Submitted by Isaac Francisco de Souza Dias (isaac.souzadias@ufpe.br) on 2015-05-19T16:34:38Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) DISSERTAÇÃO Carolina da Rocha Simões.pdf: 2694652 bytes, checksum: 6446d4fa347e53fe42ce7e769f745124 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-19T16:34:38Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) DISSERTAÇÃO Carolina da Rocha Simões.pdf: 2694652 bytes, checksum: 6446d4fa347e53fe42ce7e769f745124 (MD5) Previous issue date: 2014-02-20 / CAPES / O aumento da informação proveniente do sequenciamento de alta performance (NGS), e de projetos como o 1000 genomas e HapMap, permitiram a descoberta de milhões de variações. Entretanto, o maior desafio é a identificação da relação entre o genótipo e o fenótipo, proporcionando informações que possam ajudar a definir os polimorfismos que podem ou não causar doenças. Ferramentas computacionais tem auxiliado na predição das modificações estruturais geradas pelos polimorfismos, e as consequentes alterações funcionais sofridas pelas proteínas. Os receptores Toll Like (TLR) são proteínas do sistema imunológico que estão envolvidas na regulação da inflamação e em alguns casos no desenvolvimento do câncer. O objetivo deste projeto foi analisar, através de ferramentas in silico, os polimorfismos de base única nos genes das TLRs, buscando por polimorfismos que possam estar relacionados com a predisposição ao câncer e com alterações da via de sinalização das TLRs. Foram encontrados 37 genes que estão envolvidos na via de sinalização e podem ser utilizados como marcadores genéticos (biomarcadores) para o diagnóstico e predição das alterações na expressão dos genes relacionados à esta via. Estes genes, se regulados, podem ser utilizados como inibidores. Em relação aos polimorfismos foram coletados no banco de dados dbSNP/NCBI 5.839 SNPs entre os 10 genes das TLRs. Destes, 1.017 variações foram classificadas como missense e analisadas para avaliar as consequências estruturais pela troca dos aminoácidos. Para isso quatro ferramentas preditoras (SIFT, Polyphen, MutationAssessor e SDM) foram utilizadas gerando informações sobre as modificações e associando-as com possíveis danos nas proteínas. Dos polimorfismos analisados 223 foram classificados como danosos baseados na troca de aminoácido e podem causar uma desregulação funcional na proteína. Entre eles está o rs5743708 (TLR2), rs3775291, (TLR3) e rs11466653 (TLR10) que já foi estudado in vitro e tiveram associação com câncer colorectal (TLR2 e 3) e carcinoma da tireóide (TLR10). A predição prévia, in silico, das alterações funcionais pode auxiliar na interpretação das variações gênicas, neste caso associadas com o câncer, e também na caracterização precisa dos fatores que levam a estas alterações, contribuindo no diagnóstico, na prevenção e em melhores respostas aos tratamentos oferecidos.

Submitted by Gislaine Aparecida Querino (gislainequerino@hotmail.com) on 2018-09-28T01:32:53Z No. of bitstreams: 1 Querino,GA.pdf: 869186 bytes, checksum: 86a067f5db0e67b546c8ad7691a3d530 (MD5) / Approved for entry into archive by ROSANGELA APARECIDA LOBO null (rosangelalobo@btu.unesp.br) on 2018-09-28T12:55:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 querino_ga_dr_bot.pdf: 869186 bytes, checksum: 86a067f5db0e67b546c8ad7691a3d530 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-28T12:55:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 querino_ga_dr_bot.pdf: 869186 bytes, checksum: 86a067f5db0e67b546c8ad7691a3d530 (MD5) Previous issue date: 2018-07-25 / A hanseníase é uma doença infecciosa crônica causada pelo Mycobacterium leprae que pode se manifestar sob diferentes formas clínicas a depender da resposta imune celular do hospedeiro. Vários marcadores genéticos têm sido definidos e, devido à participação dos alelos HLA na resposta imune, estes têm sido amplamente estudados na hanseníase. O HLA-DP constitui uma das moléculas clássicas de classe II, com poucos estudos em hanseníase. O objetivo deste trabalho foi conduzir um estudo de associação genética de base populacional em hanseníase para os genes HLA-DPA1 e