de mecanismo denominado quorum sensing. O objetivo deste trabalho foi obter mutantes HalI - das estirpes psicrotróficas isoladas do leite cru refrigerado, 068 e 071 de Hafnia alvei e 067 de Enterobacter cloacae. O gene halI codifica a sintase responsável pela produção de acil homoserina lactonas (AHLs) que são as moléculas sinalizadoras de quorum sensing em H. alvei e E. cloacae. Para obtenção dos mutantes, foi utilizado o vetor suicida pGP704, onde foi clonado o gene halI. Em seguida este gene foi interrompido com o gene que codifica a proteína gentamicina- 3-acetiltransferase, que confere resistência ao antibiótico gentamicina e o plasmídeo foi denominado pGP704halI068::Gm. A transformação das estirpes psicrotróficas com esse vetor resultou em transformantes resistentes a 25 μg mL -1 de gentamicina, mas que ainda produziam AHL, constatada por meio da indução da estirpe monitora de AHL, Chromobacterium violaceum CV 026. A inativação da expressão do gene halI no DNA cromossômico foi obtida após nova transformação desses transformantes com o vetor pUT::Tn5, pertencente ao mesmo grupo de compatibilidade de pGP704. O uso deste sistema de incompatibilidade propiciou a seleção de estirpes onde ocorreu a recombinação homóloga entre o gene halI interrompido pelo gene que confere resistência a gentamicina com o gene halI presente no DNA cromossômico. A confirmação da recombinação do gene halI inativado e clonado no plasmideo com o gene halI cromossômico, foi feita selecionando-se os transformantes em ágar Luria Bertani contendo 50 μg mL -1 de canamicina e gentamicina. Por ensaio de indução de C. violaceum CV026, foi confirmado que os transformantes resistentes a canamicina e gentamicina não induziram a produção do pigmento violaceína pela estirpe monitora. A inativação do gene halI no cromossoma torna essas estirpes ferramentas importantes para elucidação da regulação da expressão de genes pelo mecanismo de quorum sensing. / When population density is high, several bacteria are able to coordinate gene expression by production and reception of chemical signals by means of a mechanism called quorum sensing. The scope of this work was to produce HalI - mutants from psychotrophic bacterias found in fresh cooled milk, 068 and 071 of Hafnia alvei and 067 of Enterobacter cloacae. The halI gene encondes the synthase responsible for the production of acyl-homoserine lactones (AHLs) which are the signaling molecules of quorum sensing for H. alvei and E. cloacae. In order to produce the mutants, it was used the suicide vector pGP704, where the halI gene was cloned. After that, this gene was interrupted with a gene that encodes the protein gentamicin 3-acetyltransferase, responsible for giving resistance to the gentamicin antibiotic. This vector was called pGP704halI068::Gm. The transformation of psychotrophic strain with such vector resulted in transformants cells resistant to 25 μg mL -1 of gentamicin, but they would still produce AHL. AHL production was confirmed by the induction of the monitored strain of AHL, Chromobacterium violaceum CV 026. Expression inactivation of the hall gene in the chromosomic DNA was achieved after new transformation of former transformants with the pUT::Tn5 vector, which belong to the same compatible group of pGP704. The use of this system of incompatibility provided the selection of strain that showed homologous recombination between the hall gene interrupted by the gene that affords resistance to gentamicin and the hall gene of the present chromosomal DNA. Recombination assurance of the halI gene inactivated and cloned in the plasmidium with the halI chromosomic gene was done by selecting the transformants in Luria- Bertani agar containing 50 μg mL -1 of kanamicyn and gentamicin. By means of an induction trial of C. violaceum CV026, it was confirmed that the transformants resistant to kanamicyn and gentamicin did not induced the production of the violacein pigment by the strain being monitored. Inactivation of the halI gene in the chromosome makes these strains important tools for elucidating gene expression regulation by the quorum sensing mechanism. / Dissertação antiga

