Supplementary Information Video attached / <p> Machado-Joseph disease (MJD), also known as Spinocerebellar ataxia type 3 (SCA3) is one of nine poly glutamine neurodegenerative diseases caused by an expansion of CAG DNA triplets in the genes resulting in an expanded poly glutamine tract in the expressed proteins. These proteins are unrelated in function yet all manifest as specific neurological diseases. The Truant lab and others have previously shown that six of the nine polyglutamine proteins display nucleocytoplasmic shuttling capabilities and that this shuttling is affected by polyglutamine expansion. It is believed that deciphering the mechanism of nucleocytoplasmic transport may be important in understanding the normal function of these proteins, which in turn may lead to a better understanding of the pathogenesis of disease. Studies that looked at the subcellular localization of the MJD/SCA3 protein, ataxin-3, have shown that the normal protein is variably distributed between the nucleus and the cytoplasm, whereas mutant ataxin-3 is localized primarily in the nucleus. Using fluorescent protein technology and fluorescence microscopy, this thesis project attempts to analyze the nucleocytoplasmic shuttling capabilities of ataxin-3 and to evaluate the potential mechanisms that govern its translocation into and out of the nucleus. </p> <p> It was revealed that ataxin-3 is able to shuttle into and out of the nucleus and that the shuttling dynamics are dependent on the length of the poly glutamine tract. As well, two putative, CRMl dependent nuclear export signals and a putative, importin-a/~1 dependent, classical, nuclear localization signal were tested and shown to be nonfunctional as transport signals. It was then discovered that ataxin-3 is marginally leptomycin B (an inhibitor ofCRMl dependent nuclear export) sensitive in NIH3T3 and MCF7 cells, more sensitive to the drug in STHdhQ71Q7 cells and even more so in HEK 293 cells. This suggests that an exogenous factor mediates the nuclear import of ataxin-3 through the CRMl pathway. Subsequently, four known binding partners, hHDACl, hHDAC2, hHDAC6 and hHRAD23b, were tested for their potential ability to shuttle ataxin-3. It was concluded that although hHDAC6 had the greatest effect on ataxin-3 subcellular localization, we believe that it does not mediate its nuclear import or export. Future studies would involve an investigation as to how and why different polyglutamine lengths affect the nucleocytoplasmic shuttling of ataxin-3 and to identify the factor(s) that cause ataxin-3 to be more sensitive to LMB treatments in HEK 293 cells. </p> / Thesis / Master of Science (MSc)

Orientadores: Fernando Cendes, Iscia Lopes Cendes / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-12T17:57:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 D'Abreu_AnelyssaCysneFrota_D.pdf: 3449847 bytes, checksum: eea5f74252de56c304a925b8900a4cad (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A doença de Machado-Joseph ou ataxia espinocerebelar do tipo 3 (MJD/SCA3) é uma ataxia autossômica dominante resultante de uma expansão de tripletos CAG no gene MDJ1 localizado no cromossomo 14q. Clinicamente ela se caracteriza por ataxia cerebelar, neuropatia periférica, síndrome piramidal e extrapiramidal e oftalmoplegia. A idade de início é variável e se correlaciona inversamente com o tamanho da expansão CAG. Pacientes com início de sintomas precoce tendem a apresentar quadro clínico mais severo, e fenômeno de antecipação foi descrito nestes pacientes. MJD/SCA3 é progressiva e não há tratamento específico. Os objetivos deste trabalho foram: 1) Avaliar de forma prospectiva um número significativo de pacientes com MJD, através de questionários padronizados e escalas validadas para o estudo de pacientes com ataxia; 2) Avaliar os atuais instrumentos de avaliação clínica em MJD; 3)Avaliar de forma prospectiva as alterações de neuroimagem apresentadas em MJD, correlacionando-as com marcadores genéticos e manifestações clínicas. Os pacientes foram avaliados de forma sistemática através de ficha clínica padronizada, exame neurológico, escalas ICARS (International cooperative ataxia rating scale) e UMSARS (Unified Multiple System Atrophy Rating Scale), e exame de ressonância magnética do crânio (RM). Em trinta pacientes fomos capazes de repetir a RM após um intervalo aproximado de 12 meses. Inicialmente, investigamos se as escalas ICARS e UMSARS seriam adequadas para a avaliação clínica destes pacientes. Ambas as escalas (ICARS e UMSARS) apresentaram consistência interna adequada com escores a >0.90. No entanto, o subescore oculomotor (ICARS) obteve a=0.08. Coeficiente de correlação intraclasse foi de 0.94 para a ICARS, 0.96 para UMSARS-I, 0.97 para UMSARS-II e 0.94 para UMSARS-IV ("global disability score" (GDS)). Houve uma correlação quase perfeita entre os escores da ICARS e UMARS-II. Houve claramente uma interferência de sintomas que não a ataxia, notadamente distonia, nos escores totais de ambas as escalas. Além disso, o escore total ICARS demonstrou ser sensível a mudança após um período de um ano, mostrando a validade da escala na avaliação longitudinal dos pacientes. Como este projeto estava inserido em um projeto maior, envolvendo avaliação de sintomas não motores, entrevistamos 52 pacientes através de um questionário padronizado de sono e escala Epworth. Destes, 23 apresentaram escores na escala Epworth acima de 10, sugerindo sonolência diurna excessiva. Um achado interessante foi a alta freqüência de pacientes com insônia (19 pacientes), além de onze pacientes com sintomas sugestivos de síndrome das pernas inquietas, e oito com sintomas sugestivos de distúrbio do sono REM (RBD). Dezesseis pacientes utilizavam algum tipo de medicação indutora do sono. A avaliação de neuroimagem envolveu diferentes técnicas de análise. O passo inicial foi a avaliação visual das imagens adquiridas na RM. Observamos atrofia cerebelar em 28 pacientes; atrofia de ponte em 20 e de bulbo em 19; alargamento do 4o ventrículo em 17 e atrofia dos pedúnculos cerebelares em 12. Atrofia cortical difusa leve foi observada em 12 pacientes, enquanto em seis ela estava restrita aos lobos frontais. Doze pacientes apresentaram áreas de lesões hiperintensas não-específicas na substância branca. O segundo passo foi a análise de espectroscopia (MRS). Em um primeiro momento utilizamos a mensuração manual dos picos de metabólitos (NAA, Cr, Cho) e comparamos a razão;NAA/Cr e Cho/Cr do grupo de pacientes com um grupo controle. Nós observamos valores menores de NAA/Cr em MJD quando comparados com controles (1.63+/-0.41 (1.15-2.76) versus 1.9?+/-0.51 (1.50-2.92); U test =219.000; p<0.001). Os valores de NAA/Cr não se correlacionaram com nenhuma variável clínica ou tamanho da repetição CAG. Devido à diferença de idade entre controles e pacientes, nós realizamos de forma cega, um pareamento entre o grupo controle e os pacientes, resultando assim em um grupo de 15 pacientes e 15 controles. Nesse subgrupo, as diferenças entre NAA/Cr se mantiveram (U test=44.000; p=0.004). No entanto, uma diferença entre os níveis de Cho/Cr também foi encontrada (0.86+/-0.14 (0.71-1.15) e 0.98+/-0.14 (0.78-1.23); U test=53.000; p=0.014). A análise de morfometria baseada em voxels (VBM) ocorreu em duas etapas. Em um primeiro momento nós avaliamos as imagens dos pacientes em relação ao grupo controle. Na segunda análise nós comparamos de forma pareada as imagens de cada paciente com intervalo médio aproximado de 12 meses entre elas. Nós observamos uma diminuição de densidade de substância cinzenta significativa nas seguintes áreas (p<0,01): lobo frontal (giros pré-central; frontal inferior, superior e médio); lobo parietal (giros pós-central; parietal inferior, superior, angular e supramarginal); giro temporal médio; giro cingulado; putamen. Atrofia de substância branca estava restrita ao cerebelo. Múltiplas áreas demonstraram uma correlação inversa com CAG, idade, idade de início, e duração de doença. A análise longitudinal, no entanto, não demonstrou progressão significativa da patologia cerebral, possivelmente por efeito solo, ou tempo de seguimento curto. A fim de confirmar os achados de VBM, utilizamos um software para análise semi-automática de MRS, nas imagens na avaliação inicial e no exame de seguimento. Não houve novamente diferença significativa na análise longitudinal. Por último, realizamos um estudo comparativo entre a densidade de substância cinzenta e o volume do tálamo entre pacientes com MJD e controles. Houve uma diferença significativa entre a densidade de substância cinzenta de pacientes (130.359 +/-16.758) e controles (153.193 +/- 23.599;p<0.001), assim como no volume do tálamo (7862.5+/- 712.5 mm3 versus controles 8592.3+/-712.5 mm3; p<0.001). O volume talâmico foi menor em pacientes com distonia do que naqueles sem distonia (7456.2+/-814.2 versus 7984.4+/- 644.8 mm3; p=0.0049). Não houve correlação entre o volume talâmico e a tamanho da repetição CAG, duração de doença, idade de início de sintomas e idade do paciente / Abstract: Machado-Joseph disease or spinocerebellar ataxia type 3 (SCA3/MJD) is an autosomal dominant ataxia