HLA-DPB1 com duas amostras caso-controle: a primeira de Rondonópolis-MT, uma região hiperendêmica para hanseníase, e a segunda do Estado de São Paulo, uma região com índices epidemiológicos controlados. Foram realizados estudos com 9 tag SNPs na região dos genes HLA-DPA1 e HLA-DPB1 na população de Rondonópolis–MT (411 casos e 357 controles). O SNP rs9277341 que apresentou dados de associação com significância estatística após a correção de Bonferroni foi então testado na população de São Paulo (570 casos e 380 controles). Para avaliar o efeito funcional deste marcador foi determinada estudoa produção das citocinas IL-10 e TNF após estímulo com antígeno sonicado de M. leprae em 21 controles saudáveis. Na população de Rondonópolis-MT foi realizada a tipificação dos alelos HLA-DPA1* e HLA-DPB1* através da técnica de PCR-SSO empregando-se o kit Labtype-SSO (One Lambda, CA, USA). Os resultados de genotipagem mostraram associação com hanseníase per se para o marcador rs9377341 do gene HLA-DPA1 e dois marcadores do gene HLA-DPB1 (rs1431402 e rs9277469). Associações de proteção para a forma multibacilar da hanseníase foram encontradas para os marcadores rs9277341 e rs2301220 do gene HLA-DPA1 e para o marcador rs31350221 do gene HLA-DPB1. O SNP rs9277341, com dados significativos após a correção de Bonferroni e testado na população do Estado de São Paulo, não apresentou associação com hanseníase. A avaliação funcional mostrou que os carreadores do alelo G do rs9277341 apresentaram níveis maiores de IL-10 e TNF. Na tipificação dos alelos HLA, o alelo HLA-DPB1*03 foi associado à hanseníase per se e o genótipo HLA-DPB1*02/03 foi associado à hanseníase per se e à proteção para a forma MB. Esses dados sugerem a participação dos genes HLA-DPA1 e HLA-DPB1 nos desfechos da hanseníase. / Leprosy, a chronic infectious disease caused by Mycobacterium leprae, displays different clinical manifestations depending on the immune response of the host. Several genetic markers have been defined and due to the involvement of the HLA alleles in the immune response they were extensively studied in leprosy. However, HLA-DP is a classical class II molecule with few studies on leprosy. The objective of this study was to conduct a population-based genetic association study in leprosy for the HLA-DPA1 and HLA-DPB1 genes with two case-control samples: the first from Rondonópolis - Mato Grosso (MT), a hyperendemic region in leprosy and the second from the state of São Paulo, a region with controlled epidemiological indices. Studies were carried out with 9 Tag Single Nucleotide Polymorphism (SNP) in HLA-DPA and HLA-DPB genes in the population from Rondonópolis – MT (411 cases and 357 controls). The SNP rs9277341 who presented association data with statist significance after the Bonferroni correction was tested in the São Paulo population (570 cases and 380 controls). To evaluate the functional effect of this marker was carried a study of the production of IL-10 and TNF cytokines after stimulation with the sonicated antigen of M. leprae in 21 healthy controls. In the Rondonópolis populations was performed the HLA-DPA1* and HLA-DPB1* allele typing by Sequence-Specific Oligonucleotide – Polymerase Chain Reaction (SSO- PCR) using the Labtype-SSO kit (One Lambda, CA, USA). The genotyping results showed association with leprosy per se for the SNP rs9277341 in the HLA-DPA1 gene and two markers in the HLA-DPB1 gene (rs1431402 and rs9277469).The protections associations for the multibacilar form the leprosy was found for the markers rs9277341 and rs2301220 in the HLA-DPA1 gene and the marker rs 31350221 in the HLA-DPB1 gene. The rs9277341 with significatif datas after the Bonferroni correction and tested in the São Paulo state showed no association with leprosy. The functional study showed significantly increased IL-10 and TNF levels in G carriers. HLA typing analysis the HLA-DPB1*03 allele was associated with leprosy per se and the HLA-DPB1*02/03 genotype was associated with leprosy per se and the protection with MB form. These data suggest an association of HLA-DPA1 and HLA-DPB1 genes with leprosy.

