INTRODUÇÃO: A Glomerulosclerose Segmentar e Focal (GESF) é a glomerulopatia primária mais prevalente no Brasil e sua incidência vem aumentando no mundo inteiro. Na sua forma primária, caracteriza-se clinicamente por acometer pessoas jovens e causar proteinúria acentuada, geralmente acompanhada de síndrome nefrótica. O mecanismo patogênico tem como evento principal a lesão ao podócito, desencadeado por fatores de natureza variada: vírus, drogas/medicamentos, imunológicos, etc. Em 2004, foi publicada a classificação de Columbia, propondo 5 variantes morfológicas distintas na GESF: colapsante (COL), usual (NOS), apical ou tip lesion (TIP), perihilar (PHI) e variante celular (CEL). Diversos estudos comprovam alterações moleculares em podócitos na GESF. Essas alterações são observadas em diversos sítios podocitários: em moléculas envolvidas na fenda de filtração (slit diaphragm), por exemplo, nefrina, podocina e CD2AP; em moléculas do citoesqueleto podocitário, como a -actinina-4 e sinaptopodina; em moléculas marcadoras de diferenciação dos podócitos, como CD10 e WT-1; e ainda em marcadores de divisão celular como Ki-67 e PCNA. Os objetivos desse estudo foram: 1-) classificar as lesões morfológicas de GESF em biópsia renais nas 5 variantes da GESF propostas na Classificação de Columbia; e 2-) analisar a ocorrência de alterações moleculares podocitárias nestes casos. MÉTODOS: Foram selecionados 131 casos de biópsias renais com diagnóstico de GESF primária no período de 1996 a 2006. Os casos foram classificados de acordo com os critérios de Columbia e posteriormente submetidos a reações imuno-histoquímicas para os marcadores CD10, WT-1, vimentina, sinaptopodina, -actinina-4, GLEPP-1, citoqueratina 8/18, citoqueratina 19 e Ki-67. Os resultados foram submetidos à análise estatística através do teste qui-quadrado. RESULTADOS: A classificação das variantes da GESF se distribuiu da seguinte forma: 38,2% de variante NOS, 36,6% de variante COL, 14,5% de variante TIP, 6,9% de variante PHI e 3,8% de variante CEL. Os casos da variante COL se destacaram das demais variantes pela perda de expressão de marcadores de diferenciação celular, como o CD10 e o WT-1 (p<0,01), perda da molécula do citoesqueleto -actinina-4 (p<0,01) e neo-expressão de citoqueratinas 8-18 (p<0,05) e 19 (p<0,01). Adicionalmente, os casos das variantes COL e CEL se destacam das outras variantes pela expressão do marcador de divisão celular Ki-67 (p<0,05). CONCLUSÃO: a variante COL destacou-se das demais em relação às alterações moleculares observadas na análise imuno-histoquímica. O diagnóstico diferencial desta forma de GESF tem importância clínica por ela estar associada a pior evolução e prognóstico em relação às demais variantes. A integração destes marcadores na rotina diagnóstica pode auxiliar no diagnóstico diferencial da GESF COL / INTRODUCTION: Focal segmental glomerulosclerosis (FSGS) is the most prevalent primary glomerulopathy in Brazil and its incidence is increasing worldwide. Primary FSGS is characterized clinically by affecting young people and causing severe proteinuria, often accompanied by nephrotic syndrome. The pathogenesis is related to podocyte injury, which may be due to several factors: viruses, drugs, immunological, etc. In 2004, the Columbia classification of FSGS identified five histological variants of the disease: collapsing (COL), usual (NOS), tip lesion (TIP), perihilar (PHI) and cellular variant (CEL). Several studies have demonstrated molecular changes in podocytes of FSGS patients, which were observed in molecules involved in the filtering function of these cells (nephrin, podocina and CD2AP), in podocyte cytoskeleton molecules (-actinin-4, and synaptopodin), as well as in molecular markers of podocyte differentiation (CD10 and WT-1) and of cell division (Ki-67 and PCNA). The aim of this study was to classify the FSGS biopsies according to the Columbia classification and to analyze the occurrence of molecular changes in the five morphological variants. METHODS: 131 cases of renal biopsies with a diagnosis of primary FSGS in the period 1996 to 2006 were classified according to the criteria of Columbia and then submitted to immunohistochemical reactions with the following antibodies: CD10, WT-1, Vimentin, Synaptopodin, -actinin-4, GLEPP-1, cytokeratin 8-18, cytokeratin 19, and Ki-67. RESULTS: FSGS cases were classified into five variants as follows: 38.2% of NOS variant, 36.6% COL, 14.5% TIP, 6.9% PHI and 3.8% CEL. The COL variant cases distinguished themselves among the other for having lost the expression of CD10 and WT-1 (p <0.01), and also of -actinin-4 (p <0, 01). Furthermore, they gained expression of the cytokeratin 8-18 (p <0.05) and 19 (p <0.01). The group of CEL and COL variants together differed from the other variants regarding the expression of cell division marker Ki-67 (p <0.05). CONCLUSION: COL variant of FSGS presents molecular changes that differs from others and can be demonstrated by immunohistochemistry. The differential diagnosis of this variant is important because of the worse clinical outcome and prognosis it presents in comparison with other variants. The identification of these markers by immunohistochemical on the routine practice may be useful in the diagnosis of COL FSGS

