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Esta tesis doctoral consiste en la caracterización de la ciclina meiótica Rem1, de Schizosaccharomyces pombe. En este trabajo se analizó, inicialmente, el patrón de transcripción y expresión de rem1 durante la meiosis observando que el pico de expresión se produce durante la meiosis I, la actividad quinasa del complejo ciclina-Cdk también coincide con la meiosis I. Seguidamente, se determinó que la transcripción del mRNA maduro de rem1 depende de Mei4 a través de las cajas FLEX del promotor de rem1. También se observó la presencia de un RNA "antisense" que se transcribe durante las primeras horas de la meiosis. A continuación, se estudió la función de Rem1 durante la meiosis determinando una función de esta ciclina en la meiosis I. Se observó la toxicidad de Rem1 expresado durante el ciclo mitótico. Posteriormente, se analizaron posibles interacciones genéticas con otras ciclinas meióticas detectando que Rem1 tiene una función redundante con Cig2 durante la fase S meiótica. También se determinó la necesaria presencia de rem1 para conseguir unos niveles de recombinación meiótica intragénica normales, mientras que se requiere para la recombinación intergénica. / The main goal of this doctoral thesis is the characterization of the meiotic cyclin Rem1, in Schizosaccharomyces pombe. First of all we analized the transcription and expresion profiles of rem1 during meiosis. We observed the maximum of expresion during meiosi I and the kinase activity of the complex cyclin-Cdk had exactly the same profile. Then, we analized the transcription profile of the mature mRNA of rem1, showing that this transcription depends on Mei4 through the FLEX boxes which are loclized in the rem1 promoter. An antisense RNA was also detected at the begining of the meiosis. We next diceded to study the function of this cyclin. Firstly we observed that overexpression of Rem1 is toxic for the cell during mitotic cell growth. Moreover, a function for Rem1 was observed during meiosis I. Rem1 is also required in order to obtain normal levels of meiotic intragenic recombination, but it is not necesary for the intergenic recombination. Finally, we could detect a genetic interaction betwen Rem1 and the meiotic S phase cyclin, Cig2.

Η διατήρηση της γονιδιωματικής ακεραιότητας είναι απαραίτητη για την επιβίωση των κυττάρων και κατ’ επέκταση των οργανισμών. Δύο είναι οι κύριοι παράγοντες που συμβάλλουν στην διαφύλαξη της σταθερότητας του γονιδιώματος: η ορθή διεξαγωγή της αντιγραφής, που είναι σημαντική για την, χωρίς λάθη, μεταβίβαση του γενετικού υλικού από γενιά σε γενιά και η ανάπτυξη μηχανισμών επιδιόρθωσής του σε περίπτωση παρουσίας βλαβών. Ανάμεσα στα μόρια που συμμετέχουν στις δύο παραπάνω κυτταρικές διεργασίες, συγκαταλέγεται και ένα από τα πέντε μέλη της εξελικτικά συντηρημένης οικογένειας των RecQ ελικασών, η RecQ4 ελικάση. Η RecQ4 είναι συνδεδεμένη με την εμφάνιση του συνδρόμου προγηρίας Rothmund-Thomson και ξεχωρίζει από τα άλλα μέλη της οικογένειας στο ότι, πέραν του ρόλου της στην επιδιόρθωση του γενετικού υλικού, είναι απαραίτητη για την έναρξη της αντιγραφής του DNA. Η μελέτη του συγκεκριμένου μορίου στον άνθρωπο παρουσιάζει δυσκολίες λόγω της περιπλοκότητας του συστήματος. Στον Σχιζοσακχαρομύκητα, η ομόλογη πρωτεΐνη της RecQ4, Hrq1, αναγνωρίστηκε πρόσφατα και τα δεδομένα που έχουμε για την δράση της είναι περιορισμένα. Η μελέτη της Hrq1 στο απλούστερο σύστημα του Σχιζοσακχαρομύκητα θα διαλευκάνει τον άγνωστο, μέχρι στιγμής, ρόλο της στον οργανισμό αυτό ενώ παράλληλα θα βοηθήσει στην κατανόηση του ακριβή ρόλου του ανθρώπινου ομολόγου της. Στο πρώτο μέρος της παρούσας εργασίας μελετήθηκε ο ρόλος της Hrq1 ελικάσης στη διαδικασία της αντιγραφής, μέσω παρατήρησης φαινοτυπικών αλλαγών που παρουσιάζουν τα κύτταρα που φέρουν απαλοιφή της ελικάσης σε σχέση με κύτταρα αγρίου τύπου. Επίσης, διερευνήθηκαν αλληλεπιδράσεις της Hrq1 με μόρια που σχετίζονται με την διαδικασία της αντιγραφής στον Σχιζοσακχαρομύκητα, χρησιμοποιώντας τη μέθοδο της συνανοσοκατακρήμνησης. Στο δεύτερο μέρος, μελετήθηκε η δράση της ελικάσης στη