La matrice extracellulaire (MEC) constitue une source de balises moléculaires qui guident les axones moteurs en direction de leur cible musculaire. Le collagène XV (COLXV) est un collagène associé aux lames basales qui est codé par deux paralogues chez le poisson zèbre, col15a1a et col15a1b. Au cours de ma thèse, nous avons déterminé le patron d’expression du second paralogue col15a1b et caractérisé sa fonction in vivo au cours du développement du poisson zèbre. Dans le tronc, col15a1b est spécifiquement exprimé par les précurseurs du muscle lent qui sont la source d’un grand nombre de molécules de la MEC constituant le chemin des axones moteurs en croissance. Grâce à des anticorps spécifiquement dirigés contre COLXV-B nouvellement générés, nous avons montré que COLXV-B balise la trajectoire des axones moteurs. Des expériences de perte et de gain de fonction ont montré que l’expression et l’organisation extracellulaire de col15a1b dépend des voies de signalisation Hedgehog et unplugged/MuSK respectivement. L’inhibition de l’expression de col15a1b provoque principalement un arrêt de croissance ou des erreurs de trajectoire des axones des motoneurones primaires et secondaires au niveau du point de sélection des trajectoires. Ce défaut d’innervation s’accompagne d’une atrophie musculaire et d’un comportement de nage anormal des embryons en réponse à une stimulation. La conservation de la synthénie, la similarité du patron d’expression de col15a1b et COL15A1 pourrait avoir une fonction identique chez l’humain et représenter un gène candidat pour les maladies neuromusculaires / The extracellular matrix (ECM) provides positional information to guide motoneuron axons toward their muscle target. Collagen XV is a basement membrane component encoded by two paralogs in zebrafish, col15a1a and col15a1b. My PhD project consisted in the characterization of the expression pattern of the col15a1b paralog during development and in the analysis of the in vivo function of this paralog in developing zebrafish embryos. Interestingly, we showed that col15a1b paralog is expressed by slow muscle precursors that represent an important source of the ECM path. Using newly generated antibodies to collagen XV-B (COLXV-B), we found that COLXV-B paves the trajectory of motor axons. Loss and gain of function experiments showed that col15a1b expression and extracellular organization depends respectively on Hedgehog and unplugged/MuSK signaling. Col15a1b knockdown weakly affected slow muscle differentiation but provoked primary and secondary motoneuron axons truncation or pathfinding errors at the choice point where pathway selection takes place. This resulted in muscle atrophy and compromised swimming behavior. Our data identified an unexpected role for COLXV-B as an unplugged/MuSK-dependent cue that paves the axonal motor path to guide the decision of axons at the choice point. The conserved syntheny, the broad expression pattern of col15a1b similar to COL15A1 ortholog and the conservation of the primary sequence of COLXV-B with the mammalian counterparts suggested that the human protein COLXV could display similar function and represent a gene candidate for neuromuscular disorders

Mycobacterium abscessus est une mycobactérie à croissance rapide qui a récemment émergé en tant que pathogène opportuniste, en particulier chez les patients atteints de mucoviscidose. Elle est naturellement résistante aux antibiotiques les plus couramment disponibles, limitant sérieusement les options thérapeutiques chez les patients infectés. Il apparaît donc urgent d’identifier et de caractériser de nouvelles cibles d’intérêt thérapeutique dans la lutte contre ce pathogène. Contrairement au variant lisse (S) de M. abscessus, caractérisé par une forte production de glycopeptidolipides (GPL), le variant rugueux (R) associé à une faible production de GPL est responsable des manifestations cliniques les plus sévères. Chez l’embryon de poisson zèbre, le variant R s’accompagne d’une virulence accrue avec formation de cordes mycobactériennes extracellulaires et d’abcès, engendrant une mortalité rapide des larves infectées. Les mécanismes moléculaires de la pathogénicité de M. abscessus demeurent toutefois très peu connus.Dans cette étude, nous avons identifié le gène MAB_4780, codant une déshydratase distincte du complexe HadABC impliqué dans la biosynthèse des acides mycoliques. Le gène MAB_4780, tout comme son homologue chez M. smegmatis, MSMEG_6754, ont été identifiés comme responsables de la résistance innée de ces deux espèces au thiacetazone (TAC), un agent antituberculeux de seconde intention. Nous avons inactivé le gène MAB_4780 dans le variant R de M. abscessus, ce qui a entraîné une modification de la composition en acides mycoliques, un défaut de formation des cordes mycobactériennes ainsi qu'un