Base teórica: O efeito da vitamina D e análogos sobre a redução da albuminúria na doença renal crônica tem sido demonstrado em estudos clínicos, mas os seus efeitos sobre o podócito glomerular ainda não são claros. Objetivo: Avaliar o efeito da reposição de vitamina D3 sobre a expressão das proteínas associadas ao podócito em pacientes portadores de doença renal crônica (DRC). Métodos: Foram incluídos 27 pacientes portadores de DRC e níveis séricos reduzidos de 25-hidrovitamina D [25(OH)D], com taxa de filtração glomerular estimada (TFGe) entre 15 e 89 ml/min/1,73 m2 e índice proteinúria/creatininúria (IPC) acima de 0,5. Os pacientes receberam reposição de vitamina D3 (colecalciferol) por 6 meses de acordo com o nível sérico de 25(OH)D, sendo mensurados pré e pós tratamento 25(OH)D, TFGe, IPC e outros parâmetros do metabolismo mineral e ósseo. O RNAm de nefrina, podocina, podocalixina, transient receptor potential cation channel 6 (TRPC-6) e dos fatores de crescimento vascular endotelial A (VEGF-A) e transformador beta (TGF-β1) foram quantificados em células do sedimento urinário através da reação em cadeia da polimerase em tempo real, pré e pós reposição de vitamina D3. Os RNAm dos marcadores do podócito foram correlacionados com a 25(OH)D, proteinúria e função renal no período basal e após a intervenção. Resultados: Após 6 meses de suplementação com colecalciferol, a concentração plasmática média da 25(OH)D aumentou de 19  7 ng/mL para 28  11 ng/mL (P = 0.003). A TFGe reduziu -4,71 ml/min/1,73 m2 (p=0,010 vs. basal) e não houve alteração na proteinúria após reposição de vitamina D3, bem como dos parâmetros do metabolismo mineral e ósseo. A 25(OH)D sérica correlacionou-se com a proteinúria, tanto no período basal (r=0,517, p=0,008) quanto após o tratamento (r=0,539, p=0,005). Globalmente, a variação na excreção urinária dos RNAm associados ao podócito após o tratamento não foi estatisticamente significante. Pacientes que atingiram níveis de 25(OH)D ≥20 ng/ml aos seis meses tiveram uma tendência de redução da nefrina [4,48(3,03-5,93) vs. 2,79(1,46-4,12), p=0,085] e da podocina [3,43(2,54-4,32) vs. 2,50(1,21-3,15), p=0,079]; em contrário, no grupo que permaneceu com deficiência de 25(OH)D a podocalixina aumentou significativamente [2,71(2,10- 3,42) vs. 3,63(2,64-4,52), p=0,009] e houve tendência de aumento da nefrina [3,12(2,41-3,10) vs. 4,61(2,83-6,40), p=0,072] e da podocina [3,24(2,37-4,38) vs. 3,83(2,78-4,88), p=0,091)]. Ao final de seis meses, pacientes com melhor nível de função renal (TFGe ≥30 ml/min/1,73 m2) tiveram redução do RNAm de TGF-β1 (p=0,039). Conclusão: A reposição de vitamina D3 (colecalciferol) por seis meses não reduziu a podocitúria ou a proteinúria nestes pacientes com DRC, embora tenha-se observado uma redução marginal no RNAm urinário de nefrina e podocina quando níveis suficientes de 25(OH)D foram atingidos. O uso mais precoce e mais prolongado da vitamina D3 deveria ser investigado como potencial medida de nefroproteção adicional em pacientes renais crônicos. / Background: Previous studies have demonstrated that vitamin D or analog decreases albuminuria in chronic kidney disease (CKD) patients. However, the precise mechanism underlying the potential protective effects of vitamin D on glomerular podocytes is unclear. Objective: In this study we investigated the effect of vitamin D3 supplementation on urinary podocytes protein expression. Methods: Twenty-seven CKD patients who had low baseline vitamin D [25(OH)D] levels, estimated glomerular filtration rate (eGFR) between 15 and 89 ml/min/1,73 m2, and proteinuria/creatininuria index (PCI) higher than 0,5 were studied. During 6 months, all of the patients received cholecalciferol (vitamin D3) supplementation according to 25(OH)D level. Estimated GFR, PCI, 25(OH)D levels, and bone and mineral metabolism parameters were measured at the baseline and after 6 months. In addition, messenger RNA (mRNA) of nephrin, podocin, podocalyxin, transient receptor potential cation channel 6 (TRPC-6), vascular endothelial growth factor A (VEGF-A), and transformig growth factor β1 (TGF-β1) were quantified in urinary sediment cells using real time polymerase chain reaction before and after intervention. The podocyte markers were correlated with 25(OH)D levels, proteinuria and renal function after vitamin D3 supplementation. Results: During cholecalciferol supplementation, the mean 25(OH)D concentration increased from 19  7 ng/mL at baseline to 28  11 ng/mL at month 6 (P = 0.003). Urinary proteinuria did not change after cholecalciferol supplementation. However, eGFR decreased -4.71 ml/min/1.73 m2 (p=0.010 vs. baseline. The serum levels of 25(OH)D were correlated with proteinuria in both periods: baseline (r=0.517, p=0.008) and posttreatment (r=0.539, p=0.005). Patients who reached 25(OH)D levels ≥20 mg/ml at 6 months showed a trend of lower nephrin [4.48(3.03-5.93) vs. 2.79(1.46-4.12), p=0.085] and podocin [3.43(2.54-4.32) vs. 2,50(1.21-3.15), p=0.079]. On