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Clonagem, avaliação de SNPs e expressão heteróloga da ATP Difosfohidrolase 2 (NTPDase 2) das cepas ET e NSL de Leishmania (Viannia) braziliensis / Cloning, SNPs evaluation and heterologous expression of ATP Diphosphohydrolase 2 (NTPDase 2) from Leishmania (Viannia) braziliensis ET and NSL strainsTorres, Nancy da Rocha 24 July 2017 (has links)
Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2017-11-23T11:23:38Z
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Previous issue date: 2017-07-24 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / As leishmanioses compreendem um conjunto de doenças causadas por protozoários do gênero Leishmania e transmitidas pela picada de fêmeas de insetos flebotomíneos. Apresentam diferentes formas de manifestações clínicas de acordo com a espécie envolvida, podendo apresentar sintomatologia mais severa correlacionada à infecção por cepas mais virulentas. Estudos indicam que L. braziliensis, principal agente da leishmaniose cutânea e mucocutânea no Brasil, possui uma diversidade intra-espécie e que diferentes cepas estão relacionadas a diferenças na virulência, podendo influenciar o desenvolvimento de diferentes formas clínicas. Foi observado que as cepas ET e NSL apresentam características polares quanto à virulência e infecciosidade em modelo murino. Além disso, foi observado que essas cepas diferem na hidrólise de nucleotídeos extracelulares e que a alta taxa de hidrólise de ATP se correlaciona com a cepa NSL, de maior virulência. O mesmo trabalho identificou a presença de SNPs não silenciosos na sequência da NTPDase2 de NSL, mas nenhuma correlação com a atividade de hidrólise de nucleotídeos, virulência e infectividade foi observada. Considerando papel das NTPDases de Leishmania na hidrólise de nucleotídeos extracelulares e na modulação da resposta imune do hospedeiro, o objetivo desse trabalho consistiu em investigar a relação desses polimorfismos com a atividade da enzima NTPDase2, visando compreender as diferenças de hidrólise de nucleotídeos e virulência previamente observados. Nesse trabalho, a região que codifica para o ectodomínio da enzima NTPDase2 das cepas ET e NSL foi isolado e clonado em vetor bacteriano e a sequência correspondente ao ectodomínio de ET/NSL-NTPDase2 foi clonada no vetor pET21b, expressa e purificada. Análises de polimorfismos nas sequências indicam que os clones ET apresentam apenas SNPs silenciosos nas posições 861 e 879. Diferentemente, alguns clones NSL apresentam sequência idêntica à de ET e outros possuem SNPs nas posições 213, 296, 377, 554 e 1126, mudando os aminoácidos nas posições 99, 126, 185 e 376. Avaliando a estrutura 3D das proteínas, foi observado que a maioria das mutações são externas à enzima e que a mutação T376A se localiza em uma região predita como importante para a ligação ao substrato. Juntos, esses resultados levantam questões importantes acerca da influência desses SNPs na estrutura e atividade da enzima, que podem nortear experimentos futuros, a fim de elucidar o papel de variantes genéticas para a enzima NTPDase2 nos fenômenos observados para essas duas cepas em L. braziliensis. / Leishmaniasis comprises a set of diseases caused by Leishmania protozoa and transmitted by the bite of females of phlebotomine insects. They present different clinical outcomes according to the species and may present more severe symptomatology correlated to infection by more virulent strains. Studies indicate that L. braziliensis, the main agent of cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis in Brazil, has an intra-species diversity and different strains are related to differences in virulence, who affects the development of different clinical forms. It was observed that the ET and NSL strains have polar characteristics regarding virulence and infectivity in murine model. Furthermore, it was observed that these strains differ in hydrolysis of extracellular nucleotides and the high rate of hydrolysis of ATP correlates with the NSL, the higher virulence strain. The same work identified non-silent SNPs in NTPDase2 sequence, but no correlation with nucleotide hydrolysis activity, virulence and infectivity was observed. Considering the role of Leishmania NTPDases in hydrolysis of extracellular nucleotides and modulation of the host immune response, the aim of this work was to investigate the relationship of these polymorphisms with the activity of the enzyme NTPDase2, in order to understand the differences of nucleotide hydrolysis and virulence previously observed. In this work, the coding region corresponding to ectodomain NTPDase2 from ET and NSL strains was isolated and cloned into a bacterial vector and the sequence corresponding to the ET / NSL-NTPDase2 ectodomain expressed and purified. Analysis of polymorphisms in the sequences indicates that all ET clones present only silent SNPs at positions 861 and 879. In contrast, some NSL clones have a sequence identical to ET and others have SNPs at positions 213, 296, 377, 554 and 1126, changing amino acids at positions 99, 126, 185 and 376. The 3D structure of the proteins, show that most mutations are external to the enzyme and the T376A mutation is located in a predicted region as important for substrate binding. Together, these results raise important questions about the influence of these SNPs on the structure and activity of the enzyme that can guide future experiments in order to elucidate the role of genetic variants for the enzyme NTPDase2 in the phenomena observed for these two strains in L. braziliensis.
