The use of molecular biology as a means to advance agriculture has proven beneficial in many fields. However, the development lentiviral vectors that utilize a livestock promoter to express short hairpin RNA (shRNA) has been limited to date. The goal of this research project was to develop and characterize lentiviral bovine Pol III mir30 shRNA expression vectors for future use in livestock research. The bovine Pol III promoter (7sk, U6-2, or H1) was inserted directly upstream of a mir30 shRNA expression sequence in the lentiviral vector pNef-GT. A transient luciferase knockdown assay in human embryonic kidney (HEK) 293T cells was used to compare the functionality of these vectors. The bPol III mir30 shRNA expression vector was co-transfected with the pGL3 luciferase expression vector and the renilla expression vector pLB at a ratio of 5:10:1 respectively. The vectors were allowed 48 hrs to produce their respective products before luciferase activity was measured with the Stop-n-Glo Assay (Promega). Each bPol III promoter was able to express a functional shRNA resulting in a reduction of luciferase activity greater than 68 percent. The bH1 and bU6-2 Luc shRNA vectors were the most effective vectors when transfected with >76 percent (p-value <0.05) reduced luciferase activity. To confirm that these promoters were functional after integration into a bovine genome, recombinant lentivirus was made from these vectors. These particles were then used to transduce a bovine kidney (MDBK) cell line that expressed luciferase. After transduction, transgenic cells were selected by the addition of the antibiotic, Geneticin to the culture media until a population of 100 percent bPol III expression cells were observed for two passages and luciferase activity was measured. The 7sk promoter was the most effective bPol III promoter that reduced luciferase activity in these cells by 72 percent (p-value <0.05), while the bU6-2 and bH1 were moderately effective at reducing luciferase levels (37 percent, 46 percent respectively). These experiments were the first to quantify the bovine Pol III promoter function after integration into a bovine genome. While variability was observed, for livestock based research, the b7sk lentiviral vector appears to be the best choice to express a shRNA from the genome of a bovine genome.

Les ARN polymérases sont des acteurs indispensables de la transcription. Chez les eucaryotes il existe trois ARN polymérases (I, II et III). La ARN polymérase III (Pol III) possède 17 sous-unités, dont une qui existe sous deux formes: RPC32α et RPC32β. Seulement une des deux formes peut être intégrée dans la Pol III, créant ainsi deux polymérases différentes Pol IIIα et Pol IIIβ. Alors que RPC32β est présent dans les cellules somatiques, RPC32α est exprimé surtout dans des cellules souches et des cellules tumorales. Aujourd’hui rien n’est connu sur leurs rôles respectifs. Le cancer du sein est un problème majeur de santé publique car c’est le cancer féminin le plus fréquent. Plusieurs types de cancer du sein sont identifiés selon la présence ou absence de certains récepteurs hormonaux. Des cancers qui testent négative pour le récepteur d’oestrogène et de progestérone et qui ne surexpriment pas le récepteur pour les facteurs de croissance épidermiques humains 2 (HER2) sont appelés triple-négative. Ils ont un pronostique peu favorable, due à l’agressivité de ce type de cancer et un manque de thérapie cibles. Pour étudier le rôle de RPC32α il fallait identifier un model tumorale. En collaboration avec Jean-Paul Feugeas (INSERM UMR 1098) une étude transcriptomique a été fait sur 2627 échantillons cliniques de tissus de sein. L’étude montre que RPC32α est surexprimé dans les cancers triple-négative, alors que son homologue RPC32β est surexprimé dans les tissues normaux. Une analyse sur six lignées de cancer du sein et une ligné non-tumorale ont pu confirmer les résultats de l’analyse transcriptomique. Le modèle de cancer du sein a donc été validé. Une caractérisation des différentes lignées de cancer du sein a démontré que d’autres sousunités de la Pol III n’étaient pas surexprimées dans les cancers triple-négative. La surexpression de RPC32α n’était donc pas une conséquence d’une hyperactivité de la Pol III. Une analyse des transcrits synthétisé par la Pol III a montré que en générale les transcrits de la Pol III étaient plus fortement exprimé dans les cancers triple-négative que dans d’autres cancers. Afin d’étudier l’implication de RPC32α dans les phénomènes de tumorisation, plusieurs lignées cellulaires dépourvues de RPC32alpha ont été créé utilisant la technique CRISPRCAS9. L’absence de RPC32α n’a pas induit une augmentation de transcription ni de l’ARN de 4 RPC32α, ni de celle de RPC32β. Il n’existe donc pas de boucle de rétroaction pour RPC32α et les deux homologues ne sont pas co-régulés. Plusieurs, mais pas tous les transcrits synthétisé