the other side, podocalyxin levels increased significantly [2.71(2.10-3.42) vs. 3.63(2.64-4.52), p=0.009] and both nephrin and podocin also increased but these not significant statistically [nephrin: 3.12 (2.41-3.10) vs. 4.61 (2.83-6.40), p=0,072; podocin: 3.24 (2.37-4.38) vs. 3.83 (2.78-4.88), p=0.091)]. After 6 months supplementation, patients with higher levels of renal function (eGFR ≥30 ml/min/1.73 m2) showed reduction of TGF-β1 RNAm (p=0.039). Conclusion: Vitamin D3 (cholecalciferol) supplementation during 6 months did not changed proteinuria level. However, we observed a reduction of urinary nephrin and podocin mRNA in patients who reached sufficient 25(OH)D levels. Larger studies are needed to clarify whether vitamin D3 supplementation, mainly on early stages of CKD, may have beneficial effects on lowering proteinuria and on delaying progression of CKD.

Introdução: A lesão do podócito exerce um papel crítico na nefropatia diabética (ND) e é um fator preditivo de albuminúria patológica e progressão da doença. Neste estudo foi avaliada a expressão gênica de proteínas associadas ao podócito na urina de pacientes diabéticos em diferentes estágios da ND e em indivíduos com pré diabetes. Material e Métodos: Foram estudados 67 pacientes diabéticos com normo (n=34), micro (n=14) ou macroalbuminúria (n=19), dezenove indivíduos pré diabéticos e 15 controles saudáveis. O RNAm de nefrina, podocina, podocalixina, sinaptopodina, Transient Receptor Potential Cation Channel 6 (TRPC6), alfa actinina-4 e TGF1 foi quantificado por PCR em tempo real (2-ΔΔCt) em células do sedimento urinário. A expressão dos genes alvo do podócito foi correlacionada com albuminúria, controle glicêmico e função renal. O desempenho diagnóstico dos genes para albuminúria patológica foi determinado por curva ROC, e o seu efeito independente sobre esse desfecho foi avaliado por análise de regressão de Poisson. Resultados: O RNAm na urina dos genes alvo foi significativamente maior nos pacientes diabéticos em comparação aos não diabéticos, exceto de sinaptopodina e TGFβ1. A expressão de nefrina foi mais elevada nos indivíduos diabéticos micro e macroalbuminúricos comparado aos controles (p=0,04 e p<0,001 respectivamente), pré diabéticos (p<0,05) e normoalbuminúricos (p<0,05). Embora sua expressão tenha sido maior do que nos não diabéticos, os genes TRPC6, podocalixina e alfa actinina-4 não discriminaram os estágios da ND. A correlação da expressão dos genes com albuminúria e hemoglobina glicada foi estatisticamente significativa. Pacientes pré diabéticos tiveram expressão gênica semelhante aos controles. Na análise multivariada, apenas o gene da nefrina foi preditivo de albuminúria patológica. 6 Conclusões: A expressão das proteínas associadas ao podócito na urina foi maior nos pacientes diabéticos, mas não houve correlação direta do RNAm dos genes com níveis crescentes de albuminúria, exceto de nefrina. O gene da nefrina foi o único que discriminou os diferentes estágios da ND e foi preditivo de albuminúria patológica, mas a podocalixina e o TRPC6 também se correlacionaram com albuminúria e controle glicêmico. Neste estudo preliminar não se identificou aumento da expressão gênica das proteínas do podócito na urina em indivíduos com pré diabetes. / Introduction: Podocyte damage plays a critical role in the development of diabetic nephropathy (DN). The present study evaluated gene expression of podocyte-associated proteins in urine of pre-diabetic and diabetic patients at different stages of DN. Material and Methods: We studied 19 pre-diabetic patients, 67 diabetic patients with normo (n = 34), micro (n = 15), or macroalbuminuria (n = 19), and 15 healthy controls. Levels of mRNA of nephrin, podocin, podocalyxin, synaptopodin, transient receptor potential cation channel 6 (TRPC6), alpha-actinin-4, and TGF-1 were quantitatively measured by real-time polymerase chain reaction in urinary sediment. Gene expression was correlated with albuminuria, glycemic control, and renal function. The diagnostic performance of the genes for detecting pathological albuminuria was assessed by the receiver operating characteristic (ROC) curve and Poisson regression. Results: The mRNA expression of target genes in urinary sediment was significantly higher in diabetic compared to pre-diabetic patients and controls. Levels of nephrin were higher in diabetic patients with micro or macroalbuminuria than controls (p= 0.04 and p<0.001, respectively), pre-diabetic (p<0.05), and diabetic patients with normoalbuminuria (p<0.05), and increased with increasing rates of albuminuria. Gene expression was similar in pre-diabetic patients and controls. There was a significant positive correlation of gene expression with albuminuria and glycated hemoglobin. In the multivariate analysis, only nephrinuria predicted pathological albuminuria. Conclusions: The expression of podocyte-associated proteins in urine was higher in diabetic patients, but only nephrin correlated with increasing albuminuria and predicted 8 pathological albuminuria. This preliminary study did not find increased gene transcription in pre-diabetic patients.