resulting from an expansion of a CAG triplet at the MDJ1 gene located on chromosome 14q. Clinically, it is characterized by cerebellar ataxia, peripheral neuropathy, pyramidal and extrapyramidal syndrome and ophthalmoplegia. The age of onset is variable and inversely correlated with the size of the CAG expansion. Patients with early symptoms tend to have a more severe clinical picture, and the anticipation phenomenon was described in these patients. MJD/SCA3 is progressive and there is no specific treatment. The objectives of this study were: 1) to prospectively evaluate a significant number of patients with MJD/SCA3, through standardized questionnaires and validated scales; 2) To assess the current clinical tools for the evaluation of patients with MJD/SCA3; 3) To perform a longitudinal neuroimaging study in MJD/SCA3, correlating those findings with genetical and clinical markers. Patients were evaluated in a systematic manner through a standardized clinical form, neurological examination, ICARS (International cooperative ataxia rating scale) and UMSARS (Unified Multiple System Atrophy Rating Scale), and Magnetic Resonance Imaging of the brain (MRI). In thirty patients we were able to repeat the MRI after an interval of approximately 12 months. Initially, we investigated whether the ICARS and UMSARS would be suitable for the clinical evaluation of these patients. Both scales (ICARS and UMSARS) had adequate internal consistency with scores a> 0.90. However, the oculomotor subscore (ICARS) obtained a = 0.08. Intraclass correlation coefficient was 0.94 for ICARS, 0.96 for UMSARS-I-II UMSARS to 0.97 and 0.94 for UMSARS-IV ("global disability score" (GDS)). There was an almost perfect correlation between the scores of ICARS and UMARS-II. There was clearly an interference of symptoms other than ataxia in total scores of both scales. Especially patients with dystonia, regardless of clinical subtype, showed the highest scores. Moreover, the total ICARS score showed to be sensitive to change after a period of one year, demonstrating the validity of the scale in the longitudinal evaluation of patients. As this project was inserted into a larger project, involving the evaluation of non-motor symptoms, we evaluated 52 patients for the presence of sleep related complains. We interviewed all patients through a standardized sleep questionnaire and performed the Epworth Sleepiness Scale (ESS). Of these, 23 had ESS scores above 10, suggesting excessive daytime sleepiness. An interesting finding was the high frequency of patients with insomnia (19 patients). We also observed eleven patients with symptoms suggestive of restless legs syndrome, and eight with symptoms suggestive of REM behavior disorder (RBD). Sixteen patients used some kind of sleep inducing medication. The neuroimaging evaluation involved different analysis techniques. The initial step was the visual evaluation of the MRI sequences. We observed cerebellar atrophy in 28 patients; atrophy of the pons in 20 and atrophy of the medulla in 19; enlargement of the 4th ventricle in 17 and atrophy of the cerebellar peduncles on 12. Mild diffuse cortical atrophy was observed in 12 patients, while in six it was restricted to the frontal lobes. Twelve patients had areas of non-specific hyperintense lesions in the deep white matter. The second step was the analysis of the spectroscopy (MRS) data. We performed manual measurements of the peak area for NAA, Cr and Cho and compared NAA/Cr and Cho/Cr ratios between patients and control groups. We observed lower values of NAA / Cr in MJD when compared to controls (1.63 +/-0.41 (1.15-2.76) vs. 1.97+/-0.51 (1.50-2.92); U test = 219,000, p <0.001). The values of NAA/Cr did not correlate with any clinical variable or CAG repeat size. Due to the difference in age between controls and patients, we performed in a blinded fashion, a pairing between both groups, which resulted in a group of 15 patients and 15 controls. In this subgroup, the differences between NAA/Cr remained (U test = 44,000, p = 0.004). However, a difference between the levels of Cho/Cr was also found (0.86 + / -0.14 (0.71-1.15) and 0.98 + / -0.14 (0.78-1.23); U test = 53,000, p = 0014). Voxel-based morphometry (VBM) analysis occurred in two stages. At first, we compared patients to a control group. In the second analysis, we compare paired images of each patient with an approximate average interval of 12 months. We observed significant grey matter atrophy (p<0.01) at: frontal lobes (precentral, inferior, superior, middle frontal gyrus); parietal lobes (postcentral, inferior, superior, angular, supramarginal gyrus); middle temporal gyrus; cingulate gyrus; putamen. White matter atrophy was restricted to the cerebellum. Multiple areas showed an inverse correlation with CAG, age, age of onset and duration of illness. The longitudinal analysis, however, did not show a significant progression of brain pathology; possibly due to floor effect or the short follow-up interval. In order to confirm the VBM findings, we use a software for semi-automatic MRS analysis to compare MRS results from the first and second MRS failed to demonstrate a significant change in this interval. At last, we performed a comparative study between thalamic grey matter density and thalamic volume between patients and controls. There was a significant difference between grey matter density in patients (130.359 +/-16.758) and controls (153.193 +/- 23.599; p<0.001); as well as thalamic volumes (7862.5+/- 712.5 mm3 versus 8592.3+/-712.5 mm3; p<0.001). Thalamic volumes were significantly smaller in patients with dystonia when compared to patients without dystonia (7456.2+/-814.2 versus 7984.4+/- 644.8 mm3; p=0.0049). There was no significant correlation between thalamic volume and CAG repeat length, disease duration, age of onset and age / Doutorado / Neurociencias / Doutor em Fisiopatologia Medica

The polyglutamine diseases are a clinically heterogeneous group of inherited neurodegenerative disorders caused by expansion of polyglutamine-encoding (CAG)n trinucleotide repeats within the disease genes. It is increasingly clear that the amino acid sequences flanking the polyglutamine expansion in each disease protein, i.e. the specific protein context, contribute to selective neuronal toxicity by influencing the behavior of the disease protein within selectively vulnerable neuronal populations. In the studies described here, I explore the role that protein context plays in the polyglutamine disease, Spinocerebellar ataxia type 3 (SCA3). Toward this end, I utilize biochemical, cell-based, and animal models to gain a broader understanding of the SCA3 disease protein, ataxin-3, and generate tools for further exploration of the molecular properties of ataxin-3 that modulate its toxicity during disease. In Chapter 1, I provide an overview of the recognized polyglutamine diseases, emphasizing the elements of protein context that are distinct among the polyglutamine disease proteins and may contribute to the neuropathological and clinical heterogeneity within this family of diseases. Alternative splicing of the polyglutamine disease gene products adds an additional level of complexity to the tissue-specific protein context of expanded polyglutamine, yet this phenomenon has been underinvestigated. In Chapter 2, I examine the significance of ataxin-3 splice variation. Several minor 5' variants and both known 3' splice variants of ataxin-3, a deubiquitinating enzyme, are expressed at the mRNA level in brain. At the protein level, however, the C-terminal splice isoform with three ubiquitin interacting motifs (3UIM ataxin-3) is the predominant isoform in brain, independent of age or (CAG)n expansion. Although both C-terminal ataxin-3 splice isoforms display similar in vitro deubiquitinating activity, 2UIM ataxin-3 is more prone to aggregate and is more rapidly degraded by the proteasome. These observations demonstrate how alternative splicing of sequences distinct from the polyglutamine-encoding (CAG)n repeat can alter disease-related components of protein context. Knock-in models of polyglutamine diseases utilize pathogenic (CAG)n expansions within the endogenous genomic, transcript, and protein context to recreate key features of individual polyglutamine diseases. In chapter 3, I describe the creation of the first knock-in mouse model of SCA3. Hemizygous knock-in mice transmit the knock-in allele in Mendelian ratios and broadly express both the expanded Atxn3(Q3KQ82) protein and the wildtype murine Atxn3(Q6) protein. In this chapter, I also compare the gene targeting efficiencies and rates of chromosomal instability of a novel C57BL/6J ES cell line (UMB6JD7) and two well established ES cell lines (W4 and Bruce4.G9). Of these, Bruce4.G9 ES cells proved superior based on lower rates of aneuploidy and the production of germline transmitting chimeras. Finally, in Chapter 4 I discuss questions and concepts raised during the course of these studies, and suggest avenues of future research aimed at broadening our understanding of ataxin-3 physiology and of protein context-dependent elements in polyglutamine disease pathogenesis.