par la Pol III ont une expression fortement baissé dans les lignées mutants. Le fait que pas tous les transcrits ne soit affectés par la perte de RPC32α, indique qu’il existe une spécificité de transcription pour Pol IIIα et Pol IIIβ. Les cellules des linges mutants ne présentaient pas de phénotype différent des cellules mères et la croissance était la même dans toutes les lignées. Par contre les tests de croissance en agar-mou ont révélé que les lignées mutants formaient 85% de moins de colonies, indiquant que RPC32α est nécessaire pour la croissance tumorigénique in vitro. Pour tester l’effet de la perte de RPC32α sur la croissance tumorigénique in vivo, des cellules mutants et des cellules mères ont été injecté dans des souris. Les souris greffées avec des cellules mutantes montrent un départ de tumorisation retardé. Au bout de six semaines elles avaient de tumeurs deux fois plus petit que les souris avec des cellules mères. Après ablation de la tumeur primaire, les souris ont été surveillées pour l’apparition de métastases. Quatre semaines plus tard les souris greffées avec des cellules mutantes avaient 100 fois moins de métastases que les souris contrôles. Ces résultats montrent que RPC32α est nécessaire pour la tumorisation in vitro et in vivo. La protéine semble surtout jouer un rôle dans la formation des métastases, qui sont un des problèmes majeurs dans le traitement des cancers. / The RNA polymerases are key players of transcription. Eukaryotes have three RNA polymerases (I, II and III). The RNA polymerase III (Pol III) has 17 subunits, one of which exists in two alternative forms: RPC32α and RPC32β. Only one of the two forms can be integrated into the enzymes, thus generating either Pol IIIα or Pol IIIβ. While RPC32β is found in all somatic cells, RPC32α is expressed in stem cells and tumor cells. To date nothing is known of their respective roles. Breast cancer is one of the major public health problems, as it is the most common cancer in women. Several types of breast cancers are distinguished, according to the presence or absence of hormonal receptors. Cancers that test negative for estrogen receptors, progesterone receptors and that do not overexpress the human epidermal growth factor receptor 2, are called triple-negative breast cancers. They tend to have a poor prognosis, due to the aggressive nature of the cancer and the lack of targeted therapies. To study the role of RPC32α, a tumor model needed to be identified. In collaboration with Jean-Paul Feugeas (INSERM UMR 1098) a transcriptomic study was performed on 2627 clinical breast tissue samples. The study showed that RPC32α was overexpressed in triplenegative breast cancer, whereas RPC32β was overexpressed in normal tissue. A study on six breast cancer cell lines and one non-tumorigenic line confirmed the results of the transcriptomic study. The breast cancer model was thus validated. A characterization of different breast cancer cell lines showed that other Pol III subunits were not overexpressed in triple-negative breast cancer. The overexpression of RPC32α was therefore not a mere consequence of a Pol III hyperactivity. An analysis of the transcripts synthesized by Pol III showed that overall the Pol III transcript levels were elevated in triplenegative breast cancer compared to other breast cancer subtypes. In order to study the role of RPC32α in tumorigenesis, several RPC32α knock-out cell lines were created using CRISPR-Cas9. The loss of RPC32α did not induce an increase in transcription of the RNAs of RPC32α or RPC32β. This shows that no feed-back loop exists for RPC32α and that the two homologues are not co-regulated. Various Pol III transcripts showed decreased expression levels in the knock-out cell lines. Yet not all transcripts were reduced in the absence of RPC32α. This indicates that some sort of transcription specificity must exist for Pol IIIα and Pol IIIβ. The knock-out cell lines did not show any alterations in their phenotype or growth rates. However, in soft agar assays the knock-out cell lines produced 85% less colonies than the mother cell line. This proves that RPC32α is necessary for tumorigenic growth in vitro. To find out if RPC32α was also necessary for tumorigenic growth in vivo, knock-out and wild type cells were injected into mice. The mice grafted with knock-out cells showed a slowed onset of tumor growth. After six weeks, the mice injected with knock-out cells had tumors half the size of the mice injected with wild type cells. The primary tumor was ablated and mice were tracked for metastasis. Four weeks later, mice injected with RPC32α knock-out cells had 100 times less metastasis than the control group. These results show that RPC32α is necessary for tumorigenic growth in vitro and in vivo. The protein seems also to be implicated in the formation of metastasis, which are one of the greatest problems in cancer treatment today.