Submitted by Amanda Carolina Paulino de Oliveira (amanda@posgrad.fcav.unesp.br) on 2018-07-30T23:45:45Z No. of bitstreams: 1 Dissertação final - ACPO - Versão online.pdf: 8789441 bytes, checksum: a845ac98a1435e414423acdc29c30ff5 (MD5) / Approved for entry into archive by Karina Gimenes Fernandes null (karinagi@fcav.unesp.br) on 2018-07-31T11:04:06Z (GMT) No. of bitstreams: 1 oliveira_acp_me_iabo.pdf: 8789441 bytes, checksum: a845ac98a1435e414423acdc29c30ff5 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-31T11:04:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 oliveira_acp_me_iabo.pdf: 8789441 bytes, checksum: a845ac98a1435e414423acdc29c30ff5 (MD5) Previous issue date: 2018-07-04 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Xanthomonas citri subsp. citri 306 (XccA) é o agente causal do cancro cítrico (CC), doença endêmica que afeta a citricultura. Durante a interação patógeno-hospedeiro o sistema de secreção tipo três (SST3) codificado pela XccA age na translocação de efetores e no estabelecimento da doença. A montagem do aparato de SST3 depende da síntese, remodelagem e degradação da parede celular bacteriana, sendo este processo realizado pela ação enzimática de transglicosilases líticas de mureína (LTs). XccA codifica diversas LTs, porém, pouco é conhecido sobre a diversidade de famílias e relação com a virulência. Dentre as LTs com provável relação com a virulência, duas ORFs parálogas presentes no cromossomo e plasmídeo pXAC64, respectivamente; são genes passageiros do TnXax1, um transposon da família Tn3, relacionado a evolução e emergência da patogenicidade nas Xanthomonadales. Portanto, este estudo objetivou elucidar o provável papel e diversidade das LTs presentes no genoma de XccA, caracterizando funcionalmente as LTs presentes em TnXax1 pela técnica de mutação sítio dirigida. Foram identificadas no genoma de XccA 13 LTs, sendo 12 pertencentes às famílias: 1A, 1B, 1C, 1D, 1F, 1G, 3A, 3B (2 cópias), 5A e 6A, e uma não classificada. A LT não classificada, é exclusiva do gênero Xanthomonas e relacionada à família 3B, porém contém um domínio adicional relacionado ao metabolismo de carboidratos. As LTs classificadas em famílias apresentam provável função relacionada com a remodelagem da parede celular para inserção de sistemas de secreção tipo 3, 4 e 6, inserção de flagelo, divisão celular, reciclagem da parede celular e degradação e controle da produção do peptidoglicano. As LTs do TnXax1 pertencem a família 3B, não são essenciais para XccA e desenvolvimento do CC, porém estão relacionadas ao aumento da virulência, diminuição da formação de biofilme, agregação e aumento na produção de goma xantana, corroborando o papel do TnXax1 como agente propagador da patogenicidade e virulência em Xanthomonadales. Em resumo, os resultados lançam novos conhecimentos frente ao papel das LTs com o metabolismo do peptidoglicano e relação com os mecanismos de transferência lateral, virulência e patogenicidade de XccA. / Xanthomonas citri subsp. citri 306 (XccA) is a causal agent of type A citrus canker (CC), one of the most devastating citriculture diseases. Type 3 Secretion Systems (T3SS) play a fundamental role in XccA pathogenicity. T3SS components are embedded in the bacterial inner and outer membrane and act as a channel for injection of effector proteins directly into the plant host cell cytosol. T3SS assembly and installation relies on bacterial cell wall synthesis, remodeling and degradation. Murein lytic transglycosylases (LT) are important in this process and are responsible for peptidoglycan cleavage and its remodeling. Information about the XccA LT arsenal is scarce: little is known about family diversity, their exact role and their connection to virulence in this bacterium. Among the LTs with probable relation to virulence, two paralogue ORFs (one in chromosome, one in pXAC64 plasmid) are passenger genes of the Tn3 family transposon TnXax1, known to play a significant role for evolution and emergence of pathogenicity in Xanthomonadales. This study addresses LT diversity in the XccA genome and examines the role of plasmid and chromosomal TnXax1 LT passenger genes using site-directed deletion mutagenesis and functional characterization. We identified 13 XccA LTs: 12 belong to families 1A, 1B, 1C, 1D (2 copies), 1F, 1G, 3A, 3B (2 copies), 5A, 6A and one which is non-categorized. This noncategorized gene, is exclusive to the Xanthomonas genus and related to the 3B family but contains an additional domain linked to carbohydrate metabolism, whilst