phénotype extrêmement atténué chez les embryons de poisson zèbre. L'atténuation in vivo du mutant MAB_4780 qui résulte très vraisemblablement de l’incapacité i) à former des cordes et ii) à inhiber la fusion phagolysosomale, s’accompagne d’une croissance intracellulaire diminuée. En outre, le mutant MAB_4780, tout comme le mutant de M. smegmatis dépourvu de MSMEG_6754, présente une croissance altérée dans l’amibe, qui représente un réservoir pour les mycobactéries environnementales. Ces résultats reflètent le rôle crucial de cette nouvelle déshydratase dans la survie de M. abscessus dans son environnement et dans l'établissement d'infections aiguës et létales. Par conséquent, cibler MAB_4780 pourrait représenter une stratégie particulièrement prometteuse pour contrôler les infections à M. abscessus. De futures études seront consacrées à l'identification d’inhibiteurs spécifiques de MAB_4780, grâce au développement d’un test d’activité et d’une structure cristalline de la protéine obtenue à très haute résolution.Nous avons également criblé contre M. abscessus une chimiothèque d’analogues structuraux du TAC, préalablement validés pour leur activité inhibitrice de la déshydratase HadABC de Mycobacterium tuberculosis. Trois d’entre eux ont montré une efficacité accrue d’un facteur 50 par rapport à la molécule parentale. La surexpression d’EthA, l’activateur du TAC, augmente la susceptibilité de M. abscessus à ces trois analogues. Ces résultats suggèrent que leur mode d'activation est similaire à celle de la TAC et indiquent que l'optimisation d’analogues du TAC pourrait conduire à une nouvelle génération de composés plus efficaces pour le traitement de M. abscessus. Des études de relations structure/activité sont envisagées afin d’améliorer l’efficacité et les propriétés pharmacologiques des analogues du TAC. / Mycobacterium abscessus, a rapidly-growing mycobacterium (RGM), has emerged in recent years as an important opportunistic pathogen especially in cystic fibrosis (CF) patients. M. abscessus is naturally resistant to most commonly available antibiotics, which seriously limits the treatment options, emphasizing the urgent need for more efficient drugs and innovative therapeutic strategies to combat M. abscessus infections. The M. abscessus rough (R) low-glycopeptidolipids (GPL) producer is responsible for more severe clinical infections than the smooth (S) high-GPL producer, and is associated with increased virulence in zebrafish, including the formation of massive serpentine cords, abscesses, and rapid larval death. However, the molecular mechanisms responsible for the pathogenicity of the R strains remain elusive.Herein, we identified a novel gene, MAB_4780, encoding a dehydratase distinct from the HadABC complex, known to participate in mycolic acid biosynthesis. Both MAB_4780 and its homologue in Mycobacterium smegmatis, MSMEG_6754, are responsible for the innate resistance in these species to thiacetazone (TAC), a second-line antitubercular drug. The successful deletion of MABS_4780 in the R variant of M. abscessus resulted in an altered mycolic acid composition, a pronounced defect in cording, and an extremely attenuated phenotype in zebrafish embryos. The in vivo attenuation of the MAB_4780 mutant results from both the deficiency in cord formation and the impaired intracellular growth, presumably due to limited inhibition of the phagolysosomal fusion events. In addition, similarly to the MSMEG_6754 deletion mutant, the MAB_4780 mutant showed impaired growth in amoeba, which represents a possible reservoir for environmental mycobacteria. These results reflect the critical role of this new dehydratase in the survival of M. abscessus in its environmental hosts and its importance in establishing acute and lethal infections. Therefore, targeting MAB_4780 may represent a promising strategy to control M. abscessus infections. Future work will focus on identifying specific inhibitors targeting MAB_4780, which could greatly benefit from the combination of our dehydratase assay and our high-resolution crystal structure of the protein.We have also screened against M. abscessus a library of TAC analogues, previously validated for their inhibitory effects against the Mycobacterium tuberculosis HadABC dehydratase. Among these compounds, three exhibited a 50-fold increased potency as compared to TAC. Overexpression of EthA, known as the activator of TAC, increased the susceptibility of M. abscesuss to the three analogues, suggesting that that their mode of activation is similar to that of TAC. Overall, these data indicate that optimizing the TAC scaffold may lead to more efficient compounds against M. abscessus. Additional structure/activity relationship studies are required to further improve the efficacy and pharmacological properties of TAC analogues.

