ARAÚJO, E. S. Látex de Plumeria rubra L. (jasmim): perfil protéico, caracterização enzimática e ação contra insetos. 2009. 90 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2009. / Submitted by Francisco Lacerda (lacerda@ufc.br) on 2014-12-15T21:41:55Z No. of bitstreams: 1 2009_dis_esaraujo.pdf: 3707223 bytes, checksum: cc7319968dcadccfe82fc0bbf1676d78 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2015-01-20T14:12:09Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_dis_esaraujo.pdf: 3707223 bytes, checksum: cc7319968dcadccfe82fc0bbf1676d78 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-01-20T14:12:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_dis_esaraujo.pdf: 3707223 bytes, checksum: cc7319968dcadccfe82fc0bbf1676d78 (MD5) Previous issue date: 2009 / Plumeria rubra L. is a laticífera plant belonging to the family Apocynaceae popularly known as Jasmim. For spicy and fragrant flowers make this tree is commonly seen ornate squares and gardens of residential urban centers. Laticífer plants are well known for producing a fluid endogenously generally milky in appearance - latex - that exudates from the plant when it undergoes some type of injury, either by mechanical damage or attack by predators. Latex is a material that has been the subject of biochemical and pharmacological studies show that it is a promising source of compounds with potential biotechnological application. In this study the latex of P. rubra was the subject of biochemical and biological research with emphasis on the search for proteins that could make any deleterious action against agricultural insect pests. Laboratory procedures that employ centrifugation and dialysis allowed the fractionation of latex into three distinct components: rubber (BL), proteins (PLPr) and low molecular weight molecules (DL). The PLPr fraction was subject to biochemical and enzymatic characterization and was used in bioassays with the bean weevil-of-rope, Callosobruchus maculatus and the fruit fly, Ceratitis capitata. The full latex and its fractions were used in testing the repellency of oviposition of C. maculatus and Zabrotes subfasciatus. The BL fraction is the major component of latex, 70 %, while PLPr and DL fractions are about 15 % each one. The content of soluble protein in PLPr fraction was 0.33 mg / mL. Espectrometric and electrophoretic analysis revealed the presence of proteins with molecular weights ranging from 12 to 117 kDa, with a maximum of protein with 26 kDa and pI <6.0. The characterization showed that the enzyme antioxidativas enzymes superoxide dismutase and peroxidase were detected in the protein fraction, as well as activity chitinases. Proteins of latex were able to degrade azocasein (nonspecific substrate) and BANA (specific substrate for cysteine proteases). The proteolytic enzymes were detected mainly of type cysteine and to a lesser extent, serine proteases. The pH and temperature optimum for this activity was 6.0 and 37 ºC respectively, where higher values of temperature cancel the activity. Through experiments with artificial diet can be observed that the protein fraction of latex in 0.4 % was able to reduce by 50 % the survival and, in 0.1 %, reduce the by 50 % the weight gain of larvae of C. maculatus. When these proteins were denatured by heating the larval development was similar to the control, suggesting that the maintenance of protein structure is essential for the observed effect. Proteins of latex were not digested by endogenous proteases of the digestive tract of larvae, suggesting that they would be free to cause deleterious effects. No effect on the development of the larvae of C. capitata was observed when the proteins were added to the diet, even at a concentration of 4 %. Whole latex when adsorbed in bean seeds, showed repellent activity on oviposition of both bruchid, being more evident in Z. subfasciatus. The repellent activity was observed time and dose dependent. The latex was unable to affect the viability of eggs or larval development. The PLPr and DL fractions showed no repellent activity, showing that neither protein nor molecules with low molecular weight are involved in this action. The insects, when exposed directly to the latex for a long period of time had not affected their fecundity or oviposition. / Plumeria rubra L. é uma planta laticífera pertencente à família Apocynaceae popularmente conhecida como Jasmim. Por