Introdução: A lesão do podócito exerce um papel crítico na nefropatia diabética (ND) e é um fator preditivo de albuminúria patológica e progressão da doença. Neste estudo foi avaliada a expressão gênica de proteínas associadas ao podócito na urina de pacientes diabéticos em diferentes estágios da ND e em indivíduos com pré diabetes. Material e Métodos: Foram estudados 67 pacientes diabéticos com normo (n=34), micro (n=14) ou macroalbuminúria (n=19), dezenove indivíduos pré diabéticos e 15 controles saudáveis. O RNAm de nefrina, podocina, podocalixina, sinaptopodina, Transient Receptor Potential Cation Channel 6 (TRPC6), alfa actinina-4 e TGF1 foi quantificado por PCR em tempo real (2-ΔΔCt) em células do sedimento urinário. A expressão dos genes alvo do podócito foi correlacionada com albuminúria, controle glicêmico e função renal. O desempenho diagnóstico dos genes para albuminúria patológica foi determinado por curva ROC, e o seu efeito independente sobre esse desfecho foi avaliado por análise de regressão de Poisson. Resultados: O RNAm na urina dos genes alvo foi significativamente maior nos pacientes diabéticos em comparação aos não diabéticos, exceto de sinaptopodina e TGFβ1. A expressão de nefrina foi mais elevada nos indivíduos diabéticos micro e macroalbuminúricos comparado aos controles (p=0,04 e p<0,001 respectivamente), pré diabéticos (p<0,05) e normoalbuminúricos (p<0,05). Embora sua expressão tenha sido maior do que nos não diabéticos, os genes TRPC6, podocalixina e alfa actinina-4 não discriminaram os estágios da ND. A correlação da expressão dos genes com albuminúria e hemoglobina glicada foi estatisticamente significativa. Pacientes pré diabéticos tiveram expressão gênica semelhante aos controles. Na análise multivariada, apenas o gene da nefrina foi preditivo de albuminúria patológica. 6 Conclusões: A expressão das proteínas associadas ao podócito na urina foi maior nos pacientes diabéticos, mas não houve correlação direta do RNAm dos genes com níveis crescentes de albuminúria, exceto de nefrina. O gene da nefrina foi o único que discriminou os diferentes estágios da ND e foi preditivo de albuminúria patológica, mas a podocalixina e o TRPC6 também se correlacionaram com albuminúria e controle glicêmico. Neste estudo preliminar não se identificou aumento da expressão gênica das proteínas do podócito na urina em indivíduos com pré diabetes. / Introduction: Podocyte damage plays a critical role in the development of diabetic nephropathy (DN). The present study evaluated gene expression of podocyte-associated proteins in urine of pre-diabetic and diabetic patients at different stages of DN. Material and Methods: We studied 19 pre-diabetic patients, 67 diabetic patients with normo (n = 34), micro (n = 15), or macroalbuminuria (n = 19), and 15 healthy controls. Levels of mRNA of nephrin, podocin, podocalyxin, synaptopodin, transient receptor potential cation channel 6 (TRPC6), alpha-actinin-4, and TGF-1 were quantitatively measured by real-time polymerase chain reaction in urinary sediment. Gene expression was correlated with albuminuria, glycemic control, and renal function. The diagnostic performance of the genes for detecting pathological albuminuria was assessed by the receiver operating characteristic (ROC) curve and Poisson regression. Results: The mRNA expression of target genes in urinary sediment was significantly higher in diabetic compared to pre-diabetic patients and controls. Levels of nephrin were higher in diabetic patients with micro or macroalbuminuria than controls (p= 0.04 and p<0.001, respectively), pre-diabetic (p<0.05), and diabetic patients with normoalbuminuria (p<0.05), and increased with increasing rates of albuminuria. Gene expression was similar in pre-diabetic patients and controls. There was a significant positive correlation of gene expression with albuminuria and glycated hemoglobin. In the multivariate analysis, only nephrinuria predicted pathological albuminuria. Conclusions: The expression of podocyte-associated proteins in urine was higher in diabetic patients, but only nephrin correlated with increasing albuminuria and predicted 8 pathological albuminuria. This preliminary study did not find increased gene transcription in pre-diabetic patients.