the other catalyzes peptidoglycan biosynthesis, and is widely distributed in gammaproteobacteria. The categorized LTs are probably involved in cell wall remodeling to allow insertion of type 3, 4 and 6 secretion systems, flagellum assembly, division and recycling of cell wall and degradation and control of peptidoglycan production. The TnXax1 passenger LTs (3B family) are not essential to XccA and CC development but are implicated in virulence, biofilm production and aggregation decrease and xanthan gum production increase, corroborating the role of TnXax1 transposon as a virulence and pathogenicity propagating agent in XccA. These findings also suggest that LTs acquisition by horizontal gene transfer mediated by TnXax1 improved bacterial fitness, bringing adaptive advantages to the plant-pathogen interaction process. / 33004102070P6

A troponina (Tn) regula a contração do músculo estriado esquelético de vertebrados. Ela é composta de três subunidades: troponina I (TnI), troponina C (TnC) e troponina T (TnT). A TnI tem a função inibitória que é neutralizada pela ligação de Ca2+ nos sítios regulatórios do N-domínio da TnC, e a TnT posiciona o complexo no filamento fino. Para monitorar o sinal do Ca2+ sendo transmitido da TnC para a TnI as propriedades espectrais únicas do 5-hidroxitriptofano (5HW) foram utilizadas. O 5HW foi incorporado em mutantes pontuais de TnI com um único códon para triptofano. Foram identificadas duas sondas espectrais intrínsecas na TnI capazes de detectar a ligação de Ca2+ na Tn: as TnIs com 5HW nas posições 100 e 121. Complexos troponina reconstituídos com estes mutantes fluorescentes de TnI, Tn-TnIF100HW e Tn-TnIM121HW, apresentaram respectivamente 12 e 70 % de aumento na intensidade do espectro de emissão devido à ligação de Ca2+ na TnC. Nos complexos binários (TnC-TnI) as TnIs com 5HW nas posições 106 e 121 também captam a ligação do Ca2+ na TnC. A análise da fluorescência destas sondas demonstrou que: 1) as regiões da TnI que respondem ao N-domínio regulatório da TnC ocupado com Ca2+ são a região inibitória da TnI, resíduos 96 até 116, e a região vizinha que inclui a posição 121 da TnI; 2) mutações pontuais e a incorporação de 5HW na TnI podem afetar tanto a afinidade como a cooperatividade da ligação de Ca2+ na TnC, confirmando o papel da TnI em modular a afinidade da TnC por Ca2+; 3) as constantes de dissociação de Ca2+ surpreendentemente altas, Kd ~ 10-8 M, calculadas a partir dos sinais das sondas na região inibitória da TnI, sugerem a possibilidade de que os sítios do domínio N-terminal da TnC sejam os sítios de ligação de Ca2+ de maior afinidade no complexo troponina. / Vertebrate striated muscle contraction is regulated by troponin (Tn). Tn is composed of three subunits: troponin I (TnI), troponin C (TnC) and troponin T (TnT). TnI has an inhibitory role that is neutralized by calcium binding to the regulatory sites in the N-domain of TnC, and TnT positions the troponin complex on the thin filament. In order to follow the Ca2+ induced conformational change that is transmitted from TnC to TnI, the unique spectral properties of 5-hydroxytryptophan (5HW) incorporated as point-mutants of TnI were used. It was possible to identify two new TnI intrinsic spectral probes sensitive to Ca2+ binding to Tn: TnI with single 5HW at positions 100 and 121. Trimeric troponin complexes reconstituted with two fluorescent mutants of TnI, Tn-TnIF100HW and Tn-TnIM121HW, showed respectively 12 and 70 % increase in the emission spectra when Ca2+ bound to TnC. In the binary complexes (TnC-TnI) two TnIs with 5HW at positions 106 and 121 were also sensitive to Ca2+ binding to TnC. Fluorescence analysis of these probes showed: 1) the regions in TnI that respond to Ca2+ binding to the regulatory N-domain of TnC are the inhibitory region of TnI (residues 96 to 116), and a neighbor region that includes position 121; 2) point mutations and incorporation of 5HW in TnI can affect both the affinity and the cooperativity of Ca2+ binding to TnC, confirming the role of TnI as a modulator of the Ca2+ affinity of TnC; 3) the high dissociation constant for sites in the N-terminal domain of TnC (Kd ~ 10-8 M), derived from data using probes in the inhibitory region of TnI suggested the possibility that these sites are the high affinity Ca2+ binding sites in the troponin complex.