apresentar flores vistosas e perfumadas, essa árvore é comumente vista ornamentando praças e jardins residenciais dos grandes centros urbanos. Plantas laticíferas são assim denominadas por que produzem endogenamente um fluido de aspecto geralmente leitoso - o látex - que é exsudado da planta quando esta sofre algum tipo de ferimento, seja por dano mecânico ou por ataque de predadores. O látex é um material vegetal que tem sido alvo de estudos bioquímicos e farmacológicos que mostram ser ele uma fonte promissora de compostos com potencial aplicação biotecnológica. No presente trabalho o látex de P. rubra foi alvo de investigações bioquímicas e biológicas com ênfase na pesquisa de proteínas que pudessem apresentar alguma ação deletéria contra insetos pragas agrícolas. Procedimentos laboratoriais que empregam centrifugações e diálises permitiram o fracionamento do látex em três componentes distintos: borracha (BL), proteínas (PLPr) e moléculas de baixa massa molecular (DL). A fração PLPr foi alvo de caracterização bioquímica e enzimática e foi utilizada em bioensaios com o caruncho do feijão-de-corda, Callosobruchus maculatus e com a mosca-das-frutas, Ceratitis capitata. O látex íntegro e suas frações foram utilizados em ensaios de repelência da ovoposição de C. maculatus e Zabrotes subfasciatus. A fração BL é o componente majoritário do látex, 70 %, enquanto as frações PLPr e DL constituem cerca de 15 % cada uma. O teor de proteínas solúveis na fração PLPr foi de 0,33 mg/mL. Análises eletroforética e espectrométricas revelaram a presença de proteínas com massas moleculares que variaram de 12 a 117 kDa, com um máximo de proteínas com 26 kDa e pI<6,0. A caracterização enzimática mostrou que as enzimas antioxidantes superóxido dismutase e peroxidase foram detectadas na fração protéica, assim como, uma atividade quitinásica. As proteínas do látex foram capazes de degradar azocaseína (substrato inespecífico) e BANA (substrato específico para proteases cisteínicas). As enzimas proteolíticas detectadas foram principalmente do tipo cisteínica, e em menor proporção, serínica. O pH e a temperatura ótimos para esta atividade foram 6,0 e 37 ºC, respectivamente, onde valores de temperatura superiores anulam a atividade. Utilizando experimentos de dieta artificial pôde-se observar que a fração protéica do látex a 0,4 % foi capaz de diminuir em 50 % a sobrevivência, e a 0,1 %, diminuir 50 % do ganho de massa das larvas de C. maculatus. Quando essas proteínas foram desnaturadas por aquecimento o desenvolvimento larval foi igual ao controle, sugerindo que a manutenção da estrutura protéica é essencial para o efeito observado. As proteínas do látex não foram digeridas pelas proteases endógenas do trato digestório das larvas, sugerindo que as mesmas ficariam livres para causar o efeito deletério. Nenhum efeito no desenvolvimento das larvas de C. capitata foi observado quando as proteínas foram adicionadas à dieta, mesmo na concentração de 4 %. O látex íntegro, quando adsorvido em sementes de feijão, apresentou atividade inibitória do tipo repelente sobre a ovoposição de ambos os bruquídeos testados, sendo mais evidente em Z. subfasciatus. A ação repelente observada foi dose e tempo dependente. O látex não foi capaz de afetar a viabilidade dos ovos e nem o desenvolvimento larval. As frações PLPr e DL não apresentaram atividade repelente, mostrando que nem proteínas nem moléculas de baixa massa molecular estão envolvidas nessa ação. Os insetos, quando expostos diretamente ao látex por longo período de tempo não tiveram sua fecundidade nem ovoposição afetados, sugerindo que o efeito observado não altera a fisiologia do animal.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Plumeria rubra L. à uma planta laticÃfera pertencente à famÃlia Apocynaceae popularmente conhecida como Jasmim. Por apresentar flores vistosas e perfumadas, essa Ãrvore à comumente vista ornamentando praÃas e jardins residenciais dos grandes centros urbanos. Plantas laticÃferas sÃo assim denominadas por que produzem endogenamente um fluido de aspecto geralmente leitoso - o lÃtex - que à exsudado da planta quando esta sofre algum tipo de ferimento, seja por dano mecÃnico ou por ataque de predadores. O lÃtex à um material vegetal que tem sido alvo de estudos bioquÃmicos e farmacolÃgicos que mostram ser ele uma fonte promissora de compostos com potencial aplicaÃÃo biotecnolÃgica. No presente