Orientador: Ana Carla Pereira Latini / Resumo: A hanseníase é uma doença infecciosa crônica causada pelo Mycobacterium leprae que pode se manifestar sob diferentes formas clínicas a depender da resposta imune celular do hospedeiro. Vários marcadores genéticos têm sido definidos e, devido à participação dos alelos HLA na resposta imune, estes têm sido amplamente estudados na hanseníase. O HLA-DP constitui uma das moléculas clássicas de classe II, com poucos estudos em hanseníase. O objetivo deste trabalho foi conduzir um estudo de associação genética de base populacional em hanseníase para os genes HLA-DPA1 e HLA-DPB1 com duas amostras caso-controle: a primeira de Rondonópolis-MT, uma região hiperendêmica para hanseníase, e a segunda do Estado de São Paulo, uma região com índices epidemiológicos controlados. Foram realizados estudos com 9 tag SNPs na região dos genes HLA-DPA1 e HLA-DPB1 na população de Rondonópolis–MT (411 casos e 357 controles). O SNP rs9277341 que apresentou dados de associação com significância estatística após a correção de Bonferroni foi então testado na população de São Paulo (570 casos e 380 controles). Para avaliar o efeito funcional deste marcador foi determinada estudoa produção das citocinas IL-10 e TNF após estímulo com antígeno sonicado de M. leprae em 21 controles saudáveis. Na população de Rondonópolis-MT foi realizada a tipificação dos alelos HLA-DPA1* e HLA-DPB1* através da técnica de PCR-SSO empregando-se o kit Labtype-SSO (One Lambda, CA, USA). Os resultados de genotipagem mostraram asso... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Leprosy, a chronic infectious disease caused by Mycobacterium leprae, displays different clinical manifestations depending on the immune response of the host. Several genetic markers have been defined and due to the involvement of the HLA alleles in the immune response they were extensively studied in leprosy. However, HLA-DP is a classical class II molecule with few studies on leprosy. The objective of this study was to conduct a population-based genetic association study in leprosy for the HLA-DPA1 and HLA-DPB1 genes with two case-control samples: the first from Rondonópolis - Mato Grosso (MT), a hyperendemic region in leprosy and the second from the state of São Paulo, a region with controlled epidemiological indices. Studies were carried out with 9 Tag Single Nucleotide Polymorphism (SNP) in HLA-DPA and HLA-DPB genes in the population from Rondonópolis – MT (411 cases and 357 controls). The SNP rs9277341 who presented association data with statist significance after the Bonferroni correction was tested in the São Paulo population (570 cases and 380 controls). To evaluate the functional effect of this marker was carried a study of the production of IL-10 and TNF cytokines after stimulation with the sonicated antigen of M. leprae in 21 healthy controls. In the Rondonópolis populations was performed the HLA-DPA1* and HLA-DPB1* allele typing by Sequence-Specific Oligonucleotide – Polymerase Chain Reaction (SSO- PCR) using the Labtype-SSO kit (One Lambda, CA, USA). The genotyp... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Submitted by VITO ANTONIO MASTROCHIRICO FILHO null (vito.oceano@gmail.com) on 2016-04-09T21:47:55Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Repositório Vito.pdf: 3114594 bytes, checksum: fe4a528d166d3a59bfac7d3a244a016c (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-04-11T13:38:46Z (GMT) No. of bitstreams: 1 mastrochiricofilho_va_me_jabo.pdf: 3114594 bytes, checksum: fe4a528d166d3a59bfac7d3a244a016c (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-11T13:38:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 mastrochiricofilho_va_me_jabo.pdf: 3114594 bytes, checksum: fe4a528d166d3a59bfac7d3a244a016c (MD5) Previous issue date: 2016-02-29 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Pacu (Piaractus mesopotamicus) é uma espécie de peixe Neotropical amplamente distribuída nas bacias dos rios Paraná e Paraguai, e uma das espécies de peixe neotropicais de maior valor para a aquicultura. Uma melhor compreensão do genoma do pacu é necessária para o manejo genético na conservação dos estoques naturais e cultivados. O principal objetivo foi identificar SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) gene-associados