διαδικασία της επιδιόρθωσης και πιο συγκεκριμένα στην επιδιόρθωση βλαβών που προκαλούνται από το αντικαρκινικό φάρμακο cisplatin, χρησιμοποιώντας και πάλι φαινοτυπική ανάλυση. Τέλος, ελέγχθηκαν πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις της Hrq1, που μπορεί να σχετίζονται με τη ρύθμιση της έκφρασής της in vivo. / The maintenance of genome integrity is essential for cell survival and therefore for survival of the organism. There are two major factors contributing to the preservation of genome stability: acurate DNA replication, which is important for the intact transfer of the genome to the next generation and DNA repair mechanisms, which act in the presence of DNA damage.There are many different molecules involved in the aforementioned cellular processes, including a helicase called, RecQ4. This enzyme belongs to the evolutionarily conserved family of RecQ helicases and is one of the five members of the family, in humans. RecQ4 is linked to Rothmund-Thomson premature aging syndrome and it is unique amongst RecQ helicases in being required for the normal initiation of DNA replication. Studying RecQ4 in humans has difficulties, because of the complexity of the system. In fission yeast, the RecQ4 homologue, called Hrq1, has been recently recognized as a member of the family and there is limited evidence, concerning its function. The study of Hrq1 in a model system, like fission yeast, will not only elucidate its role in this organism, but will also assist in understanding the role of its human orthologue. In the first part of this study we determined the role of Hrq1 helicase in DNA replication, by observing phenotypic changes in cells bearing the helicase deletion, compared to wild-type cells. We, also, investigated protein-protein interactions between Hrq1 and molecules related to the process of DNA replication in Schizosaccharomyces pombe, using co-immunoprecipitation. In the second part, the role of Hrq1 in DNA damage repair was investigated. Specifically, we examined how Hrq1 affects the cellular response to cisplatin, using phenotypic analysis. Finally, we looked into protein-protein interactions of Hrq1, that are related to the regulation of its expression in vivo.

Le repliement des protéines est un processus cellulaire crucial impliquant plusieurs protéines dont la calnexine, une chaperone du réticulum endoplasmique. Notre laboratoire et un autre groupe avons démontré que la calnexine est essentielle à la viabilité de la levure Schizosaccharomyces pombe. Dans le cadre d’études structure-fonction portant sur cette protéine, nous avons découvert un phénomène permettant la viabilité des cellules en absence de la calnexine. Cet état, nommé Cin pour calnexine independence, est induit par un mutant de la calnexine dépourvu du domaine central hautement conservé (Δhcd_Cnx1p). La caractérisation de l’état Cin a révélé plusieurs caractéristiques particulières telle la dominance, sa transmission de façon non-Mendélienne à la progéniture méïotique et sa transmission par des extraits protéiques dépourvus d’acides nucléiques. Toutes ces propriétés suggèrent donc que l’état Cin est médié via un élément de type prion. Le gène cif1+, pour calnexin independence factor, a été isolé lors de criblages visant à identifier des gènes impliqués dans l’état Cin. Il encode pour une protéine orpheline dont la surexpression induit de façon stable un état de viabilité en l’absence de la calnexine. Cet état diffère génétiquement et phénotypiquement de l’état Cin induit par le mutant Δhcd_Cnx1p préalablement caractérisé, ce qui suggère deux voies parallèles de signalisation du phénomène Cin. Une caractérisation exhaustive de Cif1p a permis de démontrer qu’il ne s’agissait pas du prion responsable de l’état Cin, malgré que cette protéine possède certaines propriétés typiques des prions in vitro. Finalement, Cif1p est une protéine nucléolaire dont la bonne localisation est essentielle à sa capacité à induire l’état Cin. Ceci suggère une interaction entre la fonction essentielle de la calnexine et une fonction exécutée dans le nucléole. Lors d’études visant à