Les perturbateurs endocriniens (PE) posent des risques pour la santé Humaine et pour la faune. L’utilisation de tests biologiques basés sur des mécanismes d’action spécifiques permet de caractériser le potentiel PE des substances chimiques dans le cadre de l'évaluation toxicologique, mais les capacités de biotransformation de ces modèles sont rarement prises en compte. Or, le métabolisme conditionne le devenir des xénobiotiques (détoxication vs. bioactivation) et donc in fine l'activité biologique mesurée. Dans ce travail, le devenir de deux contaminants œstrogéniques émergents (benzophénone-2, bisphénol S) a été comparé dans de nouveaux modèles in vitro et in vivo de poisson zèbre (cellules ZELH-zfERs, larve transgénique cyp19a1b-GFP) et des lignées humaines. Nos résultats démontrent que les modèles de poissons zèbres sont métaboliquement compétents et soulignent leur pertinence dans une approche intégrée in vivo/in vitro pour le criblage de l'activité PE des substances chimiques. / Endocrine disruptors (ED) are potentially harmful for Human beings and for wildlife species. Species-specific mechanism-based screening tests nowadays allow characterizing the ED potency of chemicals in the context of their toxicological assessment. However, the biotransformation capabilities of the biological models used are seldom taken into consideration, despite they ultimately condition the fate of the tested xenobiotics (detoxification vs. bioactivation), and, consequently, the biological response. In this work, we examined the fate of two emerging ED (benzophenone-2, bisphenol S) using novel in vitro and in vivo zebrafish models (ZELH-zfERs cells and cyp19a1b-GFP transgenic larvae) as well as human cell lines. Our results demonstrate that the zebrafish models are metabolically competent, and underline their relevance, accuracy and usefulness in an integrated in vivo/in vitro screening approach designed to assess ED's biological activity

L'un des principaux objectifs des neurosciences est de comprendre comment les fonctions cognitives sont codées par la dynamique des grands réseaux neuronaux. L'étude de la perception sensorielle a principalement été axée sur l'enregistrement de l'activité neuronale induites par des stimulations sensorielles. Une approche alternative réside dans l'utilisation des illusions sensorielles. Ainsi, la perception sensorielle peut avoir lieu en l'absence de stimulation physique externe. Nous avons utilisé une approche multidisciplinaire combinant l'imagerie calcique à deux photons, le comportement moteur et l'optogénétique. Nous avons pu montrerque la larve de poisson zèbre est capable de percevoir " l'effet après mouvement " (EAM). En utilisant l'optogenetique (halorhodopsine) nous avons été capables d'inhiber les mouvementes oculaires pendant la présentation du stimulus conditionné (SC). Nous avons montré que les mouvements des yeux lors du SC ne sont pas impératifs pour l'induction de l'EAM, ce qui suggère que l'EAM n'est probablement pas d'origine musculaire. En utilisant la microscopie à deux photons nous avons montré une habituation de neurones tectales au cours de l'EAM. Cette habituation se dégrade selon une échelle de temps qui correspond au comportement oculo-moteur, lors de l'EAM. En revanche, les cellules ganglionnaires de la rétine ne sont pas habitués. Ceci indique que le toit optique, mais pas la rétine, joue un rôle prépondérant dans l'induction du EAM. Cette approche multidisciplinaire permet de comprendre de façon plus approfondie les mécanismes neuronaux sous-jacents au EAM, et de spéculer sur le corrélat neuronal de la perception du mouvement. / One of the main goals in neuroscience is to understand how cognitive functions are encoded by the dynamics of large neuronal networks. The main stream to study sensory perception has mainly focused on sensory stimulation and neuronal recordings of the induced neural responses. An alternative approach is the use of sensory illusions, in which sensory perception take place in the absence of physical external stimulation. For this purpose, we have used a multidisciplinary approach combining the zebrafish larva as the experimental model, two-photon calcium imaging, motor behavior and optogenetics. We showed that the zebrafish larva is capable of perceiving motion after-effect (MAE). Using optogenetics (halorhodopsin) to prevent eye movements during the presentation of the conditioning stimulus (CS), we showed that pursuit eye movements