En cas de carence azotée, les légumineuses sont capables de mettre en place une symbiose avec des bactéries du sol fixatrices d’azote appelées rhizobia. Cette symbiose a lieu dans un organe appelé nodosité où les bactéries sont endocytées et appelées bactéroïdes. Certains clades de légumineuses imposent un processus de différenciation à leurs bactéroïdes qui agrandissent considérablement et deviennent polyploïdes, menant à des morphotypes bactériens allongés ou sphériques. Au cours de cette thèse, j’ai étudié la différenciation des bactéroïdes de Bradyrhizobium spp. en association avec Aeschynomene spp.. Les bactéroïdes de ces plantes présentent des degrés de différenciation distincts qui dépendent de l’espèce hôte. Mes données suggèrent que les bactéroïdes les plus différenciés sont aussi les plus efficaces. J’ai cherché à savoir quels facteurs procaryotes pourraient être impliqués dans les adaptations des bactéroïdes au processus de différenciation et à leurs divers hôtes, le tout en lien avec cette différence d’efficacité symbiotique au travers d’approches globales sans a priori de type -omiques. Les conditions considérées sont des bactéroïdes de différents morphotypes et des cultures libres de référence. Les fonctions activées en conditions symbiotiques ont été identifiées, ainsi que les gènes spécifiques d’un hôte donné. Des analyses fonctionnelles des gènes d’intérêt ont également été menées. Les mutants bactériens n’ont toutefois pas présenté de phénotype symbiotique drastique, montrant ainsi l’existence de réseaux de gènes complexes menant à la résilience des génomes de rhizobia. / In case of nitrogen starvation, legume plants establish a symbiotic interaction with nitrogen-fixing soil bacteria called rhizobia. This interaction takes place in nodules where the symbionts are internalized and become bacteroids. Some legume clades also impose a differentiation process onto the bacteroids which become enlarged and polyploid, leading to elongated or spherical morphotypes. During my PhD work, I have studied bacteroid differentiation of Bradyrhizobium species in association with Aeschynomene spp.. These bacteroids display distinct differentiation levels depending on the plant host, and my analyses suggest that the most differentiated ones are also the most efficient. I investigated the bacterial factors potentially involved in the adaptations to differentiation and host-specificity, and related to the higher efficiency of the most differentiated bacteroids using global-omics approaches without a priori. The analyzed conditions were bacteroids of distinct morphotypes and free-living reference cultures. Activated functions under symbiotic conditions were identified, as well as host-specific ones. Functional analyses were performed on genes of interest. However, the bacterial mutants did not display drastic symbiotic phenotypes, showing the existence of complex gene networks leading to high resilience of rhizobial genomes.

Les légumineuses peuvent interagir avec les bactéries du sol de la famille des Rhizobiaceae. Cette interaction aboutit à la formation d'un organe spécialisé appelé nodosité. Au sein des cellules symbiotiques des nodosités, les rhizobia sont capables de fixer l'azote atmosphérique et de la convertir en ammoniac, qui est une source d'azote assimilable par les plantes. Chez la Légumineuse Medicago truncatula, les cellules symbiotiques produisent une large famille de peptides riches en cystéines appelées (NCRs) spécifiquement exprimés dans les nodosités. Ces NCRs induisent la différenciation des bactéroïdes qui se traduit par un allongement cellulaire couplé à une forte endoréplication du génome (les bactéroïdes deviennent polyploïdes) contribuant ainsi à une augmentation importante de la taille des cellules, ainsi qu’une perméabilité membranaire accrue et une perte de toute capacité reproductrice. Les peptides NCRs ressemblent à des défensines, des peptides antimicrobiens, acteurs clés de l’immunité innée. L'analyse de l'expression de 334 gènes NCR dans 267 différentes conditions expérimentales en utilisant la base de données MtGEA (Medicago truncatula Gene Expression Atlas) a révélé que l'ensemble des gènes NCR testés (sauf quatre) n'est exprimé que dans les nodosités, ils ne sont pas exprimés dans d’autres organes de la plante, ni lors d’une infection par des agents pathogènes. De plus l’expression des NCRs n’est induite en réponse à aucune interaction biotique ou abiotique testée ou à des facteurs Nod. Les gènes NCR sont activés en vagues successives au cours de l’organogenèse nodulaire et ce profil temporel est en corrélation avec une localisation spatiale spécifique de leurs transcrit de la zone apicale à la partie proximale de nodosités. En outre, nous avons montré que les NCRs ne sont