élucider la fonction cellulaire de Cif1p, il a été établi qu’elle interagissait avec certaines protéines de la grosse sous-unité du ribosome telle la protéine L3. Cependant, Cif1p ne co-sédimente pas avec des sous-unités ribosomales assemblées, des ribosomes ou des polysomes. De plus, des cellules contenant une délétion génomique de cif1 voient leur contenu en ribosomes perturbé lors de la phase stationnaire. Il semble donc que Cif1p joue un rôle dans la biosynthèse des ribosomes lors de la phase stationnaire. Ce rôle spécifique à cette phase de croissance coincide avec un clivage de la portion N-terminale de Cif1p, clivage qui a lieu lors de l’entrée des cellules en phase stationnaire. De plus, des études effectuées récemment dans notre laboratoire proposent que la calnexine joue un rôle important dans la signalisation de l’apoptose, et ce particulièrement en phase stationnaire. Ainsi, une voie impliquant Cif1p, sa fonction nucléolaire dans la biosynthèse des ribosomes en phase stationnaire, la calnexine et la médiation de l’apoptose semble se dessiner. D’autres travaux, notamment sur la fonction exacte de Cif1p, le rôle de son clivage et les autres composantes impliquées dans le phénomène Cin nous permettront de dessiner un portrait plus complet de cette voie cellulaire inédite. / Protein folding is a vital process that involves many proteins of the cell. One of them is calnexin, a chaperone of the endoplasmic reticulum. In the fission yeast Schizosaccharomyces pombe, calnexin is essential for survival of the cells. During structure-function studies on calnexin, our laboratory discovered a phenomenon allowing the viability of cells without this chaperone. This state, designated Cin for Calnexin INdependence, is induced by a calnexin mutant devoid of the highly conserved central domain (Δhcd_Cnx1p). Characterization of the Cin cells showed several exceptional properties such as dominance, non-Mendelian transmission and transmission via cell extracts devoid of nucleic acids of the Cin state. All these observations suggested that the Cin phenomenon is mediated via a prionic element. To identify genes implicated in the Cin state, genetic screens were performed. They led to the identification of the cif1+ gene, for calnexin independence factor. This gene encodes an orphan protein, the overexpression of which stably induces a state of viability in the absence of calnexin. Notably, this state is genetically and phenotypically distinct from the previously isolated Cin state arising from Δhcd_Cnx1p expression. This suggests the presence of two parallel pathways both able to signal the induction of the Cin phenomenon. The exhaustive characterization of Cif1p showed that it is not the prion solely responsible for the Cin state, although it displays prion-like properties in vitro. Finally, nucleolar localization of Cif1p is required to induce the Cincif1 state, thus suggesting an unexpected interaction between the vital cellular role of calnexin and a function of the nucleolus. While investigating Cif1p function in the cell, we observed that it interacts with ribosomal proteins of the large subunit, notably L3, but it does not sediment with assembled ribosomal subunits or whole ribosomes. However, cells containing a genomic deletion of cif1 also have a disrupted ribosome content during stationary phase. Altogether, these results suggest that Cif1p has a role in ribosomal biogenesis during stationary phase. This growth-phase specific role correlates with the occurence during stationary phase of a cleavage in the N-terminal part of Cif1p. Recent studies from our laboratory proposed that calnexin plays an important role in apoptosis signaling, especially in stationary phase. Thus, a pathway implicating Cif1p, its nucleolar function in ribosome biosynthesis in stationary phase, calnexin and apoptosis signaling is starting to emerge. However more studies, notably on the exact function of Cif1p, the role of its cleavage and the other proteins implicated in the Cin state will be necessary to draw the complete scheme of this unprecedented cellular pathway.