during CS are not imperative for the induction of MAE, suggesting that neither muscular fatigue nor eye-muscle proprioception feedback play a role in the generation of MAE. Furthermore, we used two-photon microscopy in combination with transgenic fish expressing GcaMP3 . We first observed that during MAE, neurons in the optic tectum (the largest and highest visual brain center of the larva) were strongly habituated. This habituation later decayed with a temporal scale that matched that of the optomotor MAE-like behavior. In contrast, no significant habituation was observed in the retina, Thus, we suggested that the optic tectum but not the retina plays a role in generation of MAE. Our approach contributed to a more comprehensive view of the neuronal mechanisms underlying MAE, and shed light on the neuronal correlate of motion perception

Les muscles sont des structures très organisées qui nous permettent d’effectuer un grand nombre de fonctions. Ils sont constitués de cellules musculaires mais aussi de tissus conjonctifs qui comprennent à la fois des cellules et la matrice extracellulaire. Les interactions entre les cellules musculaires et le tissu conjonctif sont cruciales pour la physiologie du muscle. Le collagène VI (COLVI) est une molécule hétérotrimérique ubiquitaire située dans les tissus conjonctifs, qui est impliquée dans un grand nombre de processus biologiques. Les trimères de COLVI sont composés de 2 chaines dites “courtes” et d’une chaine “longue”. Chez les mammifères, il existe à ce jour, 6 chaines COLVI (deux courtes (α1-2(VI) et 4 chaines longues (α3-6(VI)). Peu de choses sont encore connues à propos de l’assemblage des chaines les plus récemment décrites α4-6(VI) avec les chaines courtes ainsi qu’une la potentielle compensation entre les différentes chaines longues. De plus, chez l’homme, un déficit en α1-3(VI) du fait de mutations dans les gènes correspondants COL6A1-3 conduit à un spectre de maladies neuromusculaires appelées myopathies liées au COLVI. Pendant ma thèse, je me suis intéressée au COLVI durant le développement du poisson-zèbre, un modèle pertinent pour l’étude de maladies neuromusculaires. Dans la première partie de mon travail, j’ai identifié 2 orthologues des chaines α4-6(VI) chez le poisson-zèbre grâce à des études bio-informatiques. Du fait de leur plus grande homologie avec la chaine α4(VI) murine, nous les avons nommés col6a4a et col6a4b. Pour mieux comprendre les rôles des protéines correspondantes, j’ai créé des embryons de poissons-zèbres déficients en COLVI en utilisant l’approche transitoire par oligo morpholino antisens (MOs). Nous avons dessiné des MOs ciblant des sites d’épissage des pré-messagers col6a2, col6a4a et col6a4b, provoquant un saut d’exon et conduisant à un stop prématuré (PTC). J’ai observé une forte diminution des transcrits ciblés. Tous les embryons injectés (morphants) ont présenté des phénotypes morphologiques macroscopiques qui ont conduit à des défauts fonctionnels. Ces phénotypes ont été confirmés au niveau ultra-structural par microscopie électronique. Toutefois, l’analyse de la croissance des motoneurones a permis de mettre en évidence des différences entre ces morphants. Par la suite, j’ai voulu créer deux types de lignées transgéniques, pour pouvoir à la fois étudier le déficit en COLVI à plus long terme (grâce à l’utilisation de Zinc Finger Nucleases) et tester des approches de cribles pharmacologiques (lignée transgénique col6a2 contenant un PTC, fusionné à la GFP). J’ai effectué les clonages nécessaires à l’obtention des différentes constructions, et ces dernières ont été testées in vitro pour validation, lorsque cela était possible. Malheureusement, du fait des forts taux de mortalité in vivo dans les deux cas, nous avons dû nous résoudre à arrêter ces projets. En parallèle, ma connaissance du modèle poisson-zèbre m’a donné l’opportunité, dans le cadre d’une collaboration avec l’équipe de Denis Furling, d’aborder une autre problématique. Ce groupe, qui travaille sur la Dystrophie Myotonique de type 1 (DM1), s’est intéressé à la réexpression d’une isoforme fœtale de la dystrophine retrouvée chez les patients DM1 et à sa possible implication dans la pathologie. L’isoforme fœtale diffère de la forme adulte notamment par l’exclusion de l’exon 78, conduisant à un changement de cadre de lecture et un changement dans la partie 3’ de l’ARN de la dystrophine. Nous avons montré que le maintien de l’isoforme fœtale de la dystrophine était