Thèse doctorat : Chimie Informatique et Théorique : Nancy 1 : 2006. / Titre provenant de l'écran-titre.

Thèse de doctorat : Sciences Chimiques. Chémogénomique : Strasbourg : 2009. / Thèse soutenue sur un ensemble de travaux. Titre provenant de l'écran-titre. Notes bibliogr.

Les DYRKs (dual specificity, tyrosine phosphorylation regulated Kinases) et CLKs (cdc2-like kinases) sont deux familles de kinases du groupe CMGC. Elles sont impliquées dans le développement de la maladie d'Alzheimer et de la trisomie 21. Nous présentons ici une optimisation et une caractérisation biologique détaillée des Leucettines, une famille d’inhibiteurs pharmacologiques de DYRKs/CLKs dérivés de la Leucettamine B, un alcaloïde extrait d'une éponge marine. Nous avons étudié la relation structure/activité de cette classe d'inhibiteurs sur un ensemble de réponses biologiques. Afin d'étudier les cibles potentielles de ces inhibiteurs, nous avons mis en œuvre une méthode de chromatographie d’affinité. La sélectivité de la Leucettine L41, sélectionnée comme représentative des Leucettines, a été étudiée par des essais d'activité et d'interaction de kinases recombinantes in vitro, et des tests de chromatographie d'affinité (Leucettines immobilisées sur billes d'agarose, compétition sur billes d’inhibiteurs non sélectifs). Des approches transcriptomiques et protéomiques ont été utilisées afin de mieux comprendre le mécanisme d'action cellulaire de la Leucettine L41. Ces approches ont confirmé la sélectivité de la Leucettine L41 pour DYRKs et CLKs mais aussi révélé l’existence de cibles secondaires intéressantes. La Leucettine L41 module l'épissage alternatif de pré-ARNm. Elle présente des propriétés neuroprotectrices vis-à-vis de la mort cellulaire induite par le glutamate. Les Leucettines méritent un développement en tant qu'agents thérapeutiques potentiels pour le traitement de la maladie d'Alzheimer et de la trisomie 21. / DYRKs (dual specificity, tyrosine phosphorylation regulated kinases) and CLKs (cdc2-like kinases) are two families of kinases belonging to the CMGC group. They are involved in the development of Alzheimer's disease and Down syndrome. We here present the optimization and a detailed biological characterization of Leucettines, a family of pharmacological inhibitors of DYRKs/CLKs derived from Leucettamine B, an alkaloid produced by a marine sponge. We studied the structure/activity relationship of this class of inhibitors on a set of biological responses. To investigate potential targets of these inhibitors, we implemented an affinity chromatography method. The selectivity of Leucettine L41, selected as a representative Leucettine, was studied by in vitro activity and interaction assays of recombinant kinases and affinity chromatography approaches (Leucettines immobilized on agarose beads, competition on non-selective inhibitors). Transcriptomics and proteomics approaches were used to better understand the cellular mechanism of action of Leucettine L41. These approaches confirmed the selectivity of Leucettine L41 for DYRKs and CLKs but also revealed the existence of interesting secondary targets. Leucettine L41 modulates alternative splicing of pre-mRNAs. It displays neuroprotective properties towards glutamate-induced cell death. Leucettines deserve further development as potential therapeutic agents for the treatment of Alzheimer's disease and Down syndrome.

Le carcinome hépatocellulaire (HCC) est le cancer du foie le plus répandu et représente la seconde cause de décès par cancer dans le monde. Un mauvais pronostic et l'absence de traitement efficace en font un problème majeur de santé publique dans les pays en voie de développement, notamment en Asie du Sud-Est, justifiant pleinement la recherche de molécules ou d'approches thérapeutiques nouvelles contre l'HCC. Ce travail porte sur la recherche de molécules isolées de plantes vietnamiennes actives contre l'HCC. La première approche a consisté en un criblage pharmacologique de 33 substances naturelles qui a conduit à l'identification de 7 ent-kaurane diterpénoïdes isolés de Croton kongensis Gagnep. présentant des propriétés antiprolifératives originales. La seconde approche, par criblage in silico d'une banque de 354 substances naturelles, a permis d'identifier la solasonine comme inhibiteur de l'interaction mortalin - p53 induisant l'apoptose dans la lignée cellulaire humaine HepG2. / Human hepatocellular carcinoma (HCC) is the most common type of liver cancer, the second most common cause of death from cancer worldwide. A very poor prognosis and a lack of effective treatments make liver cancer a major public health problem, notably in less developed regions, particularly in Eastern Asia. This fully justifies the search of new molecules and therapeutic strategies against HCC. The present work focused on finding bioactive compounds from Vietnamese plants against HCC. The first approach used classical screening of 33 natural compounds which resulted in the identification of 7 ent-kaurane diterpenoids isolated from Croton kongensis Gagnep. as potential agents. The second approach aimed at identifying molecules that could abrogate the interaction between Mortalin and p53 by in silico screening of a database of 354 natural compounds, which allowed the identification of Solasonine as a potent inhibitor of p53 - mortalin interactions.