trabalho o lÃtex de P. rubra foi alvo de investigaÃÃes bioquÃmicas e biolÃgicas com Ãnfase na pesquisa de proteÃnas que pudessem apresentar alguma aÃÃo deletÃria contra insetos pragas agrÃcolas. Procedimentos laboratoriais que empregam centrifugaÃÃes e diÃlises permitiram o fracionamento do lÃtex em trÃs componentes distintos: borracha (BL), proteÃnas (PLPr) e molÃculas de baixa massa molecular (DL). A fraÃÃo PLPr foi alvo de caracterizaÃÃo bioquÃmica e enzimÃtica e foi utilizada em bioensaios com o caruncho do feijÃo-de-corda, Callosobruchus maculatus e com a mosca-das-frutas, Ceratitis capitata. O lÃtex Ãntegro e suas fraÃÃes foram utilizados em ensaios de repelÃncia da ovoposiÃÃo de C. maculatus e Zabrotes subfasciatus. A fraÃÃo BL à o componente majoritÃrio do lÃtex, 70 %, enquanto as fraÃÃes PLPr e DL constituem cerca de 15 % cada uma. O teor de proteÃnas solÃveis na fraÃÃo PLPr foi de 0,33 mg/mL. AnÃlises eletroforÃtica e espectromÃtricas revelaram a presenÃa de proteÃnas com massas moleculares que variaram de 12 a 117 kDa, com um mÃximo de proteÃnas com 26 kDa e pI<6,0. A caracterizaÃÃo enzimÃtica mostrou que as enzimas antioxidantes superÃxido dismutase e peroxidase foram detectadas na fraÃÃo protÃica, assim como, uma atividade quitinÃsica. As proteÃnas do lÃtex foram capazes de degradar azocaseÃna (substrato inespecÃfico) e BANA (substrato especÃfico para proteases cisteÃnicas). As enzimas proteolÃticas detectadas foram principalmente do tipo cisteÃnica, e em menor proporÃÃo, serÃnica. O pH e a temperatura Ãtimos para esta atividade foram 6,0 e 37 ÂC, respectivamente, onde valores de temperatura superiores anulam a atividade. Utilizando experimentos de dieta artificial pÃde-se observar que a fraÃÃo protÃica do lÃtex a 0,4 % foi capaz de diminuir em 50 % a sobrevivÃncia, e a 0,1 %, diminuir 50 % do ganho de massa das larvas de C. maculatus. Quando essas proteÃnas foram desnaturadas por aquecimento o desenvolvimento larval foi igual ao controle, sugerindo que a manutenÃÃo da estrutura protÃica à essencial para o efeito observado. As proteÃnas do lÃtex nÃo foram digeridas pelas proteases endÃgenas do trato digestÃrio das larvas, sugerindo que as mesmas ficariam livres para causar o efeito deletÃrio. Nenhum efeito no desenvolvimento das larvas de C. capitata foi observado quando as proteÃnas foram adicionadas à dieta, mesmo na concentraÃÃo de 4 %. O lÃtex Ãntegro, quando adsorvido em sementes de feijÃo, apresentou atividade inibitÃria do tipo repelente sobre a ovoposiÃÃo de ambos os bruquÃdeos testados, sendo mais evidente em Z. subfasciatus. A aÃÃo repelente observada foi dose e tempo dependente. O lÃtex nÃo foi capaz de afetar a viabilidade dos ovos e nem o desenvolvimento larval. As fraÃÃes PLPr e DL nÃo apresentaram atividade repelente, mostrando que nem proteÃnas nem molÃculas de baixa massa molecular estÃo envolvidas nessa aÃÃo. Os insetos, quando expostos diretamente ao lÃtex por longo perÃodo de tempo nÃo tiveram sua fecundidade nem ovoposiÃÃo afetados, sugerindo que o efeito observado nÃo altera a fisiologia do animal / Plumeria rubra L. is a laticÃfera plant belonging to the family Apocynaceae popularly known as Jasmim. For spicy and fragrant flowers make this tree is commonly seen ornate squares and gardens of residential urban centers. LaticÃfer plants are well known for producing a fluid endogenously generally milky in appearance - latex - that exudates from the plant when it undergoes some type of injury, either by mechanical damage or attack by predators. Latex is a material that has been the subject of biochemical and pharmacological studies show that it is a promising source of compounds with potential biotechnological application. In this study the latex of P. rubra was the subject of biochemical and biological research with emphasis on the search for proteins that could make any deleterious action against agricultural insect pests. Laboratory procedures that employ centrifugation and dialysis allowed the fractionation of latex into three distinct components: rubber (BL), proteins (PLPr) and low molecular weight molecules (DL). The PLPr fraction was subject to biochemical and enzymatic characterization and was used in bioassays with the bean weevil-of-rope, Callosobruchus maculatus and the fruit fly, Ceratitis capitata. The full latex and its fractions were used in testing the repellency of oviposition of C. maculatus