Au laboratoire du Dr. Bachand, l’orthologue chez la levure à fission de la protéine humaine PABPN1 qui est reliée à la dystrophie musculaire oculopharyngée a été découvert. Cette protéine se nomme Pab2. Elle a une localisation nucléaire, fait la navette entre le noyau et le cytoplasme, et les arginines de son domaine arginine riche sont asymétriquement diméthylées tout comme son orthologue humain. Bien que ces protéines aient une localisation nucléaire, aucune étude in vivo n’a été effectuée afin d’élucider leur mécanisme d’import nucléaire. Dans mon premier projet de recherche, la levure à fission a été utilisée pour caractériser le mécanisme d’import nucléaire de ces protéines liant les queues poly(A). Il a été démontré que Pab2 détient un signal de localisation nucléaire de type PY-NLS qui est suffisant et nécessaire à sa localisation nucléaire ainsi qu’à l’exécution de ses fonctions. De plus, il a été démontré que le PY-NLS de Pab2 provoque l’internalisation nucléaire de la protéine hétérologue GST-GFP-Pab2 (139-166). De concert avec un système d’import nucléaire de type PY-NLS, une délétion de la karyophérine Kap104, orthologue de la Kap?2 qui est le transporteur des cargos PY-NLS, engendre un défaut d’import nucléaire de Pab2. S’ensuit aussi par la démonstration d’une interaction physique directe entre Pab2 et Kap104. Il a été observé que la méthylation du domaine arginine riche en C-terminal, où se retrouve le PY-NLS, n’affecte pas la localisation de Pab2. Toutefois, dans un contexte où Pab2 détient un signal de localisation nucléaire sub-optimal ; la méthylation du domaine arginine riche réduit son efficacité d’import nucléaire. Finalement, une vérification in vivo de l’importance du mécanisme d’import de type PY-NLS de PABPN1 par un système d’inhibition spécifique de la Kap?2 a permis de confirmer que ce mécanisme d’import n’est pas nécessaire à sa localisation nucléaire. Suggérant la présence de systèmes d’imports nucléaires redondants ainsi que la possibilité d’une autre voie d’import nucléaire prioritaire pourPABPN1. Une analyse transcriptomique par micropuce d’ADN a permis d’identifier divers gènes surexprimés dans une cellule pab2?. Une des classes de gènes qui ont été identifiés se réfère à des éléments génétiques mobiles se dénommant Tƒ2 chez la levure à fission. La confirmation de l’accumulation d’environ deux fois des transcrits Tƒ2 dans une souche pab2? par buvardage Northern a fit naître mon deuxième projet de recherche. Plusieurs études ont démontré que Pab2 agit dans la même voie que Rrp6, une exonucléase 3’-5’, dans la maturation et la dégradation de divers transcrits de façon post-transcriptionnelle. Afin de corroborer une répression post-transcriptionnelle des Tƒ2 par Pab2; un essai génétique a été effectué en combinant sa délétion à celle d’une protéine, Abp1, connue pour réprimer de façon transcriptionnelle ces Tƒ2. Étonnamment, une diminution d’accumulation de transcrits Tƒ2 a été observée dans le double mutant comparativement au simple mutant abp1?. Une immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) par la Pol II a permis de confirmer que ce phénotype était d’ordre transcriptionnel. Les essais de ChIP ont aussi permis de corroborer un rôle post-transcriptionnel de répression des Tƒ2 par Pab2. Il a été démontré par un autre groupe de recherche qu’il y a activation du RNAi envers les Tƒ2 qui mènent à l’établissement d’une marque d’hétérochromatine dans un mutant rrp6?. Un dépistage de transcrits antisens aux Tƒ2 a permis d’en identifier un qui accumule dans un double mutant abp1?/pab2?. Il a aussi été observé que ce transcrit antisens accumule à des étapes spécifiques de la méiose. De plus, son accumulation dans des mutants génétiques ou bien en méiose corrèle négativement avec l’accumulation de l’ARNm des Tƒ2. [symboles non conformes]

L'interférence à l'ARN (RNAi) est un mécanisme cellulaire connu pour inhiber l'expression de gènes avec une grande spécificité de séquence. Chez la levure Schizosaccharomyces pombe, ce processus induit des modifications de structure de la chromatine et implique une interaction entre un ARN naissant et un petit ARN associé au complexe du RNAi, RITS (RNA-induced Initiation of Transcriptional gene Silencing). RITS cible les régions répétées et non codantes et joue un rôle essentiel dans l'intégrité de l'hétérochromatine de ces sites génomiques. Une étude a mis en évidence la présence de la sous-unité Argonaute 1 du complexe RITS, ainsi qu'une marque de l'hétérochromatine, la méthylation de la lysine 9 de l'histone H3 (H3K9me), au niveau de la chromatine de deux gènes méiotiques, mei4 et ssm4. Ceci suggérait une nouvelle fonction du RNAi dans la différenciation sexuelle. Au cours de ma thèse, j'ai montré que la protéine de liaison à l'ARN Mmi1 (Meiotic mRNA interception protein 1), permet à RITS de s'associer spécifiquement à la chromatine et à l'ARN messager de ces gènes méiotiques. La protéine Mmi1 orchestre une répression post-transcriptionnelle de gènes méiotiques spécifiques, une activité de " silencing " essentielle au contrôle de la différenciation sexuelle. Nous avons mené une analyse de l'ensemble du transcriptome dans une souche déficiente pour Mmi1, ce qui nous a conduits à l'identification de nouveaux ARNm méiotiques ciblés directement par Mmi1 et le RNAi. Curieusement, la chromatine des gènes méiotiques correspondants ne présente pas systématiquement la marque épigénétique répressive H3K9me, ce qui suggère que le RNAi pourrait réprimer certains gènes codants seulement au niveau post-transcriptionnel. En parallèle, en combinant des techniques de génétique, de biologie moléculaire et de physiologie cellulaire, nous mettons en évidence un probable rôle direct du RNAi dans l'inhibition de la différenciation sexuelle. Nous proposons que le RNAi pourrait coopérer avec Mmi1 pour bloquer de manière efficace une partie du programme transcriptionnel méiotique durant le cycle végétatif. Cette régulation serait essentielle pour l'activation appropriée de ce programme au cours de la progression de la différenciation sexuelle.