Introdução: A Ataxia Espinocerebelar tipo 3 (SCA3), também chamada de Doença de Machado - Joseph (DMJ) é uma doença neurodegenerativa autossômica dominante causada pela expansão de uma sequência repetitiva CAG no gene ATXN3 localizado no cromossomo 14q32.1. Alelos normais contêm 12 a 43 repetições CAG; alelos causadores da doença contêm 51 ou mais repetições CAG (CAGexp). Existe uma forte correlação entre o tamanho da expansão e a gravidade da doença, e a antecipação é um fenômeno comum. Com idade de início média entre os 32 e os 40 anos, a SCA3/DMJ se apresenta com ataxia, disartria, disfagia com uma expressão clínica heterogênea e manifestações clínicas abrangendo mú ltiplos sistemas neurológicos como as vias piramidais e extrapiramidais, a sensibilidade e o neurônio motor inferior. O curso da SCA3/DMJ é invariavelmente progressivo, levando os pacientes à dependência funcional e ao retraimento social e não há tratamentos específicos para a condição. Estima-se que a sobrevida média após o início da doença seja de 21 anos. O inicio da doença na infância raramente foi relatado na literatura, e a progressão e característ icas da doença nesses casos não são conhecidas. Objetivo: caracterizar as manifestações clínicas e a progressão da doença em sujeitos portadores de SCA3/DMJ com idade de inicio da doença na infância. Métod os: casos com idade de início do primeiro sintoma igual ou anterior aos 12 anos (DMl-início-na-infância) foram identificados a partir do registro de casos diagnosticados com exame molecular e acompanhados no ambulatório de Neurogenética do Hospital ele Clínicas de Porto Alegre ele 2000 a 2014. Após consentimento, os pacientes foram entrevistados e examinados através das escalas cl ínicas SARA e NESSCA. As variáveis gênero, idade de início (ii), duração da doença (DD), as repetições CAG dos dois alelos, o gênero do genitor transmissor, a CAGexp do genitor e a antecipação foram obtidas e comparadas com os dados da coorte geral de casos da institu ição. Quando possível, essas comparações foram fe itas através de testes de qui-quadrado para variáveis categóricas, e de testes não paramétricas como Sperman e Mann-Whitney, para variáveis quantitativas. Doze meses após a primeira avaliação (baseline), as escalas NESSCA e SARA foram novamente aplicadas. As taxas de progressão da NESSCA e da SARA nesse intervalo foram medida através do teste modelo misto de coeficientes aleatórios sendo comparadas com as taxas obtidas em duas observações prospectivas prévias, realizadas em pacientes SCA3/DMJ com ii após os 12 anos: o estudo da história natural da SCA3/DMJ uti lizando a escala NESSCA (Jardim et ai, 2010) gerou o grupo Controle-I-IN, e o grupo placebo do e nsaio clín ico randomizado sobre o lítio (Saute et al,2014) gerou o grupo Controle-PL. Resultados: No período, 1317 pacientes (189 famílias) com SCA3/DMJ foram identificados na nossa instituição. Os 367 que fizeram o exame molecular fo ram analisados. Sua ii média ± dp (variação) foi de 34,1 ± 11 (5 a 59) anos. Oito pacientes de 6 fa mílias, todos heterozigotos para a CAGexp, foram identificados com DMI-início-na-infância (2,2% ). Sete dos oito DMJin ício-na-infância (87,5%) eram do sexo feminino (p = 0,057), a ii dos sintomas do grupo DMJ-início-na-infância variou entre 5 e 10 anos com mediana de 8 e intervalo inter-quartil 3 anos. A CAGexp variou de 80 a 91 repetições. A progressão da NESSCA foi de 0,8 pontos anuais em média no grupo Controle-PL e 2 pontos anuais em média no grupo DMJ-início-nainfância (p=O,OO L). A progressão da SARA foi de 0,6 pontos anuais em média no controle-PL e 2,3 pontos em média no grupo DMJ-início na infância (p=O,OOl). A escala NESSCA foi dividida em subescalas considerando sinais piramidais, extrapiramidais, ataxia, sinais de comprometimento periférico, disfagia, disartria e alterações oculomotoras. A progressão dessas subescalas foi comparada entre os dois grupos. Foi observado uma piora na progressão do grupo DMJ-início-na-infância nos sintomas extrapiramidais (p=0,006) e na disfagia (p=O,OOl). Conclusão: A DMI-início-na-infância está associada ao sexo feminino e apresenta uma velocidade de progressão maior do que os demais sujeitos com SCA3/MJD. / lntroduction: Spinocerebellar Ataxia 3 (SCA3), also known as Machado-Joseph Disease (MJD), is an autosomal dominant neurodegenerative disorder, associated to a CAG repeated expansion at the ATXN3 gene coding region, located at chromosome 14q32.1. Normal alteies contain 12-43 CAG repeats; alleles causing disease contain 51 or more CAG repetitions (CAGexp). There is a strong correlation between the expansion size anel the severity of disease, and the anticipation is a common phenomenon. The average age of onset is 32 to 40 years old anel the SCA3/MJD presents with ataxia, dysarthria, dysphagia with a heterogcneous clinicai expression anel clinicai manifestations affect multiple neurological systems as pyramidal anel extrapyramidal pathways, sensitivity anel motor neuron lower. The course of SCA3/MJD is invariably progressive, leading patients to fu nctional dependency anel social withdrawal and there are no specific treatments for the condition. lt is estimated that the avcrage survival after elisease onset is 21 years. The onset of disease in childhood was rarely reported in the literature, anel the disease progression anel characteristics in patients under 12 years is not known. Objcctive: To characterize patients with heterozygous SCA3/MJD with age of onsct before 12 ycars old. Methods: cases with age of onset before 12 years old were ident ificcl from the registry of cases eliagnosecl molecularly anel accompanied in the Neurogcnctics Clinic of Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA) from 2000 to 2014. After consent, patients were interviewed anel examined with the cl inicai scales SARA anel NESSCA. The variables gender, age at onset (ao), clisease cluration (DD), CAG repeats of the two ali cies, transmitter parent gender, CAGexp of parent anel anticipation were obtained anel compareci with data of the general cohort of cases from institution. These comparisons were macle using chi-square tests for categorical variables anel non-parametric tests as Spearman anel Mann-Whitney test for quantitative variables. Twelve months after the first evaluation (baseline), the SARA and NESSCA scales were again applied. Progression rates of SARA and NESSCA in that range were measured using the mixed model of random coefficient test were compareci with the rates obtained in two previous prospective observations, made in SCA3 I MJD patients with ao after 12 years: the Natural His tory Study of SCA3/DMJ using NESSCA (Jardim et al, 2010) generaLed the Control-HN group and Lhe placebo group randomized clinicai trial of lithium (Saute et ai, 2014) generated Control-PL group. Results: During the period, 1317 patienLs (189 fami lies) with SCA3/MJD were identified at HCPA. The 367 patients who dicl the molecular examinaLion were analyzecl. Its average ao ± SD (range) was 34.1 ± 11 (5-59) years. Six families of eight patients, ali heterozygous for CAGexp were identified MJD-chilclhood-onset group (2.2% ). Seven of the eight MJDchildhood- onset group (87.5%) were female (p = 0.057), ao of the symptoms of MJDchildhood- onset group ranged between 5 and 10 years wiLh a median of 8 and interquartile range 3 years. The CAGexp ranged 80-91 repetitions. The ann ual progression of NESSCA was 0.8 poinLs on average in Lhe Control-PL group anel 2 points on average in MJDchildhood- onset group (p = 0.001). The progression of SARA was 0.6 points per year on average in the Controi-PL group anel 2.3 points in average MJD group in childhood-onset (p = 0.001). The scale NESSCA was divided in subscales considering pyramidal signs, extrapyramidal signs, ataxia, peripheral signs, dysphagia, dysarthria and oculomotor and compareci to progression in both groups. The progression of these subscales was compareci between the two groups.