pas induites pendant la sénescence des nodules. Ces analyses expérimentales ensemble avec des calculs d’entropie de Shannon, une métric pour la spécificité d’expression, montrent que les gènes NCR sont parmi les gènes les plus fortement et le plus spécifiquement exprimés chez M. truncatula. Ainsi, l'expression des NCRs est soumise à une régulation extrêmement stricte et ils sont activés exclusivement pendant l’organogenèse et au cours du développement nodulaire dans les cellules symbiotiques polyploïdes. Cette analyse a suggéré l'implication de la régulation épigénétique des gènes NCR. La formation des cellules symbiotiques s'exerce par une endoreplication et est associée à une reprogrammation transcriptionnelle. En utilisant le tri par cytométrie en flux des noyaux, en fonction de leur contenu en ADN, nous avons montré que les vagues transcriptionnelles sont en correlation avec les niveaux croissants de ploïdie et resultent des modifications épigénétiques durant les cycles d’endoréplication. Nous avons étudié la méthylation de l'ADN génomique et l'accessibilité à la chromatine, ainsi que la présence des marqueurs répresseurs (H3K27me3) ou activateurs transcriptionnels (H3K9ac) sur des gènes spécifiques des nodosités. La méthylation différentielle de l'ADN n'a été trouvée que dans un petit sous-ensemble de gènes symbiotiques spécifiques aux nodosités. Néanmoins, plus que la moitié des gènes NCR était différentiellement méthyles. D'autre part, l'expression des gènes était corrélée avec la décondensation de la chromatine (ouverture), un enrichissement du marqueur H3K9ac et une diminution du marqueur H3K27me3. Nos résultats suggèrent que l’endoréplication, pendant la différenciation cellulaire dans les nodosités, fasse partie des mécanismes qui lèvent l’inactivation transcriptionnelle des gènes spécifiques des nodosités, ceci résultant de modifications des codes épigénétiques au niveau de la chromatine. / Legume plants are able to interact with soil bacteria from the Rhizobiaceae family. This interaction leads to the development of a specialized organ called root nodule. Inside the symbiotic nodule cells, rhizobia are capable to fix atmospheric nitrogen and convert it to ammonia, which is a usable nitrogen source for the plant. In the legume Medicago truncatula the symbiotic cells produce high amounts of Nodule-Specific Cysteine-Rich (NCR) peptides which induce differentiation of the rhizobia into enlarged, polyploid and non-cultivable bacterial cells. NCRs are similar to innate immunity antimicrobial peptides. The NCR gene family is extremely large in Medicago with about 600 genes. The expression analysis of 334 NCR genes in 267 different experimental conditions using the Medicago truncatula Gene Expression Atlas (MtGEA) revealed that all the NCR genes except five are exclusively expressed in nodules. No NCR expression is induced in any other plant organ or in response to biotic, abiotic stress tested or to Nod factors. The NCR genes are activated in consecutive waves during nodule organogenesis, which correlated with a specific spatial localization of their transcripts from the apical to the proximal nodule zones. Moreover, we showed that NCRs are not induced during nodule senescence. According to their Shannon entropy, a metric for tissue specificity, NCR genes are among the most specifically and highest expressed genes in M. truncatula. Thus, NCR gene expression is subject to an extreme tight regulation since they are only activated during nodule organogenesis in the polyploid symbiotic cells. This analysis suggested the involvement of epigenetic regulation of the NCR genes. The formation of the symbiotic cells is driven by endoreduplication and is associated with transcriptional reprogramming. Using sorted nodule nuclei according to their DNA content, we demonstrated that the transcriptional waves correlate with growing ploidy levels and investigated how the epigenome changes during endoreduplication cycles. We studied genome-wide DNA methylation and chromatin accessibility as well as the presence of repressive H3K27me3 and activating H3K9ac histone tail modifications on selected genes. Differential DNA methylation was found only in a small subset of symbiotic nodule-specific genes, including over half of the NCR genes, while in most genes DNA methylation was unaffected by the ploidy levels and was independent of the genes’ active or repressed state. On the other hand, expression of these genes correlated with ploidy-dependent opening of the chromatin and in a subset of tested genes with reduced H3K27me3 levels combined with enhanced H3K9ac levels. Our results suggest that endoreduplication-dependent epigenetic changes contribute to transcriptional reprogramming in differentiation of symbiotic cells.