no transcriptoma de fígado do pacu e, em seguida, aplicar em análises de variabilidade genética e de parentesco visando um manejo adequado desta importante espécie não modelo na aquicultura. O sequenciamento do transcriptoma foi realizado por meio da plataforma Roche/454, que resultou na formação de 4.110 contigs não redundantes. Destes, 2.051 genes foram identificados e funcionalmente anotados a fim de revelar genes relacionados às características econômicas interessantes para a aquicultura. Foram encontrados 464 SNPs localizados em 5’UTR (10.0%), 3’UTR (17.2%) e em regiões CDS (71,1%), e classificados como sinônimos (70,6%) e não sinônimos (29,4%). Foram genotipados 32 SNPs por meio da técnica Sequenom MassARRAY, dos quais alguns estavam relacionados com sistema imune. A variabilidade genética foi estimada em populações de indivíduos selvagens (Rio Paraná) e de indivíduos cultivados em sete pisciculturas do estado de São Paulo (FF1, FF2, FF3, FF4, FF5, FF6 e FF7). Não foram observadas diferenças significativas entre heterozigosidade observada (Hobs) e esperada (Hexp) para cada população. Análises de diferenciação genética mostraram baixo nível de estruturação genética entre as populações (Fst = 0.064, AMOVA = 93,59% da variação dentro de populações, P<0,05). Análises de parentesco mostraram que a maioria das estações de piscicultura possuíam pelo menos 40% de indivíduos aparentados, com risco de endogamia e necessidade de realização de um programa de acasalamentos direcionados. Nossos resultados proporcionaram importantes recursos genéticos para o pacu, com aplicabilidade para a aquicultura. / Pacu (Piaractus mesopotamicus) is a Neotropical freshwater fish widely distributed in Parana, Paraguay Basin. Wild populations of pacu are threatened by overfishing and it is one of the fish species of highest commercial value for aquaculture. An understanding of the pacu genome is appropriate to genetic management in the conservation of wild and cultivated stocks. The main objective was identify gene-associated SNPs in liver transcriptome of pacu. We used SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) to perform genetic variability and kinship analysis for suitable management of this important non-model species in aquaculture. Transcriptome sequencing was done with the Roche/454 technology and yielded 4,110 non-redundant contigs. Of these, 2,051 genes were identified and functionally annotated to reveal genes correlated to economical traits in aquaculture. We found 464 SNPs in 5’UTR (10.0%), 3’UTR (17.2%) and CDS (71,1%), classified in synonymous (70,6%) and non-synonymous (29,4%). We genotyped 32 feasible SNPs through Sequenom MassARRAY platform and we obtained some SNPs related to immune system. Genetic diversity was estimated in wild individuals (Parana river) and in seven farm fish populations (FF1, FF2, FF3, FF4, FF5, FF6 and FF7). There were no significant differences between observed heterozygosity (Hobs) and expected (Hexp) for each population; and also between observed heterozygosity, expected heterozygosity and minimum allele frequency (MAF), when the population averages were compared (P <0.05). In addition, genetic differentiation analyzes showed low genetic structure of wild and cultivated populations of pacu (Fst = 0.064; AMOVA = 93.59% of the variation within populations; P<0,05). Kinship analysis showed most hatchery stations had at least 40% of related individuals, at risk of inbreeding and the need to perform a directed mating program. Our results showed unprecedented genomic resources for pacu. / FAPESP: 2014/12412-4

O colágeno XVIII é um componente das membranas basais com diversos domínios funcionais, como a endostatina e o domínio frizzled, que têm importante papel em processos celulares como proliferação e diferenciação. COL18A1 possui dois promotores alternativos: o promotor 1, que regula a síntese da variante NC11-303, e o promotor 2 responsável pelas variantes NC11- 728 e NC11-493, expressas por hepatócitos. Existe uma variação interindividual da endostatina circulante e da expressão do colágeno XVIII no fígado. A expressão do colágeno XVIII/endostatina foi correlacionada com a progressão tanto do hepatocarcinoma (HCC), quanto da fibrose/cirrose hepática. Elucidar a regulação da expressão de COL18A1 pode auxiliar na