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Análise do perfil genético e funcional das citocinas IL-23, IL-17, IL-12 E IFN-γ e suas relações com a osteoporose primária Pós-menopausaLIMA, Camilla Albertina Dantas de 24 February 2017 (has links)
Submitted by Fernanda Rodrigues de Lima (fernanda.rlima@ufpe.br) on 2018-07-12T21:00:45Z
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Previous issue date: 2017-02-24 / A Osteoporose (OP) é uma doença osteometabólica e multifatorial relacionada à fatores genéticos em mais da metade dos casos diagnosticados. Recentes estudos de associação genômica ampla tem confirmado a estreita relação entre homeostase óssea e sistema imune, confirmando a influência de diversas citocinas e suas vias relacionadas à fenótipos característicos da doença. Com objetivo de validar funcionalmente essas descobertas e esclarecer a participação desses genes no desenvolvimento da OP pós-menopausa, o presente trabalho estudou a relação entre polimorfismos de nucleotídeo único (SNP) nos genes IL17A, IL23R, IL12B e IFN-γ e a susceptibilidade à OP e resposta terapêutica, além de validar os genes RPLP0 e B2M como referência para análises funcionais na doença. Adicionalmente, foram realizados ensaios in vitro em células de osteocarcoma (SaOs-2) para estudo do perfil de expressão de citocinas e processos de calcificação. Nossos resultados mostraram os SNPs IL23R +2284 (A>C) (rs10889677), IL17A +672 (G>A) (rs7747909), IL12B +1188 (T>G) (rs3212227) e IFN-γ -1616 (G>A) (rs2069705) associados à alterações em marcadores de turnover ósseo em pacientes em terapia com bisfosfonatos, o IFN-γ rs2069705 associado à susceptibilidade à OP e a citocina IFN-γ aumentando o processo de calcificação em SaOs-2. Após essas análises, podemos demonstrar a importância dos SNPs estudados na susceptibilidade e tomadas de decisões terapêuticas em OP, além de ajudar a esclarecer o papel do IFN-γ no processo de calcificação em células ósseas. / Osteoporosis (OP) is an osteometabolic and multifactorial disease related to genetic factors in more than half of the diagnosed cases. Recent genome-wide association study have confirmed the close relationship between bone homeostasis and the immune system, confirming the influence of several cytokines and their pathways associated with phenotypes OP-related. The aim of this study was to investigate the relationship between single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the IL17A, IL23R, IL12 and IFN-γ genes, to validate these findings and to clarify the role of these genes in postmenopausal OP susceptibility and therapeutic response to OP, besides we validate the RPLP0 and B2M genes as reference to OP functional studies. In addition, in vitro assays were performed in osteocarcoma cells (SaOs-2) to study the cytokine expression profile and calcification processes. Our results showed the SNPs IL23R + 2284 (A> C) (rs10889677), IL17A + 672 (G> A) (rs7747909), IL12B +1188 (T> G) (rs3212227) and IFN-γ (Rs2069705) were associated with bone turnover markers in patients treated with bisphosphonate, IFN-γ rs2069705 was associated with susceptibility to OP and the cytokine IFN-γ with increase in the viability and calcification process of SaOs-2. After these analyzes, we can demonstrate the importance of SNPs studied in the susceptibility and therapeutic decision in OP besides showing the role of IFN-γ in the process of calcification in bone cells.