La détection d'interactions biologiques est un des enjeux majeurs de différents domaines tels que le diagnostic médical ou le criblage de médicaments. L'objectif de ce travail est le développement d'une technique de biodétection sans marquage basée sur la diffraction d'un réseau de lignes submicroniques composées de biomolécules. Pour cela, nous développons un modèle optique permettant de simuler la réponse de biocapteurs diffractifs qui détermine les paramètres clefs adaptés à une détection optimale. Nous démontrons l'application de cette technologie à la détection de deux interactions biochimiques différentes, l'une représentant le domaine du diagnostic, l'autre celui du criblage pharmacologique. En se basant sur ces résultats, une corrélation avec le modèle développé est effectuée. Nous proposons aussi un procédé parallèle de dépôt par tamponnage moléculaire de différentes biomolécules en une seule étape, intégré dans le système de détection. Une réflexion sur le rôle et l'impact au niveau du citoyen de cette technologie, et plus généralement des nanotechnologies, est présentée.

Les dérivés du platine (i.e. cisplatine et oxaliplatine) représentent une des classes pharmacologiques les plus utilisées en oncologie, notamment dans les cancers colorectaux. Cependant, leur efficacité est limitée par l’émergence de résistances acquises. Nous avons alors étudié in vitro dans différentes lignées cancéreuses coliques humaines (HCT116, LoVo, SW480, HT29) les conséquences à long terme des dérivés du platine lorsqu’ils sont utilisés dans des conditions tenant compte de la sensibilité cellulaire. Ils provoquent des cassures double-brin (objectivées par l’expression de -H2AX), dont le taux dépend du système p53/p21, du complexe MRN et du niveau de stabilité microsatellitaire. Ils induisent aux plus fortes concentrations ( IC50), une cytostase qui s’accompagne de la formation de cellules géantes macrocytaires et endopolyploïdes, dont certaines acquièrent un phénotype sénescent. Dans le même temps, l’activation des mécanismes de réparation des CDB varie en fonction du dérivé du Pt et de la lignée considérée. A plus long terme, des cellules « résistantes » se développent : elles ont une ploïdie normale, et se caractérisent par une plus grande résistance aux dérivés du platine et la présence de novo d’anomalies chromosomiques récurrentes leur conférant un avantage sélectif potentiel en terme de prolifération. Ces mécanismes pourraient contribuer à expliquer en clinique la survenue d’une résistance à une chimiothérapie pourtant initialement efficace. Parallèlement, nous avons évalué in vitro et in vivo de nouveaux complexes de platine obtenus par pharmacomodulation, et associant un noyau intercalant dérivé de la phénanthroline ou de l’acridine. Les résultats in vitro montrent globalement une amélioration significative de la cytotoxicité. Toutefois, un des composés les plus cytotoxiques in vitro, le [(5,6-diméthyl-1,10-phénanthroline) (S,S-diaminocyclohexane)platine(II)], n’exerce pas d’effet antitumoral dans un modèle syngénique de cancer colique chez le rat BD-IX, mais montre une néphrotoxicité marquée. Ces données soulignent l’insuffisance du criblage in vitro et la discordance in vitro/in vivo. / Platinum compounds (i.e. cisplatin and oxaliplatin) represent a class of DNA-damaging agents widely used in clinic especially in the treatment of colorectal cancer. However, their effectiveness is restricted because of emergence of acquired resistance. Therefore, long-term effects of platinum compounds, used at conditions reflecting the in vitro cellular sensibility, were assessed in vitro in several human colon cancer cell lines (HCT116, LoVo, SW480, HT29). Their cytotoxicity is related to double-strand break formation (objectived by -H2AX expression), which depends on p53/p21 status, MRN complex and microsatellite stability of the cell line. Furthermore, at the highest concentrations ( IC50), cells stopped their proliferation and exhibited phenotypic alterations resulting from progressive polyploidy and/or senescence. In the same time, DNA repair systems are activated differently according to the platinum derivate and the cell line. At later stages, cells that are more resistant to platinum compounds than their parental counterpart emerged. They have recovered their basal level of ploidy and acquired de novo recurrent chromosomal aberrations. Such mechanisms could contribute to the recurrence of clinical malignancies, even after an effective initial response to chemotherapy. On the other hand, pharmacological evaluation of new platinum compounds with phenanthroline or acridine intercalating ligand was performed in vitro and in vivo. Globally, many compounds exhibited a higher cytotoxic effect than cisplatin or oxaliplatin in all cell lines studied. Unfortunately, in vivo investigations of one of the most cytotoxic compounds ([(5,6-dimethyl-1,10-phenanthroline) (S,S-diaminocyclohexane)platinum(II)]) did not exhibit antitumor effect in BD-IX rats bearing peritoneal carcinomatosis, whatever the route of administration used (systemic or local), but it displayed nephrotoxicity. These results query the in vitro/in vivo correlation and reconsider the place of the in vivo screening.