A troponina (Tn) regula a contração do músculo estriado esquelético de vertebrados. Ela é composta de três subunidades: troponina I (TnI), troponina C (TnC) e troponina T (TnT). A TnI tem a função inibitória que é neutralizada pela ligação de Ca2+ nos sítios regulatórios do N-domínio da TnC, e a TnT posiciona o complexo no filamento fino. Para monitorar o sinal do Ca2+ sendo transmitido da TnC para a TnI as propriedades espectrais únicas do 5-hidroxitriptofano (5HW) foram utilizadas. O 5HW foi incorporado em mutantes pontuais de TnI com um único códon para triptofano. Foram identificadas duas sondas espectrais intrínsecas na TnI capazes de detectar a ligação de Ca2+ na Tn: as TnIs com 5HW nas posições 100 e 121. Complexos troponina reconstituídos com estes mutantes fluorescentes de TnI, Tn-TnIF100HW e Tn-TnIM121HW, apresentaram respectivamente 12 e 70 % de aumento na intensidade do espectro de emissão devido à ligação de Ca2+ na TnC. Nos complexos binários (TnC-TnI) as TnIs com 5HW nas posições 106 e 121 também captam a ligação do Ca2+ na TnC. A análise da fluorescência destas sondas demonstrou que: 1) as regiões da TnI que respondem ao N-domínio regulatório da TnC ocupado com Ca2+ são a região inibitória da TnI, resíduos 96 até 116, e a região vizinha que inclui a posição 121 da TnI; 2) mutações pontuais e a incorporação de 5HW na TnI podem afetar tanto a afinidade como a cooperatividade da ligação de Ca2+ na TnC, confirmando o papel da TnI em modular a afinidade da TnC por Ca2+; 3) as constantes de dissociação de Ca2+ surpreendentemente altas, Kd ~ 10-8 M, calculadas a partir dos sinais das sondas na região inibitória da TnI, sugerem a possibilidade de que os sítios do domínio N-terminal da TnC sejam os sítios de ligação de Ca2+ de maior afinidade no complexo troponina. / Vertebrate striated muscle contraction is regulated by troponin (Tn). Tn is composed of three subunits: troponin I (TnI), troponin C (TnC) and troponin T (TnT). TnI has an inhibitory role that is neutralized by calcium binding to the regulatory sites in the N-domain of TnC, and TnT positions the troponin complex on the thin filament. In order to follow the Ca2+ induced conformational change that is transmitted from TnC to TnI, the unique spectral properties of 5-hydroxytryptophan (5HW) incorporated as point-mutants of TnI were used. It was possible to identify two new TnI intrinsic spectral probes sensitive to Ca2+ binding to Tn: TnI with single 5HW at positions 100 and 121. Trimeric troponin complexes reconstituted with two fluorescent mutants of TnI, Tn-TnIF100HW and Tn-TnIM121HW, showed respectively 12 and 70 % increase in the emission spectra when Ca2+ bound to TnC. In the binary complexes (TnC-TnI) two TnIs with 5HW at positions 106 and 121 were also sensitive to Ca2+ binding to TnC. Fluorescence analysis of these probes showed: 1) the regions in TnI that respond to Ca2+ binding to the regulatory N-domain of TnC are the inhibitory region of TnI (residues 96 to 116), and a neighbor region that includes position 121; 2) point mutations and incorporation of 5HW in TnI can affect both the affinity and the cooperativity of Ca2+ binding to TnC, confirming the role of TnI as a modulator of the Ca2+ affinity of TnC; 3) the high dissociation constant for sites in the N-terminal domain of TnC (Kd ~ 10-8 M), derived from data using probes in the inhibitory region of TnI suggested the possibility that these sites are the high affinity Ca2+ binding sites in the troponin complex.