Th.--Méd.--Reims, 1981. N°: 19.

La polyglobulie (PG) a un arrière plan clinique et physiopathologique varié, et dont la connaissance a beaucoup évolué depuis 5 ans. Elle a pour caractéristique nécessaire et commune une augmentation du volume globulaire total qui peut résulter de mécanismes moléculaires différents. L'érythrocytose est une forme de la PG ou` seule la lignée érythroïde semble être augmentée. Dans ce contexte, nous nous sommes intéressés à la mutation JAK2 (Val617Phe) et aux gènes EPOR, VHL, PHD2 chez des patients présentant une érythrocytose d'origine inconnue (98 familles). Nous avons trouvé 3 nouvelles mutations délétionnelles et d'autres mutations faux-sens et silencieuses sur EPOR. Les cellules FDCP-1 et 32D transfectées, qui expriment les récepteurs tronqués ont montré une hypersensibilité à l'Epo à concentration basse. Les analyses Epo-dose-réponse pour une mutation faux-sens étaient semblables à celles du type sauvage. La mutation JAK2(Val617Phe) était présente avec une faible fréquence dans la série de patients étudiés. La recherche des mutations dans le gène PHD2 nous a permis de trouver 3 nouvelles mutations frame-shift et non-sens, les seules connues à ce jour: Elles entraînent la perte d'une partie ou de l'ensemble du site catalytique de PHD2 dans l'hypothèse où elles seraient synthétisées. Ainsi, ces mutations et les deux autres mutations faux-sens décrites démontrent l'importance de PHD2 dans la régulation de la voie de HIF-α, et qu'une perturbation de cette régulation pourrait conduire à une PG. La majorité des patients reste sans défaut moléculaire identifié, et des recherches complémentaires sont nécessaires. Nous avons également étudié deux Hbs augmentant l'affinité pour l'oxygène: les Hbs Nantes et La Coruña. Enfin, nous avons cherché des mutations dans les 3 exons de DPGM chez 4 patients avec un taux de 2,3-DPG bas. Une seule mutation a été trouvée dans la région 5`, dans l'exon 1 non traduit, elle nécessite des études complémentaires.

La polyglobulie (PG) a un arrière plan clinique et physiopathologique varié, et dont la connaissance a beaucoup évolué depuis 5 ans. Elle a pour caractéristique nécessaire et commune une augmentation du volume globulaire total qui peut résulter de mécanismes moléculaires différents. L'érythrocytose est une forme de la PG ou` seule la lignée érythroïde semble être augmentée. Dans ce contexte, nous nous sommes intéressés à la mutation JAK2 (Val617Phe) et aux gênes EPOR, VHL, PHD2 chez des patients présentant une érythrocytose d'origine inconnue (98 familles). Nous avons trouvé 3 nouvelles mutations délétionnelles et d'autres mutations faux-sens et silencieuses sur EPOR. Les cellules FDCP-1 et 32D transfectées, qui expriment les récepteurs tronqués ont montré une hypersensibilité à l'EPO à concentration basse. Les analyses EPO-dose-réponse pour une mutation faux-sens étaient semblables à celles du type sauvage. La mutation JAK2(Val617Phe) était présente avec une faible fréquence dans la série de patients étudiés. La recherche des mutations dans le gêne PHD2 nous a permis de trouver 3 nouvelles mutations frame-shift et non-sens, les seules connues à ce jour: Elles entraînent la perte d'une partie ou de l'ensemble du site catalytique de PHD2 dans l'hypothèse où elles seraient synthétisées. Ainsi, ces mutations et les deux autres mutations faux-sens décrites démontrent l'importance de PHD2 dans la régulation de la voie de HIF-a, et qu'une perturbation de cette régulation pourrait conduire à une PG. La majorité des patients reste sans défaut moléculaire identifié, et des recherches complémentaires sont nécessaires. Nous avons également étudié deux Hbs augmentant l'affinité pour l'oxygène: les Hbs Nantes et La Coruña. Enfin, nous avons cherché des mutations dans les 3 exons de DPGM chez 4 patients avec un taux de 2,3-DPG bas. Une seule mutation a été trouvée dans la région 5`, dans l'exon 1 non traduit, elle nécessite des études complémentaires. / Polycythemia has a varied clinical and physiopathological background, of which our knowledge has greatly evaluated since 5 years. It is characterised by augmentation of the red cell mass which can be resulted from different molecular mechanisms. Erythrocytosis is a form of polycythemia where only the erythrocytes are augmented. In this context, we looked for the mutation JAK2 (Val617Phe), and other mutations in the genes of EPOR, VHL, PHD2 in a series of patients with erythrocytosis of