compreensão dessa variação interindividual e da progressão dessas doenças. Neste trabalho demos início a caracterização do promotor 2 do COL18A1. Identificamos na seqüência predita como promotora cinco regiões conservadas entre humanos e camundongos. A análise in silico e funcional dessas regiões revelou que os fatores de transcrição, Sp1, Sp3, YY1, Oct-1, C/EBP&#945; e C/EBP&#946;, interagem com as mesmas. Demonstramos que C/EBP&#946;&#61472;aumenta a taxa de transcrição do promotor 2 em hepatócitos, e que existe uma correlação positiva da expressão de NC11-493 com C/EBP&#945;&#61472;e C/EBP&#946;&#61472;em tecido hepático cirrótico e tumoral. As expressões de C/EBP&#945;&#61472;em tecido hepático cirrótico e tumoral estão diretamente correlacionadas, enquanto que os níveis de NC11-493 nos tumores estão inversamente correlacionados com o tamanho dos mesmos. Mostramos a existência de diversos SNPs no promotor 2. O SNP-700T/G, funcional in vitro, afeta a interação de Sp3 e YY1 com essa região regulatória. A deleção da região do SNP indicou que ela possui elementos importantes para a transcrição em hepatócitos, apesar deste SNP não estar relacionado com o nível de expressão do colágeno XVIII em fígado fibrótico ou com susceptibilidade a HCC. O SNP- 700T/G está em desequilíbrio de ligação com o SNPc.1135C/T, no domínio frizzled do colágeno XVIII. Não foi possível elucidar a funcionalidade do SNPs c.1135C/T in vitro, mas os haplótipos formados por esses dois SNPs têm diferentes frequências entre descendentes de europeus e de africanos. Nosso trabalho traz importantes contribuições e abre novas perspectivas para a compreensão da regulação do colágeno XVIII em fígado humano, tanto em situações fisiológicas, quanto em processos fibrogênicos e tumorigênicos¶ / Collagen XVIII is a basal membrane component with several funcional domains, such as endostatin and frizzled domains, which have important roles in cellular processes such as proliferation and differentiation. COL18A1 has two promoter regions: promoter 1, that regulates the synthesis of NC11-303 isoform, and promoter 2, localized in intron 2, responsible for NC11-728 and NC11-493 isoforms expressed by hepatocytes. There is a large interindividual variation in circulating endostatin and in collagen XVIII liver expression. Collagen XVIII/endostatin levels were correlated with hepatocellular carcinoma (HCC) progression, as well as liver fibrosis/cirrhosis, conditions that precede HCC. Elucidating the mechanisms that regulate COL18A1 expression in hepatocytes may help understanding its variation among individuals and liver disease stages, as well as contribute to new treatment strategies. In this work we began to characterize COL18A1 promoter region 2. We identified in the predicted promoter sequence five conserved regions between human and mouse. The in silico and functional analysis of these regions revealed that transcription factors Sp1, Sp3, YY1, Oct-1, C/EBP&#945; and C/EBP&#946; interact with them. We have demonstrated that C/EBP&#946; increases promoter 2 transcription rate in hepatocytes, and that there is a positive correlation of NC11-493 expression with that of C/EBP&#945; and C/EBP&#946; in cirrhotic and tumor liver samples. Non-tumor and tumor C/EBP&#945; expressions positively correlate between themselves, while NC11-493 tumor expression inversely correlates with tumor size. We also showed that there are several SNPs in COL18A1 promoter 2 region. SNP-700T/G, functional in vitro, affects Sp3 and YY1 interaction with the promoter 2 region and deletion of the SNP region indicated that this sequence has important hepatocyte regulatory elements. Our results suggest that this SNP does not significantly affects COL18A1 expression in fibrotic/cirrhotic liver and is not associated with HCC susceptibility. SNP-700T/G is in linkage disequilibrium with SNPc.1135C/T, at collagen XVIII frizzled domain. We could not elucidate SNPc.1135C/T functionality in vitro, but the haplotypes formed by these two SNPs have different frequencies in European and African descendants. In conclusion, our work brings important contributions and opens new perspectives for the comprehension of collagen XVIII regulation in human liver in physiological situations, as well as in fibrotic/cirrhotic and tumorigenic process.