Base teórica: O efeito da vitamina D e análogos sobre a redução da albuminúria na doença renal crônica tem sido demonstrado em estudos clínicos, mas os seus efeitos sobre o podócito glomerular ainda não são claros. Objetivo: Avaliar o efeito da reposição de vitamina D3 sobre a expressão das proteínas associadas ao podócito em pacientes portadores de doença renal crônica (DRC). Métodos: Foram incluídos 27 pacientes portadores de DRC e níveis séricos reduzidos de 25-hidrovitamina D [25(OH)D], com taxa de filtração glomerular estimada (TFGe) entre 15 e 89 ml/min/1,73 m2 e índice proteinúria/creatininúria (IPC) acima de 0,5. Os pacientes receberam reposição de vitamina D3 (colecalciferol) por 6 meses de acordo com o nível sérico de 25(OH)D, sendo mensurados pré e pós tratamento 25(OH)D, TFGe, IPC e outros parâmetros do metabolismo mineral e ósseo. O RNAm de nefrina, podocina, podocalixina, transient receptor potential cation channel 6 (TRPC-6) e dos fatores de crescimento vascular endotelial A (VEGF-A) e transformador beta (TGF-β1) foram quantificados em células do sedimento urinário através da reação em cadeia da polimerase em tempo real, pré e pós reposição de vitamina D3. Os RNAm dos marcadores do podócito foram correlacionados com a 25(OH)D, proteinúria e função renal no período basal e após a intervenção. Resultados: Após 6 meses de suplementação com colecalciferol, a concentração plasmática média da 25(OH)D aumentou de 19  7 ng/mL para 28  11 ng/mL (P = 0.003). A TFGe reduziu -4,71 ml/min/1,73 m2 (p=0,010 vs. basal) e não houve alteração na proteinúria após reposição de vitamina D3, bem como dos parâmetros do metabolismo mineral e ósseo. A 25(OH)D sérica correlacionou-se com a proteinúria, tanto no período basal (r=0,517, p=0,008) quanto após o tratamento (r=0,539, p=0,005). Globalmente, a variação na excreção urinária dos RNAm associados ao podócito após o tratamento não foi estatisticamente significante. Pacientes que atingiram níveis de 25(OH)D ≥20 ng/ml aos seis meses tiveram uma tendência de redução da nefrina [4,48(3,03-5,93) vs. 2,79(1,46-4,12), p=0,085] e da podocina [3,43(2,54-4,32) vs. 2,50(1,21-3,15), p=0,079]; em contrário, no grupo que permaneceu com deficiência de 25(OH)D a podocalixina aumentou significativamente [2,71(2,10- 3,42) vs. 3,63(2,64-4,52), p=0,009] e houve tendência de aumento da nefrina [3,12(2,41-3,10) vs. 4,61(2,83-6,40), p=0,072] e da podocina [3,24(2,37-4,38) vs. 3,83(2,78-4,88), p=0,091)]. Ao final de seis meses, pacientes com melhor nível de função renal (TFGe ≥30 ml/min/1,73 m2) tiveram redução do RNAm de TGF-β1 (p=0,039). Conclusão: A reposição de vitamina D3 (colecalciferol) por seis meses não reduziu a podocitúria ou a proteinúria nestes pacientes com DRC, embora tenha-se observado uma redução marginal no RNAm urinário de nefrina e podocina quando níveis suficientes de 25(OH)D foram atingidos. O uso mais precoce e mais prolongado da vitamina D3 deveria ser investigado como potencial medida de nefroproteção adicional em pacientes renais crônicos. / Background: Previous studies have demonstrated that vitamin D or analog decreases albuminuria in chronic kidney disease (CKD) patients. However, the precise mechanism underlying the potential protective effects of vitamin D on glomerular podocytes is unclear. Objective: In this study we investigated the effect of vitamin D3 supplementation on urinary podocytes protein expression. Methods: Twenty-seven CKD patients who had low baseline vitamin D [25(OH)D] levels, estimated glomerular filtration rate (eGFR) between 15 and 89 ml/min/1,73 m2, and proteinuria/creatininuria index (PCI) higher than 0,5 were studied. During 6 months, all of the patients received cholecalciferol (vitamin D3) supplementation according to 25(OH)D level. Estimated GFR, PCI, 25(OH)D levels, and bone and mineral metabolism parameters were measured at the baseline and after 6 months. In