Introduction: Machado-Joseph Disease (MJD) is a progressive, chronic, neurological disease. It is also called spinocerebellar ataxia type 3. The disease clinical presentation may vary and it can present balance deficit, gait ataxia, blurring of vision, dysphagia, dysartria, etc. Objectives: This study aimed at investigating the body balance, the functional performance, and the oxidative metabolism of subjects with Machado-Joseph disease, who live in Santa Maria, RS, Brazil. Materials and Methods: Through this study it was established a comparison between a Study Group (volunteers with MJD), and a Control Group (volunteers without MJD), in order to verify their limitations, balance alterations, functional performance to accomplish activities of daily living (ADLs) and oxidative metabolism. So, this research was previously evaluated and accepted by the Research Ethics Committee at Universidade Federal de Santa Maria (UFSM). The following evaluations were part of the research: anamnesis of Occupational Therapy, Barthel index, Berg balance scale, dynamic posturography, Comet assay, and biochemical tests. Results: It was possible to observe that the volunteers with MJD present significant impairments related to static balance verified through sensory organization tests (SOTs) of dynamic posturography - SOT I (p = 0.1719); SOT II (p = 0.0035); SOT III (p = <.0001); SOT IV (p = 0.0536); SOT V (p = <.0001); SOT VI (p = <.0001); static and dynamic impairments, verified through Berg balance scale (p = 0.01); important impairments related to functional level to accomplish daily activities were also found (p = 0.02). Oxidative metabolism impairments were also verified carried out through biochemical tests: glucose (p= 0.014), triglycerides (p=0.013), thiol (p=0.000), and catalase (p=0.032); significant data were also found in genotoxicity through the Comet assay - damage 0 (p=0.015) and damage 4 (0.029); it was also observed significant negative correlation among damage 4 and SOT III (r2= -0.551, p=0.041) and SOT VI (r2= -0.593, p= 0.025) for both groups. Conclusion: It is possible to conclude that patients with MJD present more balance impairments, functional limitations to perform ADL, oxidative metabolism and genotoxicity alterations, when compared with the volunteers without MJD. Further studies are suggested to develop possible treatments to improve balance, functional and ADL impairments, as well as studies to verify the impact of nutritional supplementation with antioxidants, and to evaluate the amount of oxidative stress status which could be used to evaluate the MJD progression. / Introdução: A Doença de Machado-Joseph (DMJ) é uma doença neurológica crônica e progressiva, também chamada de ataxia espinocerebelar tipo três. O quadro clínico da doença é variado e compreende déficit de equilíbrio, marcha atáxica, alterações visuais, disfagia, disartria, dentre outros sintomas. Objetivos: O presente estudo visou investigar o equilíbrio corporal, desempenho funcional e metabolismo oxidativo de indivíduos portadores da Doença de Machado-Joseph, que residem no município de Santa Maria/RS - Brasil. Materiais e Métodos: Por meio desse estudo realizou-se um comparativo entre um Grupo de Estudo (voluntários portadores da DMJ), com um Grupo Controle (voluntários não portadores da DMJ), a fim de verificar as limitações e alterações em relação ao equilíbrio, nível funcional para execução das atividades de vida diária (AVDs) e metabolismo oxidativo. Para tanto, a pesquisa foi previamente avaliada e aprovada pelo Comitê de Ética da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM). Dentre as avaliações realizadas estão: Anamnese de Terapia Ocupacional, Índice de Barthel, Escala de Equilíbrio de Berg (EEB), Posturografia Dinâmica, Ensaio Cometa e testes bioquímicos. Resultados: Observou-se que os voluntários com DMJ possuem déficits significantes em relação ao equilíbrio estático verificado pelos Testes de Organização Sensorial (TOS) da Posturografia Dinâmica - TOS I (p =0,1719); TOS II (p = 0,0035); TOS III (p = <.0001); TOS IV (p =0,0536); TOS V (p = <.0001); TOS VI (p = <.0001); déficit no equilíbrio estático e dinâmico, verificado pela EEB (p = 0,01); também foram encontrados comprometimentos importantes relacionados ao nível funcional para realização das atividades cotidianas (p = 0,02). Verificou-se também alterações no metabolismo oxidativo realizada através dos testes bioquímicos: glicose (p= 0,014), triglicerídeos (p=0,013), Tióis (p=0,000) e Catalase (p=0,032); além de índices significativos em relação à genotoxicidade realizada por meio do Ensaio Cometa -, dano 0 (p=0,015) e dano 4 (0,029); observou-se também que há correlação negativa significativa entre o dano 4 e o TOS III (r2= -0.551, p=0,041) e TOS VI (r2= -0.593, p= 0.025) em ambos os grupos. Conclusão: Conclui-se que os portadores da DMJ possuem maiores comprometimentos de equilíbrio, limitações funcionais na realização das AVDs, alterações no metabolismo oxidativo e genotoxicidade, do que os voluntários não portadores da DMJ. Sugerem-se estudos futuros para desenvolvimento de possíveis tratamentos que venham a contribuir com a melhora do equilíbrio, funcionalidade para execução das AVDs, bem como estudos que possam verificar o impacto da suplementação de indivíduos com DMJ com antioxidantes, e avaliar o quanto marcadores do estresse oxidativo poderiam ser utilizados para avaliar a progressão da DMJ em portadores da doença.