O colágeno XVIII é um componente das membranas basais com diversos domínios funcionais, como a endostatina e o domínio frizzled, que têm importante papel em processos celulares como proliferação e diferenciação. COL18A1 possui dois promotores alternativos: o promotor 1, que regula a síntese da variante NC11-303, e o promotor 2 responsável pelas variantes NC11- 728 e NC11-493, expressas por hepatócitos. Existe uma variação interindividual da endostatina circulante e da expressão do colágeno XVIII no fígado. A expressão do colágeno XVIII/endostatina foi correlacionada com a progressão tanto do hepatocarcinoma (HCC), quanto da fibrose/cirrose hepática. Elucidar a regulação da expressão de COL18A1 pode auxiliar na compreensão dessa variação interindividual e da progressão dessas doenças. Neste trabalho demos início a caracterização do promotor 2 do COL18A1. Identificamos na seqüência predita como promotora cinco regiões conservadas entre humanos e camundongos. A análise in silico e funcional dessas regiões revelou que os fatores de transcrição, Sp1, Sp3, YY1, Oct-1, C/EBP&#945; e C/EBP&#946;, interagem com as mesmas. Demonstramos que C/EBP&#946;&#61472;aumenta a taxa de transcrição do promotor 2 em hepatócitos, e que existe uma correlação positiva da expressão de NC11-493 com C/EBP&#945;&#61472;e C/EBP&#946;&#61472;em tecido hepático cirrótico e tumoral. As expressões de C/EBP&#945;&#61472;em tecido hepático cirrótico e tumoral estão diretamente correlacionadas, enquanto que os níveis de NC11-493 nos tumores estão inversamente correlacionados com o tamanho dos mesmos. Mostramos a existência de diversos SNPs no promotor 2. O SNP-700T/G, funcional in vitro, afeta a interação de Sp3 e YY1 com essa região regulatória. A deleção da região do SNP indicou que ela possui elementos importantes para a transcrição em hepatócitos, apesar deste SNP não estar relacionado com o nível de expressão do colágeno XVIII em fígado fibrótico ou com susceptibilidade a HCC. O SNP- 700T/G está em desequilíbrio de ligação com o SNPc.1135C/T, no domínio frizzled do colágeno XVIII. Não foi possível elucidar a funcionalidade do SNPs c.1135C/T in vitro, mas os haplótipos formados por esses dois SNPs têm diferentes frequências entre descendentes de europeus e de africanos. Nosso trabalho traz importantes contribuições e abre novas perspectivas para a compreensão da regulação do colágeno XVIII em fígado humano, tanto em situações fisiológicas, quanto em processos fibrogênicos e tumorigênicos¶ / Collagen XVIII is a basal membrane component with several funcional domains, such as endostatin and frizzled domains, which have important roles in cellular processes such as proliferation and differentiation. COL18A1 has two promoter regions: promoter 1, that regulates the synthesis of NC11-303 isoform, and promoter 2, localized in intron 2, responsible for NC11-728 and NC11-493 isoforms expressed by hepatocytes. There is a large interindividual variation in circulating endostatin and in collagen XVIII liver expression. Collagen XVIII/endostatin levels were correlated with hepatocellular carcinoma (HCC) progression, as well as liver fibrosis/cirrhosis, conditions that precede HCC. Elucidating the mechanisms that regulate COL18A1 expression in hepatocytes may help understanding its variation among individuals and liver disease stages, as well as contribute to new treatment strategies. In this work we began to characterize COL18A1 promoter region 2. We identified in the predicted promoter sequence five conserved regions between human and mouse. The in silico and functional analysis of these regions revealed that transcription factors Sp1, Sp3, YY1, Oct-1, C/EBP&#945; and C/EBP&#946; interact with them. We have demonstrated that C/EBP&#946; increases promoter 2 transcription rate in hepatocytes, and that there is a positive correlation of NC11-493 expression with that of C/EBP&#945; and C/EBP&#946; in cirrhotic and tumor liver samples. Non-tumor and tumor C/EBP&#945; expressions positively correlate between themselves, while NC11-493 tumor expression inversely correlates with tumor size. We also showed that there are several SNPs in COL18A1 promoter 2 region. SNP-700T/G, functional in vitro, affects Sp3 and YY1 interaction with the promoter 2 region and deletion of the SNP region indicated that this sequence has important hepatocyte regulatory elements. Our results suggest that this SNP does not significantly affects COL18A1 expression in fibrotic/cirrhotic liver and is not associated with HCC susceptibility. SNP-700T/G is in linkage disequilibrium with SNPc.1135C/T, at collagen XVIII frizzled domain. We could not elucidate SNPc.1135C/T functionality in vitro, but the haplotypes formed by these two SNPs have different frequencies in European and African descendants. In conclusion, our work brings important contributions and opens new perspectives for the comprehension of collagen XVIII regulation in human liver in physiological situations, as well as in fibrotic/cirrhotic and tumorigenic process.