unknown origin (98 families). We found 3 new frame-shift mutations and other missense and silent mutations in the EPOR. Transfected FDCP-1 and 32D cell lines expressing a truncated EpoR showed increased sensitivity at low concentration of Epo. However, in the case of a missense EPOR mutation, the Epo-dose response assays were similar to that of the wild type. The mutation JAK2 (Val617Phe) was found at a low frequency in the studied patients. Looking for mutations in the PHD2 gene allowed us to find 3 new frame-shift and nonsense mutations, the only reported to date. The encoded PHD2, if synthesized, would lose its active site or a part of it. These mutations with the other two missense mutations reported provide the evidence of the importance of PHD2 in the regulation of HIF-a pathway, and that disturbing the oxygen-sensing pathway might be a cause of polycythemia. The molecular basis of polycythemia in the majority of patients is still to be identified, and complementary studies are necessary. We studied then two examples of Hbs with a high oxygen affinity: Hb Nantes et La Coruña. Finally, we looked for mutations in the 3 exons of DPGM in a series of 4 patients. One mutation in exon 1 in the 5`region was found, and needs further studies.

Les syndromes myéloprolifératifs (SMP) non leucémie myéloïde chronique (LMC) sont des hémopathies myéloïdes chroniques affectant la cellule souche hématopoïétique, pouvant évoluer en leucémie aigüe myéloïde (LAM). Les SMP non LMC incluent la polyglobulie de Vaquez (PV), la thrombocytémie essentielle (TE) et la myélofibrose (MF). La mutation JAK2V617F est retrouvée dans 97% des cas de PV et dans 50% des cas de TE et MF ; elle n'est pas indispensable à la physiopathologie des SMP car JAK2 n'est pas muté à 100%. Afin de progresser dans la compréhension de la physiopathologie des SMP et afin d'identifier de nouveaux marqueurs moléculaires pour le diagnostic, le suivi et le pronostic; nous avons étudié des échantillons de PV, TE, MF ainsi que des LAM post-SMP. Nous avons utilisé des approches moléculaires complémentaires: séquençage, hybridation génomique comparative (CGH-array) et profils d'expression génique. Nous avons identifié des mutations de gènes régulateurs de l'épigénétique (ASXL1, TET2, DNMT3A, SUZ12) et des gènes de la machinerie de l'épissage de l'ARN (SF3B1, SRSF2). Nous avons également identifié que les co-mutations des gènes JAK2 et ASXL1 étaient associées à un mauvais pronostic. Au sein du sous-type MF, nous avons identifié par CGH-array des aberrations du nombre de copies des gènes. Celles-ci contiennent plusieurs gènes candidats susceptibles de participer à la physiopathologie des MF et à l'évolution en LAM (délétion 20q, NF1, ETV6). Nos travaux sur la caractérisation moléculaire des SMP contribuent à l'évolution vers une classification moléculaire avec l'objectif d'une médecine de précision où chaque SMP sera traité en fonction de ses altérations. / Myeloproliferative neoplasms (MPN) are chronic and clonal stem cell myeloid disorders, which can evolve to acute myeloid leukemia (AML). MPN non-chronic myeloid leukemia (CML) include Polycythemia Vera (PV), Essential Thrombocythemia (ET) and Myelofibrosis (MF) (primary or secondary to PV/ET). JAK2V617F mutation is found in 97% of PV and in around half of patients with ET or MF. Nevertheless, this mutation is not essential for MPN physiopathology, because in half of ET/MF cases, JAK2 is not mutated. To progress in the knowledge of MPN physiopathology and in particular of MF; and to find new molecular markers for MPN diagnosis, disease course, and prognosis, we studied several samples of PV, ET, MF and post-AML. We used gene sequencing, array-Comparative Genomic Hybridization (aCGH) and gene expression analyses. We identified several mutations in genes implicated in Epigenetic regulation (ASXL1, TET2, DNMT3A, SUZ12) and in genes implicated in the RNA splicing machinery (SF3B1, SRSF2). We also found that JAK2 and ASXL1 co-mutation is associated with a poor prognosis. In MF, we found by aCGH several copy number aberrations that involve potential leukemogenic genes. Our gene expression data support the hypothesis that PV, ET and MF are a continuum of the same pathology. Our results on molecular characterization help establish a new molecular classification of MPNs with the objective personalized treatment where each MPN will be treated depending on the alterations present in the myeloid cell genome.