délétère pendant le développement du poisson-zèbre, puisque ces embryons ont présenté un phénotype macroscopique dépendant de la dose de MO injectée ainsi que des troubles de la mobilité. / Muscles are highly organized structures that allow us to perform many functions. They are made from muscular cells but also surrounding tissues that comprise both cells and extracellular matrix. The interactions between them are crucial for the muscle physiology. Collagen VI (COLVI) is a heterotrimeric protein, ubiquitously expressed in connective tissues. It plays multiple biological roles in the maintenance of structural integrity, cellular adhesion, migration and survival. COLVI trimers are formed by the assembly of 2 “short” chains and 1 “long” chain. To date, six COLVI chains are recognized in mammalians with 2 short (α1-2(VI)) and 3 long (α3-6(VI)) chains. Little is known regarding the possible assembly of the newly characterized α4-6(VI) polypeptides with the short chains, and a putative functional compensation between the different long chains. Furthermore, in humans, deficiency in α1-3(VI) due to mutations in the COL6A1-3 genes causes a heterogeneous group of neuromuscular disorders collectively termed COLVI-myopathies. During my Ph.D, I got interested in COLVI during the development of zebrafish, a relevant model of neuromuscular disorders. In the first part of my work, I identified 2 orthologs of the α4-6(VI) chains in zebrafish thanks to bio-informatics studies. In light of their stronger homology with the mammalian α4(VI) chain, we named the genes encoding the novel chains col6a4a and col6a4b. To further unveil the roles of the corresponding proteins, we created COLVI deficient zebrafish embryos using a morpholino antisense oligonucleotides approach (MO) . We chose to design MOs that block splicing of col6a2, col6a4a and col6a4b, thereby creating premature termination codons. As expected, the targeted transcripts levels were drastically reduced, likely due to degradation by the nonsense mediated RNA decay. All morphant embryos presented macroscopic and morphologic phenotypes that overall resulted in functional muscle defects: altered muscle structure detected by birefringence analysis and impaired motility upon touch-evoked escape test. These alterations were confirmed at the ultra-structural level by electron microscopy. Nevertheless, some phenotypical specificities were uncovered between the different col6a2, col6a4a and col6a4b morphants, with the discovery of axon outgrowth defects. In a second part, we wanted to create stable zebrafish lines to study COLVI deficiency at later stages using Zinc Finger Nucleases (ZFN) and to be able to carry out pharmacological screenings with a transgenic line containing col6a2 with a premature codon (PTC) fused to the GFP. I performed clonings to obtain the different constructs. When possible, constructs were tested in vitro. Unfortunately, due to high mortality in vivo in both cases, we had to interrupt these projects. In parallel, my knowledge of the zebrafish model gave me the opportunity to be part of another project, in collaboration with the team of Denis Furling...

L'apoptose est un processus cellulaire fondamental pour l'homéostasie tissulaire. Ce type de mort cellulaire est sous le contrôle des protéines de la famille Bcl-2 qui régulent la perméabilité de la membrane externe de la mitochondrie. Cependant, au-delà de leur rôle dans le contrôle de l'apoptose, les protéines de la famille Bcl-2 peuvent intervenir dans d'autres processus tels que le cycle cellulaire ou le métabolisme. Au sein du laboratoire, nous nous intéressons tout particulièrement aux rôles non-apoptotiques des protéines Bcl-2 au cours du développement embryonnaire. Grâce à l'utilisation du poisson zèbre, nous avons pu montrer que les protéines de la famille Bcl-2 contrôlent différents processus au cours du développement grâce à leur capacité à réguler l'homéostasie calcique. En effet, nous avons montré que la protéine anti-apoptotique Nrz participe au remodelage du cytosquelette d'actine au cours de l'épibolie en régulant la concentration de calcium cytosolique par son interaction avec le récepteur à l'IP3 (IP3R). Nous avons de plus pu montrer que Nrz diminue la sortie de calcium du réticulum endoplasmique en inhibant la fixation de l'IP3 sur son récepteur. Nous avons également identifié un nouveau membre pro-apoptotique de la famille Bcl-2, Bclwav, spécifiquement exprimée chez les poissons