Os genes de receptores olfatórios (OR) pertencem a uma família de proteínas de membrana formada por cerca de 1000 genes no genoma de camundongo. Os genes OR são expressos de forma monogênica e monoalélica nos neurônios olfatórios (OSNs). No entanto, ainda não está claro o mecanismo que permite essa forma de expressão peculiar, sobretudo, qual o papel da metilação de DNA nesse processo. Nosso estudo determinou o padrão de metilação de DNA da região promotora e codificadora do gene Olfr17. Em células de epitélio olfatório (MOE) de camundongos adultos, observamos na região codificadora (CDS) do gene uma frequência de metilação em dinucleotídeos CpG 58%, enquanto que na sua região promotora ela foi bem mais baixa. Os níveis de metilação do Olfr17 em MOE de embrião (E15.5) e fígado foram similares aos observados em MOE de animais adultos. Em seguida, analisamos se a metilação de DNA pode regular a expressão gênica do Olfr17. Utilizando animais transgênicos onde os neurônios olfatórios que expressam Olfr17 também expressam GFP, pudemos selecionar neurônios olfatórios GFP+ e analisar a metilação do gene Olfr17, que está ativo nestas células. Verificamos que o padrão geral de metilação do Olfr17, tanto na região CDS como na região promotora, não se altera quando este gene está ativo. Este resultado indica que alterações na metilação do gene Olfr17 não são necessárias para que este receptor seja expresso. Finalmente, verificamos que a região promotora do gene Olfr17, de duas linhagens de camundongos diferentes, a C57BL/6 e a 129, possuem dois polimorfismos de base única (SNPs) que alteram o conteúdo CpG. Devido a estes SNPs, a linhagem 129 apresenta dois sítios CpG adicionais, inexistentes na linhagem C57BL/6. Nossas análises mostraram que estes CpGs são frequentemente metilados, o que torna o promotor do Olfr17 de 129 significativamente mais metilado que o promotor de C57BL/6. Em seguida, nós analisamos o nível de expressão no MOE dos dois alelos de Olfr17, o 129 e o C57BL/6, utilizando ensaios de RT-qPCR. Estes experimentos demonstraram que o nível de expressão do alelo 129, que possui 3 CpGs metiladas em seu promotor, é menor que o do alelo C57BL/6, que apresenta apenas uma CpG que é pouco metilada em seu promotor. Nossos resultados sugerem que as alterações na região promotora influenciam a probabilidade com que o gene OR é escolhido para ser expresso no MOE. / Olfactory receptor (OR) genes belong to a large family of membrane proteins composed of 1000 genes in the mouse genome. The OR genes are expressed in the olfactory sensory neurons (OSNs) in a monogenic and monoallelic fashion. However, the mechanisms that govern OR gene expression are unclear. Here we asked whether DNA methylation plays a role in the regulation of OR gene expression. We first determined the DNA methylation pattern in the coding (CDS) and promoter regions of the odorant receptor gene Olfr17. In olfactory epithelium (MOE) cells, the CpG methylation level in the CDS is 58% but is much lower in the promoter region of the gene. In embryonic MOE (E15.5) and liver, the levels of Olfr17 DNA methylation are similar to the ones shown in adult MOE. We next analyzed whether DNA methylation is involved in Olfr17 regulation. We isolated GFP+ neurons from transgenic mice that coexpress GFP with Olfr17, and analyzed the DNA methylation pattern of the Olfr17, which is active in these cells. We found that the general methylation pattern, both, in the coding and promoter regions is not altered in the active gene. These results indicate that changes in DNA methylation are not required for the activation of Olfr17. Finally, we found that the Olfr17 promoter region from two different mouse strains, C57BL/6 and 129, has two single-nucleotide polymorphisms (SNPs) that alter the CpG content. The SNPs lead to the existence of two additional CpGs in the 129 allele, which are absent in the C57BL/6 allele. These CpGs are frequently methylated, making the 129 Olfr17 promoter significantly more methylated than the Olfr17 promoter from C57BL/6. We next performed RT-qPCR experiments to analyze the expression levels of the 129 and C57BL/6 Olfr17 alleles in the MOE. These experiments showed that the expression level of the 129 Olfr17 allele, which contains three methylated CpGs in its promoter region, is lower than the one from C57BL/6, which contains only one, undermethylated CpG, in its promoter. Our results suggest that these promoter modifications regulate the probability of the OR gene choice.