Caractérisée par la présence de la mutation JAK2 V617F, la polyglobulie primitive voit son développement contenu par des saignées mais est associée à une incidence plus élevée de cancers. Une exploration globale de l'immunité des patients a été réalisée par la quantification des sous populations lymphocytaires de l'immunité innée et adaptative. Ceci a permis la mise en évidence d'une diminution des lymphocytes B et d'une augmentation des cellules NK. Les cellules NK sont réputées pour leurs propriétés antitumorales mais elles ne sont pourtant pas capables d'éradiquer la PV, posant la question de leurs capacités fonctionnelles. Si les cellules NK des patients présentent une activité cytotoxique basale inférieure aux témoins, elles ne présentent pas d'anomalies de l'expression de leurs récepteurs, de la production de molécules cytolytiques ou de prolifération. Par contre, les cellules NK d'un patient ayant développé une érythroleucémie ou des cellules NK de sujets âgés par rapport à des témoins plus jeunes présentent des anomalies d'expression des récepteurs. L'augmentation des cellules NK pourrait être liée à la mutation JAK2 V617F. Si cette mutation est présente dans les lymphocytes de tous les patients, il existe des arguments pour sa présence dans les cellules NK de certains patients. Enfin, une analyse transcriptomique a permis de définir un profil d'expression propre aux cellules NK des patients. / Characterized by the presence of the JAK2 V617F mutation, polycythemia vera's development is content by phlebotomy but is associated with a higher incidence of cancer. A global exploration of the immunity of patients was performed by quantification of lymphocyte subpopulations of innate and adaptive immunity. This allowed the detection of a decrease in B cells and an increase in NK cells. NK cells are known for their antitumor properties but they are not yet able to eradicate PV, raising the question of their functional abilities. If NK cells of patients have a lower basal cytotoxic activity than healthy donors, they do not show abnormal expression of their receptors, the production of cytolytic molecules or proliferation. On the contrary, NK cells from a patient who developed erythroleukemia or NK cells from elderly healthy donors compared with younger healthy donors exhibit abnormalities of receptors expression. The increase in NK cells could be related to the JAK2 V617F mutation. If the mutation is present in cells of all patients, there are arguments for its presence in the NK cells of some patients. Finally, transcriptome analysis has identified an expression profile specific to NK cells of patients.

Les néoplasies myéloprolifératives (NMP) sont des hémopathies myéloïdes clonales, chroniques et prolifératives. Les plus fréquentes sont la polyglobulie de Vaquez et la thrombocytémie essentielle. Elles s’accompagnent de risques importants de thrombose (artérielles et veineuses) et de transformation en pathologies plus agressives (myélofibrose secondaire et leucémie aigüe). Les thromboses peuvent être la situation diagnostique de ces maladies, ou survenir au cours de la prise en charge. Le sujet de cette thèse est d’étudier la relation clinique entre NMP et thrombose. Dans un contexte de survenue de thrombose veineuse idiopathique, sans antécédent NMP, nous nous sommes intéressés à la recherche de mutation clonale chez les patients comme moyen diagnostique d’une NMP. Nous avons ainsi exploité la cohorte EDITH du CIC en prenant les patients ayant expérimentés un puis une récurrence thrombotique. A l’inverse, nous avons constitué une base de données (OBENE) des patients pris en charge pour une NMP au CHRU de Brest.Nous avons ensuite exploité cette base, en analysant la fréquence et l’impact des arythmies cardiaques auriculaires, la balance bénéfice-risque à l’utilisation des NACO, l’impact des statines sur la réduction du risque de thrombose ainsi que la fréquence et l’impact de la nonadhérence aux traitements dans les PV et TE.NMP et thromboses sont liées, il est donc nécessaire d’approfondir les connaissances de leur physiopathologie spécifique pour améliorer la prévention et le traitement des épisodes. Cette thèse amène quelques réponses àcertaines questions mais elle est surtout le point de départ de réflexion commune entre les praticiens et biologistes intéressés par ces domaines. / The myeloproliferative neoplasms (MPN) are clonal myeloid, chronic and proliferative disorders. The most frequent