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Estudos citogenético-moleculares em espécies do gênero Hypostomus (Teleostei, Loricariidae) / Cytogenetic-molecular studies in the species of genus Hypostomus (Teleostei, Loricariidae)Reis, Dinaíza Abadia Rocha 22 February 2016 (has links)
Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2016-08-10T17:26:54Z
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Previous issue date: 2016-02-22 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Loricariidae é uma família encontrada exclusivamente em região Neotropical e possui representantes conhecidos como cascudos. É classificada em sete subfamílias, das quais Hypostominae apresenta o maior número de estudos citogenéticos. Nas subfamílias, o cariótipo e o número diploide apresentam tendências evolutivas diferentes, ao contrário dos fenótipos de RONs, que são características cromossômicas compartilhadas. O gênero Hypostomus é considerado um grupo parafilético, só diagnosticável por simplesiomorfias. H. ancistroides apresenta distribuição natural nas bacias do rio Tietê, do rio Ribeira de Iguape e do Alto rio Paraná. Há indícios que o táxon H. ancistroides represente um complexo de espécies nesta região, pois análises morfológicas prévias revelam diferentes morfotipos em diferentes bacias de sua área de distribuição. O objetivo geral do trabalho foi resgatar as relações evolutivas entre populações de Hypostomus spp. distribuídas na bacia do Alto rio Paraná. Para isso, foram definidos os complementos cromossômicos de cinco populações alopátricas de H. ancistroides utilizando citogenética clássica e molecular e foram inferidas árvores filogenéticas para algumas espécies de Hypostomus. H. aff. ancistroides de São Miguel Arcanjo é uma nova espécie do complexo de espécies. Esta ideia é corroborada pela redução do número diploide apresentado com consequente isolamento reprodutivo, pela existência de um sistema cromossômico sexual e pelo monofiletismo em relação às outras populações de H. ancistroides. Populações de H. ancistroides apresentam polimorfismos na fórmula cariotípica, Ag-RONs e rDNA 5S, reforçando a ideia deste ser um grupo complexo. Além disso, foi possível identificar a dispersão como mecanismo de evolução para esta espécie com base em rDNA 5S, que é um potencial marcador populacional. Existem pelo menos dois grandes grupos dentro do gênero Hypostomus, corroborados por dados morfológicos, cariotípicos e moleculares. As análises filogenéticas realizadas conseguiram validar as simplesiomorfias cromossômicas encontradas entre as espécies. Assim, por se tratar de um grupo recente e muito diverso, as espécies de Hypostomus necessitam de mais estudos para compreensão de sua diversidade e evolução. / Loricariidae is a family found exclusively in the Neotropics and has representatives known as cascudos. Is classified into seven subfamilies, including Hypostominae, which has the highest number of cytogenetic studies. In the subfamilies, the karyotype and diploid number have different evolutionary trends, unlike the NOR phenotypes, which have shared chromosomal characteristics. The Hypostomus genus is considered a paraphyletic group, and is only diagnosable by symplesiomorphy. H. ancistroides has a natural distribution in the basins of the Tietê river, Ribeira de Iguape river and the Upper Paraná river. There is evidence that the H. ancistroides taxon represents a species complex in this region because previous morphological analysis revealed different morphotypes in different basins of their range. The objective of this work was to rescue the evolutionary relationships among populations of Hypostomus spp. distributed in the basins of the Upper Paraná river. For this, chromosomal complements of five allopatric populations of H. ancistroides were defined using classical and molecular cytogenetics, and phylogenetic trees were inferred for some species of Hypostomus. The population of H. aff. ancistroides of the São Miguel Arcanjo is a new species of this complex. This idea is supported by the reduction of the diploid number presented with consequent reproductive isolation, the existence of a sex chromosome system and the monophyletism in relation to other populations of H. ancistroides. H. ancistroides populations showed polymorphisms in the karyotype formula, Ag-NORs and 5S rDNA, reinforcing the idea of this being a complex group. Moreover, the dispersion was identified as the mechanism of evolution for this species based on 5S rDNA, which is a potential population marker. There are at least two larger groups within the genus Hypostomus, which is supported by morphology, karyotype and molecular data. Phylogenetic analysis was able to validate the chromosomal symplesiomorphy found between species. Thus, because it is a recent and very diverse group, species Hypostomus need more studies to understand their diversity and evolution.