et le xénope. Cette protéine participe à la régulation de l'homéostasie calcique mitochondriale en interagissant avec VDAC. Nous avons de plus montré que cette activité est essentielle pour les mouvements de convergence et d'extension au cours du développement embryonnaire précoce du poisson zèbre / Apoptosis is a key cellular process for tissue homeostasis. Apoptotic cell death is under control of Bcl-2 family proteins which regulate outer mitochondrial membrane permeability. However, beyond their role in apoptosis, Bcl-2 family proteins are also involved in other cellular processes such as cell cycle or metabolism. In our laboratory we are interested in non-apoptotic functions of Bcl-2 family proteins in embryonic development. Using zebrafish model we have shown that Bcl-2 proteins control different processes during early development thanks to their ability to regulate calcium homeostasis. Indeed, we have shown that the anti-apoptotic protein Nrz participates in actin cytoskeleton remodeling during epiboly by regulating cytosolic calcium concentration via an interaction with the IP3 receptor (IP3R). We have also demonstrated that Nrz decreases calcium release from the endoplasmic reticulum by inhibiting IP3 fixation on its receptor. We have furthermore identified a new pro-apoptotic member of Bcl-2 family, Bcl-wav which is expressed only in fish and frogs. This protein regulates mitochondrial calcium homeostasis by interacting with VDAC. We have moreover shown that this activity is essential for convergence and extension movements during early zebrafish development

La mise en place de l’asymétrie droite/gauche (D/G) est fondamentale au développement normal des organismes bilatériens. Cependant, les mécanismes essentiels à la cassure de symétrie ainsi que leur conservation au cours de l’évolution sont encore mal compris. Chez le poisson-zèbre l’organisateur de l’asymétrie D/G ou vésicule de Kupffer (KV), consiste en une sphère remplie d’un liquide mis en mouvement de façon circulaire antihoraire pas le battement de cils motiles. Nous avons observé dans la lumière de la KV la présence de vésicules positives pour la protéine ESCRT Chmp1b. De plus, une diminution du nombre de ces vésicules est associée à l’apparition de défauts de latéralité, ce qui suggère un rôle potentiel de ces vésicules dans la mise en place de l’asymétrie D/G. Nous montrons que malgré sa forme circulaire, le flux de la KV peut transporter de façon asymétrique des vésicules. Deuxièmement, nous avons également montré que la fonction de la protéine Myo1D, impliquée dans l’asymétrie D/G chez la drosophile, est conservée chez le poisson-zèbre. La perte de Myo1D a un impact sur les signaux les plus précoces d’initialisation de la latéralité. De plus, Myo1D interagit de façon fonctionnelle avec la protéine Vangl2, un composant de la voie PCP contrôlant le positionnement et l’orientation des cils de la KV. Ces découvertes établissent ainsi que le système Myo1D représente une machinerie conservée au cours de l’évolution pour l’établissement d’une latéralité chez les animaux. / The proper establishment of Left/Right (L/R) asymmetry is fundamental to normal development in bilaterians. However, the initial mechanisms involved in symmetry breaking and their conservation throughout the course of evolution remain poorly understood. In zebrafish, the L/R organizer region or Kupffer’s vesicle (KV) consists as a fluid filled cavity, whose circular counterclockwise motion is driven by the motion of motile cilia. We have observed the presence of vesicles containing the ESCRT component Chmp1b in the lumen of the KV. Hence, the diminution of their number is associated with laterality defect, suggesting a potential role for those vesicles in L/R asymmetry establishment. We also participate to show that in spite of its overall circular geometry, the KV flow can ensure the directional transport of vesicles in the organ lumen. Secondly, we are also showing that the function of the Myo1D protein, implicated in L/R asymmetry establishment in drosophila, is conserved in zebrafish. The loss of Myo1D leads to an impaired early lateralization. Moreover, Myo1D functionally interact with the protein Vangl2, a component of the PCP pathway, which controls the tilt and positioning of KV cilia. These findings are supportive of a mechanism according to which Myo1D system represents a conserved molecular machinery essential for L/R asymmetry establishment in bilaterians.