and Zabrotes subfasciatus. The BL fraction is the major component of latex, 70 %, while PLPr and DL fractions are about 15 % each one. The content of soluble protein in PLPr fraction was 0.33 mg / mL. Espectrometric and electrophoretic analysis revealed the presence of proteins with molecular weights ranging from 12 to 117 kDa, with a maximum of protein with 26 kDa and pI <6.0. The characterization showed that the enzyme antioxidativas enzymes superoxide dismutase and peroxidase were detected in the protein fraction, as well as activity chitinases. Proteins of latex were able to degrade azocasein (nonspecific substrate) and BANA (specific substrate for cysteine proteases). The proteolytic enzymes were detected mainly of type cysteine and to a lesser extent, serine proteases. The pH and temperature optimum for this activity was 6.0 and 37 ÂC respectively, where higher values of temperature cancel the activity. Through experiments with artificial diet can be observed that the protein fraction of latex in 0.4 % was able to reduce by 50 % the survival and, in 0.1 %, reduce the by 50 % the weight gain of larvae of C. maculatus. When these proteins were denatured by heating the larval development was similar to the control, suggesting that the maintenance of protein structure is essential for the observed effect. Proteins of latex were not digested by endogenous proteases of the digestive tract of larvae, suggesting that they would be free to cause deleterious effects. No effect on the development of the larvae of C. capitata was observed when the proteins were added to the diet, even at a concentration of 4 %. Whole latex when adsorbed in bean seeds, showed repellent activity on oviposition of both bruchid, being more evident in Z. subfasciatus. The repellent activity was observed time and dose dependent. The latex was unable to affect the viability of eggs or larval development. The PLPr and DL fractions showed no repellent activity, showing that neither protein nor molecules with low molecular weight are involved in this action. The insects, when exposed directly to the latex for a long period of time had not affected their fecundity or oviposition.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / A Plumeria rubra L. à uma planta laticÃfera pertencente à famÃlia Apocynaceae, popularmente conhecida como Jasmim. Esta amplamente distribuÃda em regiÃes tropicais e subtropicais, incluindo o Brasil. Essa planta à utilizada popularmente para o tratamento de sÃfilis, febre e como purgativo. Alguns estudos mostram que o lÃtex de P. rubra possui atividade antioxidante e vasodilatadora. O objetivo desse trabalho foi avaliar o efeito gastroprotetor das proteÃnas laticÃferas da Plumeria rubra (PrLP) em modelo de Ãlcera gÃstrica induzida por etanol, investigar o possÃvel envolvimento dos receptores TRPV1, da via NOGMPcKATP e da glutationa, e possÃveis efeitos tÃxicos. A manipulaÃÃo dos animais e os protocolos experimentais foram registrados no Comità de Ãtica Institucional sob o nÃmero 057/2010. Camundongos Swiss (n = 8), em jejum de 16h, foram tratados por via intravenosa com PrLP nas doses de 0,05; 0,5; 5 e 50 mg/kg. ApÃs 30 min da administraÃÃo de PrLP os animais receberam 0,2 ml de etanol absoluto v.o. Decorridos 60 min dessa administraÃÃo, os animais foram sacrificados, os estÃmagos removidos e analisados para determinaÃÃo do Ãndice de lesÃo. Para investigar o envolvimento de mediadores no efeito de PrLP, os animais receberam indometacina (10 mg/kg; v.o.), L-NAME (20 mg/kg; i.p.), ODQ (10 mg/kg; i.p.), glibenclamida (5 mg/kg; i.p.) e capsazepina (5 mg/kg; i.p) antes do tratamento com PrLP (0,5 mg/kg; i.v.). Misoprostol (50 Âg/kg v.o), L-arginina (600 mg/kg; i.p.), diazÃxido (3mg/kg; i.p.) e capsaicina (0,3 mg/kg; v.o.) foram utilizados como droga-padrÃo. Para avaliar o efeito de PrLP sobre os nÃveis de NO3-/NO2, foi realizada sua dosagem no homogenato do estÃmago, mas para investigar um possÃvel efeito antioxidante, foi realizada a dosagem dos nÃveis de GSH em estÃmagos normais e lesionados. Para a toxicidade sub-crÃnica os animais foram tratados por 7 dias com a dose de 50 mg/kg; i.v., seguido da avaliaÃÃo de vÃrios parÃmetros, tais como: peso corporal, hemograma completo, bioquÃmicos (urÃia, ALT e AST) e peso Ãmido de ÃrgÃos vitais (coraÃÃo, baÃo, fÃgado e rim). PrLP nas doses de 0,5; 5 e 50 mg/kg foi capaz de inibir lesÃo gÃstrica em 81,9; 