addition, messenger RNA (mRNA) of nephrin, podocin, podocalyxin, transient receptor potential cation channel 6 (TRPC-6), vascular endothelial growth factor A (VEGF-A), and transformig growth factor β1 (TGF-β1) were quantified in urinary sediment cells using real time polymerase chain reaction before and after intervention. The podocyte markers were correlated with 25(OH)D levels, proteinuria and renal function after vitamin D3 supplementation. Results: During cholecalciferol supplementation, the mean 25(OH)D concentration increased from 19  7 ng/mL at baseline to 28  11 ng/mL at month 6 (P = 0.003). Urinary proteinuria did not change after cholecalciferol supplementation. However, eGFR decreased -4.71 ml/min/1.73 m2 (p=0.010 vs. baseline. The serum levels of 25(OH)D were correlated with proteinuria in both periods: baseline (r=0.517, p=0.008) and posttreatment (r=0.539, p=0.005). Patients who reached 25(OH)D levels ≥20 mg/ml at 6 months showed a trend of lower nephrin [4.48(3.03-5.93) vs. 2.79(1.46-4.12), p=0.085] and podocin [3.43(2.54-4.32) vs. 2,50(1.21-3.15), p=0.079]. On the other side, podocalyxin levels increased significantly [2.71(2.10-3.42) vs. 3.63(2.64-4.52), p=0.009] and both nephrin and podocin also increased but these not significant statistically [nephrin: 3.12 (2.41-3.10) vs. 4.61 (2.83-6.40), p=0,072; podocin: 3.24 (2.37-4.38) vs. 3.83 (2.78-4.88), p=0.091)]. After 6 months supplementation, patients with higher levels of renal function (eGFR ≥30 ml/min/1.73 m2) showed reduction of TGF-β1 RNAm (p=0.039). Conclusion: Vitamin D3 (cholecalciferol) supplementation during 6 months did not changed proteinuria level. However, we observed a reduction of urinary nephrin and podocin mRNA in patients who reached sufficient 25(OH)D levels. Larger studies are needed to clarify whether vitamin D3 supplementation, mainly on early stages of CKD, may have beneficial effects on lowering proteinuria and on delaying progression of CKD.

Base teórica: O efeito da vitamina D e análogos sobre a redução da albuminúria na doença renal crônica tem sido demonstrado em estudos clínicos, mas os seus efeitos sobre o podócito glomerular ainda não são claros. Objetivo: Avaliar o efeito da reposição de vitamina D3 sobre a expressão das proteínas associadas ao podócito em pacientes portadores de doença renal crônica (DRC). Métodos: Foram incluídos 27 pacientes portadores de DRC e níveis séricos reduzidos de 25-hidrovitamina D [25(OH)D], com taxa de filtração glomerular estimada (TFGe) entre 15 e 89 ml/min/1,73 m2 e índice proteinúria/creatininúria (IPC) acima de 0,5. Os pacientes receberam reposição de vitamina D3 (colecalciferol) por 6 meses de acordo com o nível sérico de 25(OH)D, sendo mensurados pré e pós tratamento 25(OH)D, TFGe, IPC e outros parâmetros do metabolismo mineral e ósseo. O RNAm de nefrina, podocina, podocalixina, transient receptor potential cation channel 6 (TRPC-6) e dos fatores de crescimento vascular endotelial A (VEGF-A) e transformador beta (TGF-β1) foram quantificados em células do sedimento urinário através da reação em cadeia da polimerase em tempo real, pré e pós reposição de vitamina D3. Os RNAm dos marcadores do podócito foram correlacionados com a 25(OH)D, proteinúria e função renal no período basal e após a intervenção. Resultados: Após 6 meses de suplementação com colecalciferol, a concentração plasmática média da 25(OH)D aumentou de 19  7 ng/mL para 28  11 ng/mL (P = 0.003). A TFGe reduziu -4,71 ml/min/1,73 m2 (p=0,010 vs. basal) e não houve alteração na proteinúria após reposição de vitamina D3, bem como dos parâmetros do metabolismo mineral e ósseo. A 25(OH)D sérica correlacionou-se com a proteinúria, tanto no período basal (r=0,517, p=0,008) quanto após o tratamento (r=0,539, p=0,005). Globalmente, a variação na excreção urinária dos RNAm associados ao podócito após o tratamento não foi estatisticamente significante. Pacientes que