Os genes de receptores olfatórios (OR) pertencem a uma família de proteínas de membrana formada por cerca de 1000 genes no genoma de camundongo. Os genes OR são expressos de forma monogênica e monoalélica nos neurônios olfatórios (OSNs). No entanto, ainda não está claro o mecanismo que permite essa forma de expressão peculiar, sobretudo, qual o papel da metilação de DNA nesse processo. Nosso estudo determinou o padrão de metilação de DNA da região promotora e codificadora do gene Olfr17. Em células de epitélio olfatório (MOE) de camundongos adultos, observamos na região codificadora (CDS) do gene uma frequência de metilação em dinucleotídeos CpG 58%, enquanto que na sua região promotora ela foi bem mais baixa. Os níveis de metilação do Olfr17 em MOE de embrião (E15.5) e fígado foram similares aos observados em MOE de animais adultos. Em seguida, analisamos se a metilação de DNA pode regular a expressão gênica do Olfr17. Utilizando animais transgênicos onde os neurônios olfatórios que expressam Olfr17 também expressam GFP, pudemos selecionar neurônios olfatórios GFP+ e analisar a metilação do gene Olfr17, que está ativo nestas células. Verificamos que o padrão geral de metilação do Olfr17, tanto na região CDS como na região promotora, não se altera quando este gene está ativo. Este resultado indica que alterações na metilação do gene Olfr17 não são necessárias para que este receptor seja expresso. Finalmente, verificamos que a região promotora do gene Olfr17, de duas linhagens de camundongos diferentes, a C57BL/6 e a 129, possuem dois polimorfismos de base única (SNPs) que alteram o conteúdo CpG. Devido a estes SNPs, a linhagem 129 apresenta dois sítios CpG adicionais, inexistentes na linhagem C57BL/6. Nossas análises mostraram que estes CpGs são frequentemente metilados, o que torna o promotor do Olfr17 de 129 significativamente mais metilado que o promotor de C57BL/6. Em seguida, nós analisamos o nível de expressão no MOE dos dois alelos de Olfr17, o 129 e o C57BL/6, utilizando ensaios de RT-qPCR. Estes experimentos demonstraram que o nível de expressão do alelo 129, que possui 3 CpGs metiladas em seu promotor, é menor que o do alelo C57BL/6, que apresenta apenas uma CpG que é pouco metilada em seu promotor. Nossos resultados sugerem que as alterações na região promotora influenciam a probabilidade com que o gene OR é escolhido para ser expresso no MOE. / Olfactory receptor (OR) genes belong to a large family of membrane proteins composed of 1000 genes in the mouse genome. The OR genes are expressed in the olfactory sensory neurons (OSNs) in a monogenic and monoallelic fashion. However, the mechanisms that govern OR gene expression are unclear. Here we asked whether DNA methylation plays a role in the regulation of OR gene expression. We first determined the DNA methylation pattern in the coding (CDS) and promoter regions of the odorant receptor gene Olfr17. In olfactory epithelium (MOE) cells, the CpG methylation level in the CDS is 58% but is much lower in the promoter region of the gene. In embryonic MOE (E15.5) and liver, the levels of Olfr17 DNA methylation are similar to the ones shown in adult MOE. We next analyzed whether DNA methylation is involved in Olfr17 regulation. We isolated GFP+ neurons from transgenic mice that coexpress GFP with Olfr17, and analyzed the DNA methylation pattern of the Olfr17, which is active in these cells. We found that the general methylation pattern, both, in the coding and promoter regions is not altered in the active gene. These results indicate that changes in DNA methylation are not required for the activation of Olfr17. Finally, we found that the Olfr17 promoter region from two different mouse strains, C57BL/6 and 129, has two single-nucleotide polymorphisms (SNPs) that alter the CpG content. The SNPs lead to the existence of two additional CpGs in the 129 allele, which are absent in the C57BL/6 allele. These CpGs are frequently methylated, making the 129 Olfr17 promoter significantly more methylated than the Olfr17 promoter from C57BL/6. We next performed RT-qPCR experiments to analyze the expression levels of the 129 and C57BL/6 Olfr17 alleles in the MOE. These experiments showed that the expression level of the 129 Olfr17 allele, which contains three methylated CpGs in its promoter region, is lower than the one from C57BL/6, which contains only one, undermethylated CpG, in its promoter. Our results suggest that these promoter modifications regulate the probability of the OR gene choice.