Introdução: A Ataxia Espinocerebelar tipo 3 (SCA3), também chamada de Doença de Machado - Joseph (DMJ) é uma doença neurodegenerativa autossômica dominante causada pela expansão de uma sequência repetitiva CAG no gene ATXN3 localizado no cromossomo 14q32.1. Alelos normais contêm 12 a 43 repetições CAG; alelos causadores da doença contêm 51 ou mais repetições CAG (CAGexp). Existe uma forte correlação entre o tamanho da expansão e a gravidade da doença, e a antecipação é um fenômeno comum. Com idade de início média entre os 32 e os 40 anos, a SCA3/DMJ se apresenta com ataxia, disartria, disfagia com uma expressão clínica heterogênea e manifestações clínicas abrangendo mú ltiplos sistemas neurológicos como as vias piramidais e extrapiramidais, a sensibilidade e o neurônio motor inferior. O curso da SCA3/DMJ é invariavelmente progressivo, levando os pacientes à dependência funcional e ao retraimento social e não há tratamentos específicos para a condição. Estima-se que a sobrevida média após o início da doença seja de 21 anos. O inicio da doença na infância raramente foi relatado na literatura, e a progressão e característ icas da doença nesses casos não são conhecidas. Objetivo: caracterizar as manifestações clínicas e a progressão da doença em sujeitos portadores de SCA3/DMJ com idade de inicio da doença na infância. Métod os: casos com idade de início do primeiro sintoma igual ou anterior aos 12 anos (DMl-início-na-infância) foram identificados a partir do registro de casos diagnosticados com exame molecular e acompanhados no ambulatório de Neurogenética do Hospital ele Clínicas de Porto Alegre ele 2000 a 2014. Após consentimento, os pacientes foram entrevistados e examinados através das escalas cl ínicas SARA e NESSCA. As variáveis gênero, idade de início (ii), duração da doença (DD), as repetições CAG dos dois alelos, o gênero do genitor transmissor, a CAGexp do genitor e a antecipação foram obtidas e comparadas com os dados da coorte geral de casos da institu ição. Quando possível, essas comparações foram fe itas através de testes de qui-quadrado para variáveis categóricas, e de testes não paramétricas como Sperman e Mann-Whitney, para variáveis quantitativas. Doze meses após a primeira avaliação (baseline), as escalas NESSCA e SARA foram novamente aplicadas. As taxas de progressão da NESSCA e da SARA nesse intervalo foram medida através do teste modelo misto de coeficientes aleatórios sendo comparadas com as taxas obtidas em duas observações prospectivas prévias, realizadas em pacientes SCA3/DMJ com ii após os 12 anos: o estudo da história natural da SCA3/DMJ uti lizando a escala NESSCA (Jardim et ai, 2010) gerou o grupo Controle-I-IN, e o grupo placebo do e nsaio clín ico randomizado sobre o lítio (Saute et al,2014) gerou o grupo Controle-PL. Resultados: No período, 1317 pacientes (189 famílias) com SCA3/DMJ foram identificados na nossa instituição. Os 367 que fizeram o exame molecular fo ram analisados. Sua ii média ± dp (variação) foi de 34,1 ± 11 (5 a 59) anos. Oito pacientes de 6 fa mílias, todos heterozigotos para a CAGexp, foram identificados com DMI-início-na-infância (2,2% ). Sete dos oito DMJin ício-na-infância (87,5%) eram do sexo feminino (p = 0,057), a ii dos sintomas do grupo DMJ-início-na-infância variou entre 5 e 10 anos com mediana de 8 e intervalo inter-quartil 3 anos. A CAGexp variou de 80 a 91 repetições. A progressão da NESSCA foi de 0,8 pontos anuais em média no grupo Controle-PL e 2 pontos anuais em média no grupo DMJ-início-nainfância (p=O,OO L). A progressão da SARA foi de 0,6 pontos anuais em média no controle-PL e 2,3 pontos em média no grupo DMJ-início na infância (p=O,OOl). A escala NESSCA foi dividida em subescalas considerando sinais piramidais, extrapiramidais, ataxia, sinais de comprometimento periférico, disfagia, disartria e alterações oculomotoras. A progressão dessas subescalas foi comparada entre os dois grupos. Foi observado uma piora na progressão do grupo DMJ-início-na-infância nos sintomas extrapiramidais (p=0,006) e na disfagia (p=O,OOl). Conclusão: A DMI-início-na-infância está associada ao sexo feminino e apresenta uma velocidade de progressão maior do que os demais sujeitos com SCA3/MJD. / lntroduction: Spinocerebellar Ataxia 3 (SCA3), also known as Machado-Joseph Disease (MJD), is an autosomal dominant neurodegenerative disorder, associated to a CAG repeated expansion at the ATXN3 gene coding region, located at chromosome 14q32.1. Normal alteies contain 12-43 CAG repeats; alleles causing disease contain 51 or more CAG repetitions (CAGexp). There is a strong correlation between the expansion size anel the severity of disease, and the anticipation is a common phenomenon. The average age of onset is 32 to 40 years old anel the SCA3/MJD presents with ataxia, dysarthria, dysphagia with a heterogcneous clinicai expression anel clinicai manifestations affect multiple neurological systems as pyramidal anel extrapyramidal pathways, sensitivity anel motor neuron lower. The course of SCA3/MJD is invariably progressive, leading patients to fu nctional dependency anel social withdrawal and there are no specific treatments for the condition. lt is estimated that the avcrage survival after elisease onset is 21 years. The onset of disease in childhood was rarely reported in the literature, anel the disease progression anel characteristics in patients under 12 years is not known. Objcctive: To characterize patients with heterozygous SCA3/MJD with age of onsct before 12 ycars old. Methods: cases with age of onset before 12 years old were ident ificcl from the registry of cases eliagnosecl molecularly anel accompanied in the Neurogcnctics Clinic of Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA) from 2000 to 2014. After consent, patients were interviewed anel examined with the cl inicai scales SARA anel NESSCA. The variables gender, age at onset (ao), clisease cluration (DD), CAG repeats of the two ali cies, transmitter parent gender, CAGexp of parent anel anticipation were obtained anel compareci with data of the general cohort of cases from institution. These comparisons were macle using chi-square tests for categorical variables anel non-parametric tests as Spearman anel Mann-Whitney test for quantitative variables. Twelve months after the first evaluation (baseline), the SARA and NESSCA scales were again applied. Progression rates of SARA and NESSCA in that range were measured using the mixed model of random coefficient test were compareci with the rates obtained in two previous prospective observations, made in SCA3 I MJD patients with ao after 12 years: the Natural His tory Study of SCA3/DMJ using NESSCA (Jardim et al, 2010) generaLed the Control-HN group and Lhe placebo group randomized clinicai trial of lithium (Saute et ai, 2014) generated Control-PL group. Results: During the period, 1317 patienLs (189 fami lies) with SCA3/MJD were identified at HCPA. The 367 patients who dicl the molecular examinaLion were analyzecl. Its average ao ± SD (range) was 34.1 ± 11 (5-59) years. Six families of eight patients, ali heterozygous for CAGexp were identified MJD-chilclhood-onset group (2.2% ). Seven of the eight MJDchildhood- onset group (87.5%) were female (p = 0.057), ao of the symptoms of MJDchildhood- onset group ranged between 5 and 10 years wiLh a median of 8 and interquartile range 3 years. The CAGexp ranged 80-91 repetitions. The ann ual progression of NESSCA was 0.8 poinLs on average in Lhe Control-PL group anel 2 points on average in MJDchildhood- onset group (p = 0.001). The progression of SARA was 0.6 points per year on average in the Controi-PL group anel 2.3 points in average MJD group in childhood-onset (p = 0.001). The scale NESSCA was divided in subscales considering pyramidal signs, extrapyramidal signs, ataxia, peripheral signs, dysphagia, dysarthria and oculomotor and compareci to progression in both groups. The progression of these subscales was compareci between the two groups.