atingiram níveis de 25(OH)D ≥20 ng/ml aos seis meses tiveram uma tendência de redução da nefrina [4,48(3,03-5,93) vs. 2,79(1,46-4,12), p=0,085] e da podocina [3,43(2,54-4,32) vs. 2,50(1,21-3,15), p=0,079]; em contrário, no grupo que permaneceu com deficiência de 25(OH)D a podocalixina aumentou significativamente [2,71(2,10- 3,42) vs. 3,63(2,64-4,52), p=0,009] e houve tendência de aumento da nefrina [3,12(2,41-3,10) vs. 4,61(2,83-6,40), p=0,072] e da podocina [3,24(2,37-4,38) vs. 3,83(2,78-4,88), p=0,091)]. Ao final de seis meses, pacientes com melhor nível de função renal (TFGe ≥30 ml/min/1,73 m2) tiveram redução do RNAm de TGF-β1 (p=0,039). Conclusão: A reposição de vitamina D3 (colecalciferol) por seis meses não reduziu a podocitúria ou a proteinúria nestes pacientes com DRC, embora tenha-se observado uma redução marginal no RNAm urinário de nefrina e podocina quando níveis suficientes de 25(OH)D foram atingidos. O uso mais precoce e mais prolongado da vitamina D3 deveria ser investigado como potencial medida de nefroproteção adicional em pacientes renais crônicos. / Background: Previous studies have demonstrated that vitamin D or analog decreases albuminuria in chronic kidney disease (CKD) patients. However, the precise mechanism underlying the potential protective effects of vitamin D on glomerular podocytes is unclear. Objective: In this study we investigated the effect of vitamin D3 supplementation on urinary podocytes protein expression. Methods: Twenty-seven CKD patients who had low baseline vitamin D [25(OH)D] levels, estimated glomerular filtration rate (eGFR) between 15 and 89 ml/min/1,73 m2, and proteinuria/creatininuria index (PCI) higher than 0,5 were studied. During 6 months, all of the patients received cholecalciferol (vitamin D3) supplementation according to 25(OH)D level. Estimated GFR, PCI, 25(OH)D levels, and bone and mineral metabolism parameters were measured at the baseline and after 6 months. In addition, messenger RNA (mRNA) of nephrin, podocin, podocalyxin, transient receptor potential cation channel 6 (TRPC-6), vascular endothelial growth factor A (VEGF-A), and transformig growth factor β1 (TGF-β1) were quantified in urinary sediment cells using real time polymerase chain reaction before and after intervention. The podocyte markers were correlated with 25(OH)D levels, proteinuria and renal function after vitamin D3 supplementation. Results: During cholecalciferol supplementation, the mean 25(OH)D concentration increased from 19  7 ng/mL at baseline to 28  11 ng/mL at month 6 (P = 0.003). Urinary proteinuria did not change after cholecalciferol supplementation. However, eGFR decreased -4.71 ml/min/1.73 m2 (p=0.010 vs. baseline. The serum levels of 25(OH)D were correlated with proteinuria in both periods: baseline (r=0.517, p=0.008) and posttreatment (r=0.539, p=0.005). Patients who reached 25(OH)D levels ≥20 mg/ml at 6 months showed a trend of lower nephrin [4.48(3.03-5.93) vs. 2.79(1.46-4.12), p=0.085] and podocin [3.43(2.54-4.32) vs. 2,50(1.21-3.15), p=0.079]. On the other side, podocalyxin levels increased significantly [2.71(2.10-3.42) vs. 3.63(2.64-4.52), p=0.009] and both nephrin and podocin also increased but these not significant statistically [nephrin: 3.12 (2.41-3.10) vs. 4.61 (2.83-6.40), p=0,072; podocin: 3.24 (2.37-4.38) vs. 3.83 (2.78-4.88), p=0.091)]. After 6 months supplementation, patients with higher levels of renal function (eGFR ≥30 ml/min/1.73 m2) showed reduction of TGF-β1 RNAm (p=0.039). Conclusion: Vitamin D3 (cholecalciferol) supplementation during 6 months did not changed proteinuria level. However, we observed a reduction of urinary nephrin and podocin mRNA in patients who reached sufficient 25(OH)D levels. Larger studies are needed to clarify whether vitamin D3 supplementation, mainly on early stages of CKD, may have beneficial effects on lowering proteinuria and on delaying progression of CKD.