are polycythemia vera and essential thrombocythemia. The more frequent complications are thromboses (arterial and venous) and phenotypic evolutions (secondary myelofibrosis and acute leukemia). Thromboses can be a situation of diagnosis or observed during the followup of a MPN. This thesis is focused on the clinical link between MPN and thromboses.In a context of idiopathic venous thromboses (first event or recurrence), without medical history of MPN, we have tested patients for the most frequent MPN clonal mutations. So, we have used the informations and patients of the dedicated EDITH cohort.On the other hand, we have constituted a MPN database (OBENE) of the patients diagnosed for MPN in our Hospitalcentre. By this way, we have analysed the frequency and impact of atrial arrhythmias, the benefit-risk balance of the use of DOAC, the impact of statins to reduce the thrombotic risk and the frequency and impact of the treatment nonadherence in this population.MPN and thromboses are linked, so it is necessary to increase our knowledge of their physiopathology to improve prevention and treatment of the events. This thesis brings some answers to some questions but, she is almost the starting point of common reflexion between clinicians and biologists interested in these domains.

Les dernières avancées dans les traitements des hémopathies aboutissent à un meilleurs taux de rémission complète ainsi qu' à de meilleurs taux de survie après traitement. Cependant les risques de rechutes restent élevés. Notre projet s'inscrit dans la compréhension du rôle des cellules NK dans l'évolution de ce type de pathologies. Dans une première partie nous nous sommes intéressés à la polyglobulie de Vaquez. Cette pathologie présente une évolution lente et progressive, et elle est caractérisée par une mutation de JAK2 présente dans la lignée myéloïde chez plus de 95% des patients. Nous avons cherché à détecter la mutation dans les cellules NK de patients, puis, pour savoir si la mutation avait un effet sur les NK, nous avons exploré leurs fonctions in vitro. Nos résultats ont montré que, bien que la mutation soit présente dans les cellules NK, elle ne semble pas avoir d'impact sur les fonctions des cellules NK que nous avons pu tester. Nous en avons conclu que l'évolution de la polyglobulie de Vaquez en leucémie n'était peut-être pas due à une perte de fonction des NK mais plutôt à leur inhibition par l'environnement cellulaire.Dans une deuxième partie nous avons étudié la régulation des natural cytotoxicity receptors dans la leucémie aiguë myéloïde. D'apres des travaux antérieurs nous avons émis l'hypothèse que l'expression des trois NCR aurait une régulation commune s'effectuant au niveau de transcription de leurs gènes. Nos recherches bio-informatiques ainsi que notre expérimentation d'immunoprécipitation de la chromatine (Chip) montrent que le facteur de transcription ETS-1 semble être impliqué dans la régulation commune aux trois NCR. / The latest advances in blood disorders treatments lead to a better complete remission rate and a better survival rate after treatment. However, the risk of relapse remains high. Our project is included in the understanding of NK cells role in the development of these diseases.In a first part, we focused on polycythemia Vera for several reasons: the pathology has a slowly progressive disease, and it is characterized by the presence of JAK2 mutation for > 95% patients. We wanted to know if this mutation was found in NK cells from PV patients and what effects the mutation had on NK cells functions. Our results have shown that although the mutation was found in NK cells, it appears to have no impact on NK cells functions. We conclude that the evolution of PV to leukemia is not due to a loss of NK cell functions but to their inhibition by cellular environment.In a second part, we investigated the regulation of natural cytotoxicity receptors in acute myeloid leukemia because previous works have shown that NCR are weakly expressed in AML patients, that this down-regulation is acquired during evolution of AML and reversible after complete remission, ant that NCR weak expression is related to poor prognosis. We supposed that the expression of the three NCR has a common regulation at genes transcription level. Our bioinformatic researches and our experiment of chromatin immunoprecipitation show that ETS-1 transcription factor is a good candidate involved in the common regulation of the three NCR.