L’ataxie spinocérébelleuse de type 3, aussi connue en tant que la maladie de Machado-Joseph (MMJ), est une maladie qui se développe lorsqu’il y a une expansion des trinucléotides CAG dans la région codante du gène ATXN3. Ce dernier code pour la protéine ATXN3, une enzyme désubiquitinante avec des fonctions essentielles dans le maintien et la stabilisation de l’homéostasie protéique, la résistance au stress, la régulation de la transcription, la réparation de l’ADN, l’organisation du cytosquelette et la régulation de la myogenèse. Les principaux symptômes associés à cette maladie sont l’ataxie (le symptôme clé), une détérioration motrice progressive, la dystonie, la spasticité et la rigidité. Du fait de l’absence de thérapie spécifique et efficace pour traiter les individus atteints de la MMJ, l’approfondissement des connaissances liées à cette maladie est nécessaire. Le but de cette thèse est de comprendre davantage les mécanismes et voies de signalisations impliqués dans la pathologie de la MMJ. Pour atteindre cet objectif, à partir de notre modèle transgénique C. elegans MMJ, deux différents criblages ont été effectués : un criblage non biaisé de 3942 composés, et un criblage de modificateurs génétiques à base d’ARN interférent (ARNi) de 387 clones de facteurs de transcription. Le premier criblage nous a permis d’identifier cinq molécules prometteuses : l’alfacalcidol, le chenodiol, le cyclophosphamide, le fenbufen et le sulfaphenazole. Elles ont permis la restauration du défaut de la motilité, la protection contre la neurodégénérescence, et une augmentation de la durée de vie réduite chez les vers mutants. Trois parmi ces molécules, le chenodiol, le fenbufen et le sulfaphenazole ont démontré une nécessité de la présence de HLH-30/TFEB, un régulateur clé de l’autophagie et de la biogenèse lysosomale, pour leurs propriétés neuroprotectrices. Concernant le deuxième criblage, il nous a permis d’identifier un nouveau gène candidat impliqué dans la MMJ, fkh-2/FOXG1. L’inactivation de ce gène a entraîné une aggravation du défaut de la motilité, de la neurodégénérescence, et de la longévité réduite. À l’inverse, sa surexpression a restauré tous ces phénotypes, suggérant ainsi un rôle neuroprotecteur pour FKH-2/FOXG1 dans la MMJ. Le modèle C. elegans de MMJ et les criblages sont des outils puissants permettant un approfondissement des connaissances quant à la pathologie de la MMJ. Pour cette thèse, par l’identification des molécules neuroprotectrices et les facteurs de transcription HLH-30/TFEB et FKH-2/FOXG1, ayant des activités neuroprotectrices dans notre modèle lorsqu’ils sont surexprimés, il a été possible à mieux comprendre la pathologie de la MMJ, ainsi que les mécanismes et les voies de signalisation qui y sont impliqués. Ces découvertes sont prometteuses à investiguer dans des organismes modèles plus avancés, des applications précliniques et également, pour le développement de nouvelles interventions thérapeutiques pour la MMJ. / Spinocerebellar ataxia type 3, also known as Machado-Joseph disease (MJD), is a polyglutamine expansion disease arising from a trinucleotide CAG repeat expansion in the coding region of ATXN3. This gene encodes ATXN3 protein, a deubiquitinating enzyme, which is involved in protein homeostasis maintenance and stabilization, stress resistance, transcription regulation, DNA repair, cytoskeleton organisation and myogenesis regulation. The main symptoms associated with this disease are ataxia (the key symptom), progressive motor deterioration, dystonia, spasticity and stiffness. Due to our incomplete understanding of mechanisms and molecular pathways related to this disease, there are no therapies that successfully treat core MJD patients. Therefore, the identification of new candidate targets related to this disease is needed. The aim of this thesis is to gain insights into the pathways and mechanisms leading to MJD. In order to achieve this goal, we performed two different screens, a blind drug screen of 3942 compounds to identify protective small molecules, and a large-scale RNA interference (RNAi) screen of 387 transcription factor genes leading to identification of modifiers involved in our transgenic C. elegans MJD model. The first screen allowed us to identify five lead compounds restoring motility, protecting against neurodegeneration, and increasing the lifespan in mutant worms. These compounds were alfacalcidol, chenodiol, cyclophosphamide, fenbufen and sulfaphenazole. We then found that three of these compounds, chenodiol, fenbufen and sulfaphenazole required HLH-30/TFEB, a key transcriptional regulator of the autophagy and the lysosomal biogenesis, to complete their neuroprotective activities. The second screen brought us to identify a news hit gene candidate involved in MJD, fkh-2/FOXG1. We showed that inactivation of this gene enhanced the motility defect, neurodegeneration and reduced longevity in our MJD model. However, in opposite, its overexpression rescued all these phenotypes, suggesting a neuroprotective role for FKH-2/FOXG1 in MJD when overexpressed. C. elegans models for MJD and the screenings are promising tools to understand the mechanisms and pathways causing neurodegeneration, leading to MJD. In this study, we identified positively acting compounds that may be promising candidates for investigation in mammalian models of MJD and preclinical applications in the treatment of this disease. Also, we gained insights into the pathways of MJD and found that HLH-30/TFEB and FKH-2/FOXG1 are both implicated in MJD and have neuroprotective activities when they are overexpressed. These promising findings may aid the development of novel therapeutic interventions for MJD.