Introdução: A Ataxia Espinocerebelar tipo 3 (SCA3), também chamada de Doença de Machado - Joseph (DMJ) é uma doença neurodegenerativa autossômica dominante causada pela expansão de uma sequência repetitiva CAG no gene ATXN3 localizado no cromossomo 14q32.1. Alelos normais contêm 12 a 43 repetições CAG; alelos causadores da doença contêm 51 ou mais repetições CAG (CAGexp). Existe uma forte correlação entre o tamanho da expansão e a gravidade da doença, e a antecipação é um fenômeno comum. Com idade de início média entre os 32 e os 40 anos, a SCA3/DMJ se apresenta com ataxia, disartria, disfagia com uma expressão clínica heterogênea e manifestações clínicas abrangendo mú ltiplos sistemas neurológicos como as vias piramidais e extrapiramidais, a sensibilidade e o neurônio motor inferior. O curso da SCA3/DMJ é invariavelmente progressivo, levando os pacientes à dependência funcional e ao retraimento social e não há tratamentos específicos para a condição. Estima-se que a sobrevida média após o início da doença seja de 21 anos. O inicio da doença na infância raramente foi relatado na literatura, e a progressão e característ icas da doença nesses casos não são conhecidas. Objetivo: caracterizar as manifestações clínicas e a progressão da doença em sujeitos portadores de SCA3/DMJ com idade de inicio da doença na infância. Métod os: casos com idade de início do primeiro sintoma igual ou anterior aos 12 anos (DMl-início-na-infância) foram identificados a partir do registro de casos diagnosticados com exame molecular e acompanhados no ambulatório de Neurogenética do Hospital ele Clínicas de Porto Alegre ele 2000 a 2014. Após consentimento, os pacientes foram entrevistados e examinados através das escalas cl ínicas SARA e NESSCA. As variáveis gênero, idade de início (ii), duração da doença (DD), as repetições CAG dos dois alelos, o gênero do genitor transmissor, a CAGexp do genitor e a antecipação foram obtidas e comparadas com os dados da coorte geral de casos da institu ição. Quando possível, essas comparações foram fe itas através de testes de qui-quadrado para variáveis categóricas, e de testes não paramétricas como Sperman e Mann-Whitney, para variáveis quantitativas. Doze meses após a primeira avaliação (baseline), as escalas NESSCA e SARA foram novamente aplicadas. As taxas de progressão da NESSCA e da SARA nesse intervalo foram medida através do teste modelo misto de coeficientes aleatórios sendo comparadas com as taxas obtidas em duas observações prospectivas prévias, realizadas em pacientes SCA3/DMJ com ii após os 12 anos: o estudo da história natural da SCA3/DMJ uti lizando a escala NESSCA (Jardim et ai, 2010) gerou o grupo Controle-I-IN, e o grupo placebo do e nsaio clín ico randomizado sobre o lítio (Saute et al,2014) gerou o grupo Controle-PL. Resultados: No período, 1317 pacientes (189 famílias) com SCA3/DMJ foram identificados na nossa instituição. Os 367 que fizeram o exame molecular fo ram analisados. Sua ii média ± dp (variação) foi de 34,1 ± 11 (5 a 59) anos. Oito pacientes de 6 fa mílias, todos heterozigotos para a CAGexp, foram identificados com DMI-início-na-infância (2,2% ). Sete dos oito DMJin ício-na-infância (87,5%) eram do sexo feminino (p = 0,057), a ii dos sintomas do grupo DMJ-início-na-infância variou entre 5 e 10 anos com mediana de 8 e intervalo inter-quartil 3 anos. A CAGexp variou de 80 a 91 repetições. A progressão da NESSCA foi de 0,8 pontos anuais em média no grupo Controle-PL e 2 pontos anuais em média no grupo DMJ-início-nainfância (p=O,OO L). A progressão da SARA foi de 0,6 pontos anuais em média no controle-PL e 2,3 pontos em média no grupo DMJ-início na infância (p=O,OOl). A escala NESSCA foi dividida em subescalas considerando sinais piramidais, extrapiramidais, ataxia, sinais de comprometimento periférico, disfagia, disartria e alterações oculomotoras. A progressão dessas subescalas foi comparada entre os dois grupos. Foi observado uma piora na progressão do grupo DMJ-início-na-infância nos sintomas extrapiramidais (p=0,006) e na disfagia (p=O,OOl). Conclusão: A DMI-início-na-infância está associada ao sexo feminino e apresenta uma velocidade de progressão maior do que os demais sujeitos com SCA3/MJD. / lntroduction: Spinocerebellar Ataxia 3 (SCA3), also known as Machado-Joseph Disease (MJD), is an autosomal dominant neurodegenerative disorder, associated to a CAG repeated expansion at the ATXN3 gene coding region, located at chromosome 14q32.1. Normal alteies contain 12-43 CAG repeats; alleles causing disease contain 51 or more CAG repetitions (CAGexp). There is a strong correlation between the expansion size anel the severity of disease, and the anticipation is a common phenomenon. The average age of onset is 32 to 40 years old anel the SCA3/MJD presents with ataxia, dysarthria, dysphagia with a heterogcneous clinicai expression anel clinicai manifestations affect multiple neurological systems as pyramidal anel extrapyramidal pathways, sensitivity anel motor neuron lower. The course of SCA3/MJD is invariably progressive, leading patients to fu nctional dependency anel social withdrawal and there are no specific treatments for the condition. lt is estimated that the avcrage survival after elisease onset is 21 years. The onset of disease in childhood was rarely reported in the literature, anel the disease progression anel characteristics in patients under 12 years is not known. Objcctive: To characterize patients with heterozygous SCA3/MJD with age of onsct before 12 ycars old. Methods: cases with age of onset before 12 years old were ident ificcl from the registry of cases eliagnosecl molecularly anel accompanied in the Neurogcnctics Clinic of Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA) from 2000 to 2014. After consent, patients were interviewed anel examined with the cl inicai scales SARA anel NESSCA. The variables gender, age at onset (ao), clisease cluration (DD), CAG repeats of the two ali cies, transmitter parent gender, CAGexp of parent anel anticipation were obtained anel compareci with data of the general cohort of cases from institution. These comparisons were macle using chi-square tests for categorical variables anel non-parametric tests as Spearman anel Mann-Whitney test for quantitative variables. Twelve months after the first evaluation (baseline), the SARA and NESSCA scales were again applied. Progression rates of SARA and NESSCA in that range were measured using the mixed model of random coefficient test were compareci with the rates obtained in two previous prospective observations, made in SCA3 I MJD patients with ao after 12 years: the Natural His tory Study of SCA3/DMJ using NESSCA (Jardim et al, 2010) generaLed the Control-HN group and Lhe placebo group randomized clinicai trial of lithium (Saute et ai, 2014) generated Control-PL group. Results: During the period, 1317 patienLs (189 fami lies) with SCA3/MJD were identified at HCPA. The 367 patients who dicl the molecular examinaLion were analyzecl. Its average ao ± SD (range) was 34.1 ± 11 (5-59) years. Six families of eight patients, ali heterozygous for CAGexp were identified MJD-chilclhood-onset group (2.2% ). Seven of the eight MJDchildhood- onset group (87.5%) were female (p = 0.057), ao of the symptoms of MJDchildhood- onset group ranged between 5 and 10 years wiLh a median of 8 and interquartile range 3 years. The CAGexp ranged 80-91 repetitions. The ann ual progression of NESSCA was 0.8 poinLs on average in Lhe Control-PL group anel 2 points on average in MJDchildhood- onset group (p = 0.001). The progression of SARA was 0.6 points per year on average in the Controi-PL group anel 2.3 points in average MJD group in childhood-onset (p = 0.001). The scale NESSCA was divided in subscales considering pyramidal signs, extrapyramidal signs, ataxia, peripheral signs, dysphagia, dysarthria and oculomotor and compareci to progression in both groups. The progression of these subscales was compareci between the two groups.