Les dérivés du platine (i.e. cisplatine et oxaliplatine) représentent une des classes pharmacologiques les plus utilisées en oncologie, notamment dans les cancers colorectaux. Cependant, leur efficacité est limitée par l’émergence de résistances acquises. Nous avons alors étudié in vitro dans différentes lignées cancéreuses coliques humaines (HCT116, LoVo, SW480, HT29) les conséquences à long terme des dérivés du platine lorsqu’ils sont utilisés dans des conditions tenant compte de la sensibilité cellulaire. Ils provoquent des cassures double-brin (objectivées par l’expression de -H2AX), dont le taux dépend du système p53/p21, du complexe MRN et du niveau de stabilité microsatellitaire. Ils induisent aux plus fortes concentrations ( IC50), une cytostase qui s’accompagne de la formation de cellules géantes macrocytaires et endopolyploïdes, dont certaines acquièrent un phénotype sénescent. Dans le même temps, l’activation des mécanismes de réparation des CDB varie en fonction du dérivé du Pt et de la lignée considérée. A plus long terme, des cellules « résistantes » se développent : elles ont une ploïdie normale, et se caractérisent par une plus grande résistance aux dérivés du platine et la présence de novo d’anomalies chromosomiques récurrentes leur conférant un avantage sélectif potentiel en terme de prolifération. Ces mécanismes pourraient contribuer à expliquer en clinique la survenue d’une résistance à une chimiothérapie pourtant initialement efficace. Parallèlement, nous avons évalué in vitro et in vivo de nouveaux complexes de platine obtenus par pharmacomodulation, et associant un noyau intercalant dérivé de la phénanthroline ou de l’acridine. Les résultats in vitro montrent globalement une amélioration significative de la cytotoxicité. Toutefois, un des composés les plus cytotoxiques in vitro, le [(5,6-diméthyl-1,10-phénanthroline) (S,S-diaminocyclohexane)platine(II)], n’exerce pas d’effet antitumoral dans un modèle syngénique de cancer colique chez le rat BD-IX, mais montre une néphrotoxicité marquée. Ces données soulignent l’insuffisance du criblage in vitro et la discordance in vitro/in vivo. / Platinum compounds (i.e. cisplatin and oxaliplatin) represent a class of DNA-damaging agents widely used in clinic especially in the treatment of colorectal cancer. However, their effectiveness is restricted because of emergence of acquired resistance. Therefore, long-term effects of platinum compounds, used at conditions reflecting the in vitro cellular sensibility, were assessed in vitro in several human colon cancer cell lines (HCT116, LoVo, SW480, HT29). Their cytotoxicity is related to double-strand break formation (objectived by -H2AX expression), which depends on p53/p21 status, MRN complex and microsatellite stability of the cell line. Furthermore, at the highest concentrations ( IC50), cells stopped their proliferation and exhibited phenotypic alterations resulting from progressive polyploidy and/or senescence. In the same time, DNA repair systems are activated differently according to the platinum derivate and the cell line. At later stages, cells that are more resistant to platinum compounds than their parental counterpart emerged. They have recovered their basal level of ploidy and acquired de novo recurrent chromosomal aberrations. Such mechanisms could contribute to the recurrence of clinical malignancies, even after an effective initial response to chemotherapy. On the other hand, pharmacological evaluation of new platinum compounds with phenanthroline or acridine intercalating ligand was performed in vitro and in vivo. Globally, many compounds exhibited a higher cytotoxic effect than cisplatin or oxaliplatin in all cell lines studied. Unfortunately, in vivo investigations of one of the most cytotoxic compounds ([(5,6-dimethyl-1,10-phenanthroline) (S,S-diaminocyclohexane)platinum(II)]) did not exhibit antitumor effect in BD-IX rats bearing peritoneal carcinomatosis, whatever the route of administration used (systemic or local), but it displayed nephrotoxicity. These results query the in vitro/in vivo correlation and reconsider the place of the in vivo screening.