Le gène INTS11 est une sous-unité catalytique du complexe Integrator qui joue un rôle central dans le traitement de divers ARN naissants. Récemment, des patients présentant des mutations de perte de fonction dans le gène INTS11 ont été signalés comme ayant des problèmes neurodéveloppementaux graves, des problèmes ataxiques et des retards de développement globaux. À ce jour, aucune mutation dans INTS11 n'a été liée à des maladies humaines, et aucune preuve ne soutient leur rôle dans des problèmes neurodéveloppementaux. Par conséquent, nous avons développé un modèle INTS11 knock-out (KO) F0 CRISPRant chez le poisson-zèbre pour caractériser fonctionnellement les mutations de perte de fonction de ce gène in vivo. Nos larves INTS11-KO présentent une accumulation accrue de snARN mal traités, confirmant la perturbation de la fonction du gène. De plus, les larves INTS11-KO meurent prématurément à 14 jours et présentent un phénotype comportemental aberrant, similaire à d'autres modèles génétiques de poisson-zèbre des troubles neurodéveloppementaux. Aussi, les larves INTS11-KO présentent une réduction de la taille du cerveau avec une réduction du contenu neuronal. Enfin, nos résultats d'immunomarquage ont révélé une réduction de la taille du cervelet chez les larves INTS11-KO. Dans l'ensemble, ces données soutiennent le rôle d'INTS11 dans le développement cérébral et sont cohérentes avec les retards neurodéveloppementaux décrits chez les patients présentant des mutations délétères dans ce gène. Notre étude montre comment des organismes modèles simples tels que le poisson-zèbre peuvent aider à caractériser l'étiologie génétique des troubles génétiques. Les résultats de nos recherches pourraient contribuer à des diagnostics plus précis et ouvrir la voie à la découverte de mécanismes pathogènes clés qui pourraient être exploités pour le développement de traitements pour les patients présentant des mutations dans INTS11. / The INTS11 gene is a catalytic subunit of the Integrator complex that plays a central role in processing various nascent RNAs. Recently, patients with loss-of-function mutations in the INTS11 gene have been reported to have severe neurodevelopmental issues, ataxic problems, and global developmental delays. To date, mutations in INTS11 have not been linked to human diseases, and no evidence supports their role in neurodevelopmental problems. Therefore, we developed an ints11 F0 CRISPRant knock-out (KO) model in zebrafish to functionally characterize loss-of-function mutations in this gene in vivo. Our ints11-KO larvae exhibited an increased accumulation of unprocessed snRNAs, confirming the disruption of the ints11 function. Moreover, ints11-KO larvae die prematurely by 14 days of age and display an aberrant behavioural phenotype, similar to other zebrafish genetic models of neurodevelopmental disorders. Furthermore, ints11-KO larvae show reduced brain size with reduced neuronal content. Finally, immunostaining results revealed a reduction in cerebellum size in our ints11-KO. Altogether, these data support the role of INTS11 in brain development and are consistent with the neurodevelopment delays described in patients with deleterious mutations in this gene. Our study shows how simple model organisms like zebrafish can help characterize the genetic etiology of genetic disorders. The results from our research could aid in more accurate diagnoses and open the path to unveiling key pathogenic mechanisms that could be leveraged for the development of treatment for patients with mutations in INTS11.

La voie de la polarité planaire cellulaire (PCP), aussi connue sous le nom de la voie non-canonique du Frizzled/Dishevelled, contrôle le processus morphogénétique de l'extension convergente (CE) qui est essentiel pour la gastrulation et la formation du tube neural pendant l'embryogenèse. La signalisation du PCP a été récemment associée avec des anomalies du tube neural (ATN) dans des modèles animaux et chez l'humain. Prickle1 est une protéine centrale de la voie PCP, exprimée dans la ligne primitive et le mésoderme pendant l'embryogenèse de la souris. La perte ou le gain de fonction de Prickle1 mène à des mouvements de CE fautifs chez le poisson zèbre et la grenouille. PRICKLE1 interagit directement avec deux autres membres de la voie PCP, Dishevelled et Strabismus/Vang. Dans notre étude, nous avons investigué le rôle de PRICKLE1 dans l'étiologie des ATN dans une cohorte de 810 patients par le re-séquençage de son cadre de lecture et des jonctions exon-intron. Le potentiel pathogénique des mutations ainsi identifiées a été évalué par des méthodes bioinformatiques, suivi par une validation fonctionnelle in vivo dans un système poisson zèbre. Nous avons identifié dans notre cohorte un total de 9 nouvelles mutations dont sept: p.Ile69Thr, p.Asn81His, p.Thr275Met, p.Arg682Cys et p.Ser739Phe, p.Val550Met et p.Asp771Asn qui affectent des acides aminés conservés. Ces mutations ont été prédites in silico d’affecter la fonction de la protéine et sont absentes dans une large cohorte de contrôles de même origine ethnique. La co-injection de ces variantes avec le gène prickle1a de type sauvage chez l’embryon de poisson zèbre a démontré qu’une