En 2010, Haurie et al. ont identifié deux isoformes différentes de la Pol III humaine : Pol IIIα, quin’est présente que dans les cellules souches embryonnaires et dans celles tumorales, et Pol IIIβ,exprimée constitutivement.L’expression ectopique de Pol IIIα affecte profondément l’équilibre de cellules différentiées, jusqu’àen induire la transformation oncogénique. Ceci n’est pas observé dans le cas de l’expression ectopiquede Pol IIIβ.A fin de définir les causes moléculaires de la transformation cellulaire induite par Pol IIIα, nousavons décidé d’étudier son transcriptome en comparaison avec celui de Pol IIIβ, à la recherche desgènes qui pourraient soutenir l’oncogenèse observée. Dans notre étude, nous avons adopté latechnique du ChIP-Seq, une approche innovatrice et puissante qui permet de cartographier tous lessites de liaison d’une protéine sur le génome. Elle comporte la purification de la protéine d’intérêtcomplexe avec ces cibles génomiques et le séquençage de ces dernières de manière massive.Le premier but de cette thèse a été représenté par la mise a point d’un protocole de ChIP-Seqoptimisé spécifiquement pour Pol IIIα et Pol IIIβ. Une fois obtenue une préparation de chromatine dequalité adéquate aux standards du ChIP-Seq, nous avons effectué les séquençages massifs etcartographié sur le génome tous les loci contactés par les deux isoformes de polymérase.De cette manière, nous avons identifié 1287 loci occupés par Pol IIIα et 1281 par Pol IIIβ. Les deuxpolymérases se co-localisent sur la plupart de ces sites, mais montrent aussi une occupationpréférentielle et spécifique sur une fraction de loci Pol III. Cette disproportion pourrait contribuer auphénomène cellulaire observé par Haurie et al.Le manuscrit de thèse détaille les résultats de cette analyse et les conclusions qui en dérivent.Nous y avons ajouté une synthèse des travaux réalisés antérieurement et concertants la caractérisationdes promoteurs de gène qui codent pour les snoARN chez la levure S.cerevisiae, positionnée en toutefin de document. / In eukaryotes, transcription is carried out by DNA-dependent RNA polymerases I, II and III (or I-V inplants). These RNA polymerases are specialized in the transcription of specific groups of genes.Human RNA polymerase III (Pol III) transcribes small noncoding RNAs involved in the regulation oftranscription (7SK RNA), RNA processing (U6 RNA, RNAse P, RNAse MRP), translation (tRNAs,5S RNA) or other cellular processes (vault RNAs [multidrug resistance], adenoviral RNAs [VA-I,VA-II], Epstein-Barr virus RNAs [EBER1, EBER2]). It has furthermore been reported that somemicroRNAs of viral or cellular origin may also be transcribed by Pol III.Interestingly, increased Pol III transcription levels accompany or cause cell transformation. Themechanisms underlying this phenomenon are still largely unknown. Recently, two distinct isoforms ofhuman Pol III have been discovered (Haurie et al., 2010). RPC32β-containing Pol IIIβ is ubiquitouslyexpressed and essential for growth and survival of human cells. In contrast, RPC32α-containing PolIIIα is dispensable for cell survival and its expression is restricted to undifferentiated embryonic stem(ES) cells and to tumor cells.The distinct effects of Pol IIIα and Pol III β on cell growth and transformation may be explained bythe transcription of isoform-specific target genes. To identify such isoform-specific target genes, wespecifically targeted RPC32α and of RPC32β subunits in chromatin immunoprecipitation (ChIP)experiments and analyzed the co-precipitated DNA sequences by high throughput sequencing (ChIPseq.).Genome wide localization of RPC32α and RPC32β subunits of Pol III revealed the presence of bothsubunits on many of the known Pol III-transcribed genes, suggesting redundant activities of bothisoforms of Pol III in transcription of these genes. We also found that some of the genes known to betranscribed by Pol III are only occupied by either RPC32α or by RPC32β, suggesting that these genesare exclusively transcribed by Pol IIIα or by Pol IIIβ, respectively.RPC32α and RPC32β ChIP-seq. results furthermore led to the identification of novel Pol III candidategenes in HeLa cells. Moreover, we found high levels of Pol IIIα or Pol III β at some of the annotatedtRNA pseudogenes, implicating that these genes may be transcribed. The functions of RNAstranscribed from novel putative Pol III genes or from tRNA pseudogenes remain to be determined.