In Schizosaccharomyces pombe, the MAPK pathway Sty1 is activated upon several stress situations, like osmotic and oxidative stress, stationary phase, UV radiation or heat shock. Since the modulation of gene expression is one of the main outputs of this response, we focused this Thesis work on the charactherization of the transcription regulation by the activation of the Sty1 pathway and through the transcription factors Atf1 and Pcr1. Moreover, we extend our field of interest investigating how stress–related chromatin remodelers are affecting the stress defence transcription of the cells. / En Schizosaccharomyces pombe, la vía de la MAPK Sty1 es activada ante diferentes situaciones de estrés, como son el estrés oxidativo u osmótico, fase estacionaria, radiación UV o choque de calor. Al ser la modulación de la expresión génica uno de los más importantes objetivos de esta respuesta, hemos focalizado el trabajo de esta Tesis doctoral en la caracterización de la regulación transcripcional mediada por la activación de la ruta de Sty1 y los factores de transcripción Atf1 y Pcr1. Además, hemos ampliado nuestra área de interés investigando el papel de remodeladores de cromatina relacionados con la respuesta a estrés y cómo a participan en la transcripción estrés-dependiente.

Th. : Göteborg : 1998. / Notes bibliogr.

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The DNA replication checkpoint transcriptionally up-regulates genes that allow cells to adapt to and survive replication stress. Our results show that, in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe, the replication checkpoint regulates the entire G1/S transcriptional program by directly regulating MBF (aka DSC1), the G1/S transcription factor. Instead of initiating a checkpoint-specific transcriptional program, the replication checkpoint targets MBF to maintain the normal G1/S transcriptional program during replication stress. We propose a mechanism for this regulation, based on in vitrophosphorylation of the Cdc10 subunit of MBF by the Cds1 replication-checkpoint kinase. Substitution of two potential phosphorylation sites with phospho-mimetic amino acids suffice to promote the checkpoint transcriptional program, suggesting that Cds1 phosphorylation directly regulates MBF-dependent transcription. The conservation of MBF between fission and budding yeast, and recent results implicating MBF as a target of the budding yeast replication checkpoint, suggest that checkpoint regulation of the MBF transcription factor may be a conserved strategy for coping with replication stress. Furthermore, the structural and regulatory similarity between MBF and E2F, the metazoan G1/S transcription factor, suggests that this checkpoint mechanism may be broadly conserved among eukaryotes. Our result shows that both the replication checkpoint and the S-phase DNA damage checkpoint are involved in activating MBF regulated S-phase gene transcription and that this coordinated transcriptional response is beneficial for survival during replication stress. I demonstrate that the beneficial role of the transcriptional response during checkpoint activation is mediated by three major MBF transcripts: cdc22, mrc1 and mik1. Mrc1 dependent stabilization of stalled fork is important during S phase arrest. However, cells ability to prevent mitosis (Mik1 dependent) along with stable fork (Mrc1 dependent) both are crucial for survival. Our data also suggest that the level of Cdc22 is a determining factor for replication checkpoint activation and when over-expressed can alleviate the effects not only in HU but also in MMS.