Orientadores: Íscia Lopes-Cendes, Tiago Campos Pereira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-16T04:52:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lopes_CamilaMiranda_M.pdf: 829941 bytes, checksum: 12321a46db80c3af2cd6c71e4d97fd00 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A ataxia espinocerebelar do tipo 3 (SCA3), também conhecida como doença de Machado-Joseph (DMJ), pertence ao grupo das doenças neurodegenerativas por expansão de poliglutamina e é o tipo de ataxia de herança autossômica dominante mais comum em muitos países. Os efeitos clínicos são variados, incluindo a coordenação motora anormal e morte precoce. O gene MJD1, responsável pela doença, codifica a proteína ataxina-3, uma ubiquitina protease do sistema ubiquitina-proteossomo. Esta proteína quando mutada contém uma expansão consecutiva de 51-86 glutaminas, em contraste com a ataxina-3 normal que apresenta 14-44 glutaminas. Os mecanismos envolvidos na doença estão principalmente relacionados ao mal enovelamento e consequente agregação da proteína mutada, disfunção neuronal e morte celular por apoptose nos neurônios afetados. A investigação de estratégias que interfiram diretamente nos efeitos citotóxicos da doença representa, portanto, um importante enfoque terapêutico. O objetivo deste trabalho foi desenvolver um modelo in vitro dos efeitos citotóxicos da ataxina-3 mutada a fim de avaliar diferentes estratégias terapêuticas para o controle desses efeitos. O modelo in vitro para a DMJ foi estabelecido com sucesso utilizando a sequência completa do cDNA da ataxina-3 expandida codificando 84 glutaminas. A análise fenotípica das culturas celulares mostrou que nosso modelo apresenta os principais efeitos fenotípicos e citotóxicos da doença, como a formação de agregados protéicos e indução de morte celular. Nós investigamos três estratégias terapêuticas com a finalidade de diminuir a morte celular no modelo in vitro. A primeira, utilizando uma chaperona química (glicerol) teve o intuito de estabilizar a conformação nativa da proteína, auxiliando no enovelamento correto da mesma. Os sais de lítio provavelmente atuam modulando a expressão gênica e poderiam reverter os efeitos citotóxicos causados pela ataxina-3 expandida que levam à disfunção neuronal e à morte celular. A terceira estratégia focou na atenuação da disfunção mitocondrial através de um cofator mitocondrial e antioxidante poderoso, a coenzima Q10. O glicerol, lítio e coenzima Q10 aumentaram a viabilidade das células expressando a ataxina-3 expandida em 16%, 17% e 11%, respectivamente. O aumento de viabilidade resultou da diminuição da população celular em apoptose. Atualmente não existem tratamentos eficazes contra a DMJ, daí a importância de se estudar compostos capazes de reduzirem os efeitos citotóxicos da doença. Esse trabalho estabeleceu um modelo in vitro para a DMJ, bem caracterizado, fácil de ser manipulado no laboratório e de análise fenotípica direta que poderá ser mais explorado futuramente quanto à investigação de novos alvos terapêuticos e à compreensão dos mecanismos moleculares envolvidos na patologia da doença. Nossos resultados indicam que o glicerol, o lítio e a coenzima Q10 são bons candidatos para prevenir a morte celular causada pela ataxina-3 expandida e, portanto, estudos adicionais utilizando esses 3 compostos devem ser considerados / Abstract: Spinocerebellar ataxia-3 (SCA3), also known as Machado-Joseph disease (MJD), belongs to a group of neurodegenerative disorders caused by expansion of a polyglutamine stretch, called polyglutamine diseases. MJD is the most frequent inherited autosomal dominant ataxia in many countries. Clinical manifestations are varied, including abnormal motor coordination and early death. The protein encoded by MJD1, ataxin-3, is an ubiquitin protease that belongs to the ubiquitin-proteasome system. The responsible for MJD is a trinucleotide repeat expansion (CAG), which leads to an elongated polyglutamine tract in the encoded ataxin-3 protein, varying from 51 to 86 glutamines. On the other hand, normal alleles range between 14 and 44. The mechanisms underlying the disease are mainly related to protein misfolding and aggregation, neuronal dysfunction followed by cell death within the affected neurons. Investigation of strategies that interfere directly with disease cytotoxic effects represents an important therapeutic approach. The objective of this study was to develop an in vitro model that presented the main expanded ataxin-3 cytotoxic effects in order to evaluate different therapeutic strategies to control these effects. The in vitro model for MJD was successfully established using the complete ataxin-3 cDNA coding 84 glutamines. We confirmed that the model presented the main phenotypic and cytotoxic effects of the disease, such as protein aggregates and induction of cell death. We investigated three therapeutic strategies aiming cell death reduction in our in vitro model. The first, using a chemical chaperone (glycerol), was designed to stabilize the native protein and help protein folding. Lithium probably acts by modulating gene expression, and it was used in order to reverse the cytotoxic effects resulted from the disease, such as neuronal dysfunction and cell death. The third strategy focused on attenuation of mitochondrial dysfunction via a mitochondrial cofactor and powerful antioxidant, coenzyme Q10. Glycerol, lithium and coenzyme Q10 increased the viability of cells expressing expanded ataxin-3 in 16%, 17% and 11%, respectively. This augmentation resulted from a decrease in cell population undergoing apoptosis. Currently, there are no effective treatments against MJD, hence the importance of studying compounds capable of reducing disease cytotoxic effects. This work established an in vitro model for MJD, well characterized, and easy to be manipulated and analyzed. This model can be further explored for therapeutic investigations and for better understanding of molecular mechanisms involved in disease pathology. Our results indicate that glycerol, lithium and coenzyme Q10 are good candidates for preventing cell death caused by expanded ataxin-3 and, therefore, further studies with these 3 compounds should be considered / Mestrado / Neurociencias / Mestre em Fisiopatologia Médica

Orientador: Agricio Nubiato Crespo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-11T17:54:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Wolf_AlineEpiphanio_D.pdf: 3440807 bytes, checksum: 46b332aa8ad7691ac064a230e07421cd (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Introdução: Machado-Joseph (DMJ) é doença degenerativa, de herança autossômica dominante, comum em populações de origem portuguesa. Pertence à classe das desordens genéticas chamadas de doenças da tripla repetição. A mutação original envolve a repetição anormal do código "CAG" no cromossomo 14q. A prevalência estimada no Brasil é de 1:100.000. Os sintomas polimorfos aparecem entre 30 e 50 anos. A doença Inicia-se com modificações musculares, alterações de marcha e equilíbrio, ataxia, movimento involuntário de olhos e diplopia. O processo degenerativo acomete diferentes regiões e/ou funções do sistema nervoso central e/ou periférico, entre elas áreas e vias responsáveis pelo controle motor da fonoarticulação e da deglutição. Com o desenvolvimento da doença, a capacidade de comunicação e deglutição vai se restringindo e a utilização de métodos alternativos passa a ser recurso importante. A intervenção fonoaudiológica nas alterações de deglutição é importante, pois na maioria dos casos a dificuldade de deglutir pode causar pneumonia aspirativa. O Objetivo deste estudo é caracterizar a fonoarticulação na DMJ, correlacionar com tamanho do tripleto CAG, tempo de evolução da doença, idade de início dos sintomas e tipo clínico além de caracterizar a deglutição num grupo de pacientes. Método: Participaram 33 pacientes com DMJ que tiveram amostra de fala espontânea e gesto motor de fala alternada (GMFA - /pa/ /ta/ /ka/ /pataka/ /a/) gravadas dos quais 12 se submeteram à videoendoscopia da deglutição. As análises do material gravado foram feitas de três formas distintas. A primeira realizada com 31 pacientes, foi análise da inteligibilidade de fala de trecho de 5 segundos de fala espontânea, em única audição, com fone, por três fonoaudiólogos experientes que realizaram transcrição grafêmica. A segunda análise, perceptiva auditiva, com número de audições livre, foi feita seguindo o protocolo adaptado da Mayo Clinic para disartria, com os mesmos avaliadores. Para terceira análise utilizando GMFA, participaram 28 pacientes que tiveram suas amostras de GMFA avaliadas pelo programa Motor Speech Profile da Kay Pentax que extraiu média de duração do período vogal consoante (Ex. /pa/) em ms, o número de sílabas por segundo, o desvio padrão do período (ms), o coeficiente de variação do período(%) e a perturbação do período(%). Essas análises foram comparadas com banco de vozes normativo um a um por gênero. Para análise da deglutição foi realizada a videoendoscopia utilizando protocolo do ambulatório de Disfagia Unicamp. Resultados e Conclusões: A fonoarticulação é caracterizado por alterações de Pitch, qualidade vocal, ressonância e pressão intra oral, inteligibilidade, prosódia e articulação. Esses dados apresentam grau alto ou moderado de correlação com idade de início da doença e tamanho de expansão do CAG . Quanto a GMFA o grupo DMJ é