Estudos com células tronco (CT) têm despertado grande interesse devido ao seu promissor potencial terapêutico. Neste contexto, as CT mesenquimais (CTm) representam uma alternativa para o tratamento de diversas patologias em diferentes órgãos, inclusive o rim e as glomerulopatias que o acometem. As doenças glomerulares constituem uma freqüente causa de doença renal crônica e se caracterizam por apresentar proteinúria. Neste processo, os podócitos são células que apresentam um papel crucial, sendo que as podocitopatias se associam com o aparecimento de proteinúria e desenvolvimento de esclerose glomerular. A obtenção de um modelo de podocitopatia através da administração de aminonucleosídeo de puromicina (PAN), permite a melhor compreensão dessas células altamente diferenciadas que não possuem potencial de proliferação ou regeneração. O presente projeto teve como objetivo estabelecer o modelo experimental de nefropatia crônica induzida por PAN associado à nefrectomia unilateral (UniNx) para induzir lesões glomerulares mais exuberantes e, neste modelo experimental, avaliar o efeito da infusão de CTm derivadas da medula óssea. Ratos Wistar (n=52) foram divididos em três grupos: Controle (UniNx), PAN (PAN+UniNx) e PAN+CTm (PAN+UniNx+CTm). As CTm foram inoculadas na região subcapsular renal no dia 0 e os animais foram sacrificados após 30 e 60 dias. O efeito da infusão das CTm no tecido renal foi avaliado através de parâmetros clínicos e laboratoriais, além de análise histológica, imunohistoquímica, microscopia eletrônica e PCR em tempo real. Paralelamente, o projeto analisou a diferenciação in vitro de CTm em podócitos através do estímulo com colágeno tipo IV e através de cocultura de glomérulos isolados de ratos com CTm. A diferenciação celular das CTm foi analisada por citometria de fluxo, imunocitoquímica e PCR em tempo real para genes de proteínas podocitárias. No modelo in vivo foi possível observar a presença de CTm até 15 dias após a inoculação na região subcapsular renal. As CTm foram capazes de diminuir significativamente a proteinúria e a albuminúria com 30 e 60 dias, assim como a pressão arterial aos 60 dias. Não houve diferença nos valores de creatinina, uréia sérica, glomeruloesclerose e fibrose intersticial entre o grupo PAN e o grupo PAN+CTm. As CTm foram responsáveis pela diminuição significativa da fusão dos pedicelos à microscopia eletrônica, com melhora da expressão relativa de WT1 aos 60 dias e melhora parcial da expressão gênica de nefrina, podocina e sinaptopodina. A expressão proteica de WT1 também foi significativamente maior no grupo PAN+CTm em comparação ao grupo PAN. Além disso, houve melhora significante da expressão relativa de IL-4 e IL-10, e diminuição de IL-1? e TNF-? no grupo tratado. Ainda, as CTm promoveram aumento significativo da expressão gênica de VEGF aos 60 dias. Nos resultados in vitro não houve diferenciação das CTm em podócitos quando cultivadas com colágeno IV, assim como a cocultura com glomérulos não proporcionou alteração na expressão de marcadores de superfície das CTm. Concluímos que a terapia celular com CTm foi capaz de induzir proteção renal caracterizada por diminuição da proteinúria, da albuminúria e da pressão arterial, associado a menor fusão dos pedicelos, maior expressão gênica de proteínas podocitárias e de expressão celular de WT1. As citocinas inflamatórias IL-1?, TNF-?, IL-4 e IL-10, em conjunto com o VEGF, foram os possíveis mediadores responsáveis por estes resultados / Stem cells (SC) have emerged as a potential therapeutic approach for several diseases. In this context, the mesenchymal SC (mSC) are considered an alternative for the treatment of kidney diseases such as glomerulopathies. Glomerular diseases are an important cause of chronic kidney disease (CKD) and are characterized by proteinuria. In this process, the podocytes are cells that have a critical role, and the podocytopathies are associated with the onset of proteinuria and glomerular sclerosis. The achievement of a podocytopathy model through administration of puromycin (PAN) allows a better understanding of these highly differentiated cells which do not have the potential for proliferation or regeneration. The aim of the present study was to establish an experimental model of chronic nephropathy induced by PAN associated with unilateral nephrectomy (UniNx), to induce early and marked glomerular lesions and, in this experimental model, to evaluate the effect of bone marrow mSC infusion. Wistar rats (n=52) were randomly divided into three groups: Control (UniNx), PAN (PAN+UniNx) and PAN+mSC (PAN+UniNx+mSC). mSC were inoculated into the subcapsular renal region on day 0, and the animals were sacrificed after 30 and 60 days. The mSC infusion effects in renal tissue were evaluated by clinical and laboratory parameters, histology, immunohistochemistry, electron microscopy and real-time PCR. In parallel, we analyzed whether mSC could differentiate in vitro into podocytes through stimulation with collagen type IV or by means of co-culture of isolated rat glomeruli with mSC. The cell differentiation was analyzed by flow cytometry, immunocytochemistry and real-time PCR. In the in vivo model, mSC were detected until 15 days after inoculation in the renal subcapsular region. mSC were able to significantly reduce the proteinuria and albuminuria with 30 and 60 days, as well as blood pressure at 60 days. There was no difference in the values of creatinine, BUN, glomerulosclerosis and interstitial fibrosis between the groups PAN and PAN+mSC. The treated group showed lower effacement of foot process by electron microscopy, with significant improvement in the relative expression of WT1 in 60 days and partial improvement of nephrin, podocyn and synaptopodin. The WT1 protein expression was also significantly higher in the PAN+mSC group compared to the PAN group. In addition, mSC treatment significantly reduced gene expression of IL-1? and TNF-?, as well as increased the expression of IL-4 and IL-10. At 60 days mSC promoted significant increase of VEGF relative expression. In vitro results, mSC cultived with collagen type IV did not show differentiation to podocytes and the co-culture with glomeruli provided no change in expression of mSC surface markers. In conclusion, mSC therapy in the PAN model was able to induce renal protection characterized by the reduction of albuminuria, proteinuria and blood pressure, associated with a lower effacement of foot process, increased gene expression of podocytes proteins and cellular expression of WT1. Inflammatory cytokines IL-1?, TNF-?, IL-4 and IL-10 associated with VEGF were the probable mediators of these results, promoting podocyte protection