mutation, p.Arg682Cys, modifie dans un sens négatif le phénotype du défaut de la CE produit par pk1 de type sauvage. Notre étude démontre que PK1 peut agir comme facteur prédisposant pour les ATN chez l’humain et élargit encore plus nos connaissances sur le rôle des gènes de la PCP dans la pathogenèse de ces malformations. / The planar cell polarity pathway (PCP) or the non-canonical Frizzled/Dishevelled pathway controls the morphogenetic process of convergent extension (CE) that is essential during embryogenesis for gastrulation and neural tube formation. Recently, PCP signalling was associated with neural tube defects (NTD) in humans and animal models. The core PCP protein, Prickle1, is expressed in the primitive streak and mesoderm during mouse embryogenesis. Both gain and loss of function of Prickle1 cause faulty CE movements in zebrafish and the frog. PRICKLE1 physically interacts with two other core PCP members, Dishevelled and Strabismus/Vang. In the present study we investigated the role of PRICKLE1 in the aetiology of NTDs in a large cohort of 810 patients through resequencing of its open reading frame and exon-intron junctions. The pathogenicity of the identified mutations was assessed through bioinformatics methods followed by a functional validation in a zebrafish system, in vivo. We identified in our cohort a total of nine novel mutations, of which seven affected conserved amino acids: p.Ile69Thr, p.Asn81His, p.Thr275Met, p.Arg682Cys, p.Ser739Phe, p.Val550Met and p.Asp771As. These mutations were predicted to affect the function of the protein in silico and were absent in a large cohort of ethnically-matched controls. Co-injection of these variants with the wild type pk1 in zebrafish oocytes revealed that one mutation, p.Arg682Cys, antagonized the CE phenotype induced by the wild-type zebrafish prickle1a in a dominant fashion. Our study demonstrates that PRICKLE1 can represent a predisposing factor for human NTDs and further expands our knowledge on the role that PCP genes in the pathogenesis of these malformations.

La jonction myotendineuse (JMT) est une interface spécialisée dans la transmission des forces entre le muscle et le tendon. Le collagène XXII (COLXXII) est un nouveau composant de cette jonction (Koch et al., 2004). COLXXII fait partie de la sous-famille des FACITs (Fibrils Associated Collagen with Interrupted Triple helix) qui se caractérisent par leur capacité à s’associer aux collagènes fibrillaires pour former des réseaux protéiques. La fonction de ce nouveau composant de la JMT n’est pas connue. C’est pourquoi nous avons décidé de réaliser une perte de fonction chez le poisson zèbre en utilisant la stratégie anti-sens morpholinos et d’en étudier le phénotype par différentes techniques. Chez l’embryon, le COLXXII est exprimé aux extrémités des fibres musculaires au niveau de leur ancrage sur le myosepte (structure équivalente au tendon des mammifères) pour être déposé à la JMT. Son expression est régulée par des membres de la famille des FGF, probablement FGF8. L’absence de COLXXII conduit à une perte des capacités contractiles du muscle et au détachement et à la rétractation progressive des fibres musculaires, causés par une rupture de la JMT qui s’opère entre la lame basale des fibres musculaires et la matrice tendineuse. Le morphotype induit par l’injection de morpholino COLXXII phénocopie les mutants sapje (mutant dystrophine) et candyfloss (mutation de la chaîne α2 des laminines) indiquant que COLXXII permet un lien structural entre le muscle et le tendon. Nos résultats montrent que COLXXII joue un rôle crucial dans le développement et la fonction de la JMT et représente un nouveau gène candidat pour les dystrophies musculaires. / The myotendinous junction (MTJ) is a specialized structure that transmits muscle contractile forces to tendon. Collagen XXII (COLXXII) is a novel component of MTJ (Koch et al., 2004). It belongs to the FACITs (Fibrils Associated Collagen with Interrupted Triple helix) subset of the collagen superfamily that is characterized by their capacity to mediate protein-protein interactions. The in vivo role of COLXXII has not been elucidated. Therefore, we decided to analyze its function in developing zebrafish using the morpholino-based knock-down strategy. We showed that its transcripts are exclusively expressed at the extremities of muscle fibers close to myoseptal tendons and the protein is deposited at the MTJ. The onset of COLXXII expression depends on FGF signaling, probably FGF8. Using different methods, we showed that loss of COLXXII induces morphofunctional alterations of muscle/tendon development and muscle weakness. Progressive muscle fiber detachment and retraction are observed in morphants that result from MTJ failure occuring at the muscle basement membrane/myosepta extracellular matrix side. The morphotype of the MO22-injected embryos is reminiscent to the sapje (dystrophin mutant) and candyfloss (laminin α2 chain mutation) mutant phenotypes indicating that COLXXII provides a molecular link between muscle and tendons. Our results suggest that COLXXII plays a crucial role in MTJ development and function and represents a novel candidate gene for muscular dystrophies.