significativamente diferente do grupo controle e o tempo de duração da doença se correlaciona com o pior desempenho de execução da GMFA. Com relação à deglutição podemos concluir que existem alterações na fase faríngea da deglutição nos pacientes com DMJ, por alteração do controle motor oral, que dificulta a manipulação de maior viscosidade e volume na cavidade oral, aumentando a ocorrência de estases e penetrações. / Abstract: Introduction: Machado-Joseph (MJO) is a degenerative, autosomal dominant inherited disease, common to populations of Portuguese descent. It is a form of triplet repeat genetic disorder. The original mutation is caused by an abnormal repetition of the CAG code on chromosome 14q. The estimated prevalence in Brazil is 1: 1 00,000. The polymorphic symptoms appear between ages 30 and 50. The disease begins with various muscle alterations, difficulty in walking and balance, ataxia, involuntary eye movement, and double vision. The degenerative progression damages different areas and/or functions of the central and/or peripheral nervous system(s), among these, the areas and channels responsible for the motor control of speech and deglutition. As the disease advances, the ability to communicate and deglutition become hindered, and the use of alternative methods becomes an important resource. Speech therapy interventions aimed at the alterations in deglutition are important, as most cases of difficulty in swallowing can cause aspiration pneumonia. The Objective of this study is to characterize phono-articulation in MJO and correlate it to the size of the CAG triplet, the time the disease takes to evolve, the age at which the first symptoms were detected, and clinical type, and characterize the deglutition in this group. Method: Thirty-three MJO patients participated by recording samples of their spontaneous speech and motor gesture of alternate speech (GMFA - Ipal Ital Ikal Ipatakal la/), and 12 patients underwent videoendoscopies of their deglutition. The analysis of the recorded material was carried out in three distinct forms. The first, tested on ali patients, was the analysis of the intelligibility of a five-second passage of spontaneous speech, in a single listening through an earphone, by three experienced speech therapists who registered a phonetic transcription. The second form, hearing perception, now with a free number of listening trials, was performed by the same evaluators by following the protocol adapted by the Mayo Clinic for dysarthria. The third form, employing GMFA, 28 patients had their GMFA samples evaluated by the Motor Speech Profile program by Kay Pentax, which obtained the average duration of the vowel consonant pedod (Ex. Ipa/) in ms, the number of syllables per second, the deflection standard of the period (ms), the variable coefficient of the period (%) and the perturbation of the period (%). These analyses were compared to normative voice banks, one by one, according to category. For the deglutition analysis, the protocol of Unicamp's dysphagia medical clinic was adopted. Results and Conclusions: The phono-articulation is characterized by alterations in pitch, vocal quality, resonance and intra-oral pressure, intelligibility, pronunciation and articulation. These data presented a high to moderate degree of correlation with age at which the disease manifested and the size of the CAG expansion. As to the GMFA trials, the MJO group was significantly different from the control group, and the time span of the disease correlates to the worst capacity to perform the GMFA. In relation to deglutition, we can conclude that alterations do exist in the pharyngeal phase of swallowing in patients suffering from MJO due to alterations in the control of the oral motor, which hampers the manipulation of larger viscosities and volume in the oral cavity, increasing the occurrences of stasis and penetrations. / Doutorado / Ciencias Biomedicas / Doutor em Ciências Médicas

Orientadores: Marcondes Cavalcante França Junior, Anamarli Nucci / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-21T18:19:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Takazaki_KarenAntoniaGirotto_M.pdf: 1348260 bytes, checksum: 48e434fbe077053824d92b0221e439fc (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A SCA3/MJD é a ataxia hereditária mais freqüente em nosso meio e apresenta sintomatologia bastante variada, incluindo aspectos motores e não - motores. Dentre estes, ressaltamos a disfunção autonômica, achado pouco estudado e muitas vezes subestimado nestes pacientes. Neste estudo tivemos por objetivos: 1. determinar a frequência e a intensidade das manifestações autonômicas na SCA3/MJD; 2. avaliar se a disfunção autonômica envolve o sistema simpático e/ou o parassimpático; 3.determinar se existe correlação entre as manifestações autonômicas, parâmetros genéticos e clínicos; e 4. verificar se existe correlação entre as manifestações autonômicas e o envolvimento do sistema nervoso periférico. Para isso realizamos uma avaliação clínica e eletrofisiológica em 40 pacientes com confirmação molecular da doença e 38 controles saudáveis pareados por idade e sexo. Ambos os grupos foram submetidos a exame clínico, incluindo o uso da escala SARA (Scale for the Assessment and Rating of Ataxia), o questionário SCOPA-AUT (Scales for Outcomes in Parkinson's Disease - Autonomic Questionnaire), além da aferição da pressão arterial nas posições supina e ortostática. Também realizamos o estudo da variabilidade da frequência cardíaca no repouso, no desafio ortostático (razão 30:15), durante a manobra de Valsalva (índice de Valsalva) e na respiração profunda (razão E:I). Realizamos ainda a análise espectral dos intervalos RR no repouso e a resposta simpática cutânea. As queixas mais frequentes dos pacientes relacionam-se aos sintomas do controle urinário, cardiovascular e sudomotor. Observamos diferença significativa na média dos intervalos RR em repouso dos pacientes em relação aos controles (811,8 x 933,4 ms; p=0,001). A análise da razão 30:15 também mostrou diferença significativa entre os dois grupos (1,10 x 1,15; p=0,038). Já o índice de Valsalva e a razão E:I não mostraram diferença significativa (p=0,373 e p=0,08). A análise espectral mostrou diferença significativa entre os grupos, em relação ao LFPA (poder de baixa frequência), com média de 23,6 x 43,3 ms² (p<0,001), e ao HFPA (poder de alta frequência), com média de 28,8 x 54,4ms² (p<0,001). Obtivemos a frequência de 30% de disautonomia cardiovascular e 45% de disautonomia simpática sudomotora nos pacientes com SCA3/MJD. Verificamos envolvimento tanto do simpático quanto do parassimpático. Não observamos correlação entre as manifestações autonômicas e parâmetros genéticos (tamanho da expansão CAG) ou clínicos, mas encontramos correlação entre disfunção autonômica simpática sudomotora e o envolvimento do sistema nervoso periférico / Abstract: SCA3/MJD is the most frequent autosomal dominant ataxia worldwide and characterized by a variety of symptoms, including motor and non-motor manifestations. Autonomic dysfunction has been described in SCA3/MJD, but there are only small studies and several important questions remain unanswered. In this study we had the following objectives: 1. To determine the frequency and the intensity of the autonomic manifestations in SCA3/MJD. 2. To evaluate whether the autonomic dysfunction compromises the sympathetic and/or the parasympathetic system. 3. To identify possible correlations between the autonomic manifestations, genetic and clinical parameters. 4. To verify whether there is correlation between the autonomic manifestations and peripheral nervous system damage. We have thus performed clinical and electrophysiological evaluation of 40 patients with molecular confirmation of SCA3/MJD and 38 healthy controls matched by age and gender. In the clinical study we used the SARA scale (Scale for the Assessment and Rating of Ataxia), the SCOPA-AUT questionnaire (Scales for Outcomes in Parkinson's Disease - Autonomic Questionnaire), and we measured blood pressure in supine and orthostatic positions. We also studied the heart rate variability at rest, during the orthostatic challenge (30:15 ratio), during the Valsalva maneuver (Valsalva index) and deep breathing (E:I ratio). We included in our study the spectral analysis of the RR intervals at rest and the cutaneous sympathetic response. The most frequent complaints in our patients are related to urinary, cardiovacular and sweat control. We found significant difference of the mean RR intervals at rest between patients and controls (811.8 x 933.4 ms; p=0.001 respectively). The 30:15 ratio was also different between the two groups (1.10 x 1.15; p=0.038 respectively). The Valsalva index and the E:I ratio were similar between the groups (p=0.373 and p=0.08). Spectral analysis presented distinct results in patients and controls, related to LFPA - low frequency power (p<0.001) and to HFPA - high frequency power (p<0.001). We found cardiovascular and sympathetic sweat disautonomia in 30% and 45% of the patients with SCA3/MJD, respectively. We found evidence of both sympathetic and parasympathetic dysfunction. We did not find correlation between autonomic manifestations and genetic (CAG repeat length) or clinical parameters, but we found correlation between sympathetic sweat autonomic dysfunction and peripheral nervous system damage / Mestrado / Neurologia / Mestra em Ciências Médicas