72,8 e 68%, respectivamente, recuperou os nÃveis de GSH na mucosa em 105% quando comparados com o grupo etanol e nÃo alterou os nÃveis de GSH em animais que nÃo tiveram seus estÃmagos lesionados pelo etanol. Adicionalmente, PrLP tambÃm aumentou em 26% os nÃveis de NO3-/NO2- que foram reduzidos pela administraÃÃo de etanol. Indometacina, L-NAME, ODQ, Glibenclamida e capsazepina foram capazes de reverter o efeito de PrLP, demonstrando o envolvimento das Prostaglandinas, NO, GMPc, canais de KATP e dos receptores TRPV1 em seu mecanismo de aÃÃo. AlÃm disso, o tratamento por 7 dias com PrLP nÃo alterou nenhum parÃmetro avaliado, mostrando seguranÃa no seu uso. Estes resultados indicam que PrLP possui atividade farmacolÃgica gastroprotetora sobre a mucosa do estÃmago ao qual parece ser mediada em parte pela modulaÃÃo de prostaglandina, pela via NO/GMPc/KATP e pelos receptores TRPV1, ao qual possuem papel fundamental na manutenÃÃo do fluxo sanguÃneo e na defesa da mucosa gÃstrica. PrLP atua evitando a depleÃÃo dos nÃveis de GSH induzidas pelo etanol. Sendo isto importante para a manutenÃÃo das defesas antioxidantes da mucosa. AlÃm do mais, PrLP nÃo apresenta toxicidade aguda nos animais. / The Plumeria rubra is a laticifer plant of family Apocynaceae, popularly known as âJasmimâ. It is widely distributed in tropical and subtropical regions, including Brazil. This plant is commonly used for the treatment of syphilis, fever, and as a purgative. Some studies show that the latex of P. rubra has antioxidant and vasodilator activity. The aim of this study was to evaluate the gastroprotective effect of laticifers proteins of Plumeria rubra (PrLP) in ethanol-induced gastric damage, to investigate the possible involvement of TRPV1 receptors, NOcGMPKATP pathway and glutathione, and possible toxic effects. Animal handling and experimental protocols were registered on the Institutional Ethics Committee under number 057/2010. Swiss mice (n=8), fasting for 16 hours, were treated intravenously (i.v.) with PrLP doses of 0.05, 0.5, 5 and 50 mg/kg. After 30 min the animals received 0.2 ml of absolute ethanol per oral (p.o.). After 60 min of ethanol administration, the animals were sacrificed, their stomachs removed and analyzed to determine lesion index. To investigate the involvement of mediators in PrLP effect, animals received indomethacin (10 mg/kg, p.o.), L-NAME (20 mg/kg, i.p.), ODQ (10 mg/kg, i.p.), glibenclamide (5 mg/kg, i.p.) and capsazepine (5 mg/kg, i.p.) prior to treatment with PrLP (0.5 mg/kg i.v.). Misoprostol (50 Âg/kg; p.o.), L-arginine (600 mg/kg; i.p.), diazoxide (3 mg/kg; i.p.) and capsaicin (0.3 mg/kg; p.o.) were used as standard-drug. To evaluate the effect of PrLP on the levels of NO3-/NO2, the dosage was performed in the homogenate of the stomach, but to investigate a possible antioxidant effect, it was carried out the measurement of the GSH levels in normal and injured stomachs. For sub-chronic toxicity animals were treated for 7 days with 50 mg/kg i.v., followed by evaluation of various parameters, such as: body weight, complete blood count, biochemical (urea, ALT, AST) and wet weight of vital organs (heart, spleen, liver and kidney). PrLP at doses of 0.5, 5 and 50 mg/kg was able to inhibit the gastric lesions by 81.9, 72.8 and 68%, respectively, retrieving the GSH levels in the mucosa by 105% compared with the ethanol group and PrLP did not alter the GSH levels in animals that were not ethanol-lesioned stomachs. Additionally, PrLP also increased in 26% NO3-/NO2- levels that were reduced by ethanol administration. Indometacin, L-NAME, ODQ, glibenclamide and capsazepine were able to reverse the PrLP protective effect, demonstrating the involvement of prostaglandins, NO, GMPc, potassium channels ATP-dependent and TRPV1 receptors in its mechanism of action. Furthermore, the treatment for 7 days with PrLP did not change any parameter evaluated showing safety in their use. These results indicate that PrLP have gastroprotective pharmacology activity on the gastric mucosa which seems to be mediated in part by modulation of prostaglandin, NO/cGMP/KATP pathway and TRPV1 receptors, which play a fundamental role in maintaining blood flow and gastric mucosa defense. PrLP acts avoiding depletion of GSH levels ethanol-induced. Since this is important for the maintenance of mucosal antioxidant defenses. Moreover, PrLP did not shown acute toxicity in animals.