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Fatores clínicos, comportamentais, nutricionais, polimorfismo C677T do gene da enzima metilenotetraidrofolato redutase (MTHFR) e risco de câncer de mama.Maia, Yara Cristina de Paiva January 2007 (has links)
Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto. / Submitted by Oliveira Flávia (flavia@sisbin.ufop.br) on 2014-12-16T20:02:51Z
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Previous issue date: 2007 / O Câncer de Mama (CM) é uma doença com taxas de incidência crescentes em diversas partes do mundo e também no Brasil, a qual é causada pela interação de diversos fatores de risco. Foi realizado estudo caso controle, baseado em hospital, mascarado, com 654 mulheres (com CM, controles e com doença benígna da mama) para avaliar as interações entre diversos fatores de risco e a ocorrência de CM. A MTHFR, envolvida no metabolismo do ácido fólico, catalisa a redução da 5,10-MTHF a 5- MTHF que é necessário para a conversão de homocisteína em metionina pela metionina sintase. Uma redução da atividade da MTHFR produz uma enzima termolábil, resultando em um aumento da homocisteína plasmática e do estado de hipometilação genômica. Estudos epidemiológicos sugerem que o polimorfismo do gene da Metilenotetrahidrofolato redutase (MTHFR), C677T, pode modificar o risco para CM. Foi realizada antropometria e aplicados questionários para avaliação de características sócio-demográficas, clínicas, antropométricas, reprodutivas, dietéticas, comportamentais e da freqüência de consumo alimentar (para avaliar a ingestão de ácido fólico, vitaminas B6 e B12). Foi coletado sangue periférico do paciente para extração do DNA. A genotipagem do polimorfismo C677T foi realizada através da técnica PCR-RFLP. Através do modelo logístico criado para explicar a ocorrência do CM de mama na população estudada, foi observado que o sedentarismo, a baixa renda, a não amamentação e a menopausa, ajustados pela idade, uso de CTO, % GC, escolaridade e idade da primeira MMG afetaram de forma estatisticamente significativa o risco para a ocorrência do CM. Mulheres na pré-menopausa que não amamentaram seus filhos apresentaram risco de 2,15 vezes de desenvolver CM em relação às mulheres na pós menopausa. Mulheres etilistas na pós-menopausa apresentaram maior risco de desenvolver CM em relação às mulheres não etilistas na pós menopausa. O consumo de ácido fólico encontrou-se acima da recomendação pré-estabelecida pela RDA, porém foi observado um consumo menor, não significante, no grupo de casos quando comparado com o grupo controle. Foi observado que o consumo de vitamina B6 se encontrava abaixo da recomendação no grupo de casos e, portanto este baixo consumo pode interferir no metabolismo do folato e da enzima da MTHFR. O polimorfismo C677T de MTHFR nem isoladamente nem em associação com fatores comportamentais e dietéticos neste trabalho não foi suficiente para aumentar o risco de CM, diferente do sugerido por resultados de outros trabalhos. ______________________________________________________________________________________________ / ABSTRACT: The breast cancer (BC) is a disease, with increasing incidence rate worldwide and also in Brazil, which is caused by the interaction of different risk factors. A masked casecontrol study was conducted with 654 women (with breast cancer, controls and with benign breast disease) to assess the interaction between several risk factors and the breast cancer occurrence. The methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR), involved in the folic acid metabolism catalyzes the 5,10-MTHF to 5- MTHF reduction, necessary to convert homocystein into methionine by methionine synthase. A reduction in the activity of MTHFR produces a thermo labile enzyme increasing plasma homocysteine and leading to genomic hypomethylation. Epidemiologic studies suggest that the MTHFR C677T gene polymorphism may modify the risk of BC. Anthropometric measures were collected and surveys for evaluation of social-demographic, clinical, behavioral features and food frequency ingestion (folic acid, vitamins B6 and B12) were conducted. Peripheral blood was collected for DNA extraction. The C677T polymorphism genotyping was conducted using a PCR-RFLP protocol. The logistic model created to explain the occurrence of BC has shown that sedentary behavior, low incomings, no breast-feeding and menopause, adjusted by age, oral contraceptive use, %body fat, education level and date of the first mammography has affected the risk for BC occurrence with statistic significance. Women in pre-menopause that did not breast-feed their children has a 2,15 times higher risk of BC compared with women in post-menopause. Alcoholic women in post-menopause presented a higher risk for BC compared to non-alcoholic women in post-menopause. The folic acid ingestion has shown to be higher than the established RDA recommendation, although the BC group presented a lower ingestion compared with the control group. The ingestion of vitamin B6 was lower than the recommendation in the case group, and this low ingestion can interfere in the folate metabolism. In this work, the C677T polymorphism, neither isolated, nor in association with behavioral and dietary factors, has not affected the risk of BC, opposed to results suggested in other works.
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