Au cours des cinq dernières années l’existence d’un contrôle de la transcription par les ARN non-codants longs (lncRNAs) a été décrite dans une large variété d’eucaryotes. Cependant, les mécanismes par lesquels les lncRNAs régulent la transcription restent en grande partie méconnus. Les premiers travaux effectués dans le cadre de cette thèse ont participé à la caractérisation du mécanisme mis en jeu par un lncRNA, nommé nam1, dans le contrôle de l’entrée en différenciation sexuelle chez la levure Schizosaccharomyces pombe. Il a ainsi été montré qu’au cours de sa synthèse le lncRNA nam1 est ciblé par la protéine de liaison à l’ARN Mmi1 et une machinerie de surveillance des ARN qui comprend l’exosome, un complexe de dégradation des ARN conservé au cours de l’évolution. La fixation de Mmi1 au lncRNA nam1 contrôle la terminaison de la transcription de nam1 et empêche ainsi la transcription de se poursuivre et d’interférer alors avec la transcription du gène situé en aval (codant pour une MAP kinase essentielle à l’entrée en différenciation). Les travaux suivant montrent l’implication dans ce mécanisme de la protéine Cti1, un des co-facteurs connus de l’exosome. Fait marquant, ces travaux rapportent aussi l’existence d’un mode de production inédit pour un lncRNA. En effet, ils révèlent que la transcription non-interrompue d’un gène codant conduirait à la production d’un ARN bi-cistronique. La maturation co-transcriptionnelle de cet ARN bi-cistronique produirait, d’un côté, un ARN messager et, de l’autre, le lncRNA nam1. Enfin, ils ont permit la caractérisation initiale d’un nouveau composant de la machinerie de surveillance des ARN recrutée sur nam1 par Mmi1. Ainsi, dans leur ensemble, ces travaux contribuent à une meilleure connaissance des mécanismes pouvant être mis en jeu par un lncRNA et agissant en cis pour réguler l’expression génique et, à travers elle, des processus cellulaires majeurs, tel que la différenciation cellulaire. De plus, ils décrivent un nouveau mécanisme de biogénèse d’un lncRNA. / Over the last five years, the control of transcription mediated by long non-coding RNAs (lncRNAs) has been reported to take place in a wide variety of eukaryotes. However, the mechanisms by which lncRNAs regulate transcription remain relatively poorly described. The first work conducted in the context of this PhD thesis has contributed to the characterization of the mechanism used by a lncRNA, named nam1, to control entry into sexual differentiation of the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. It was shown that, while the lncRNA nam1 is being produced, it is targeted by the RNA binding protein Mmi1 and a RNA surveillance machinery that includes the exosome, a conserved complex throughout evolution. The binding of Mmi1 to nam1 lncRNA controls the termination of transcription of nam1, which prevents this non-coding transcription from interfering with the transcription of the downstream gene, coding for a MAP kinase essential to entry into differentiation. The following work shows the importance of the protein Cti1, one of the known co-factor of the exosome, in the nam1-dependent control of sexual differentiation. Remarkably, it also strongly suggests the existence of a new way of producing a lncRNA. Indeed, it reveals that read-through transcription of a protein-coding gene leads to the production of a bi-cistronic RNA, which is co-transcriptionally matured to produce on one side a messenger RNA and on the other side the lncRNA nam1. Finally, this work initiated the characterization of a new component of the RNA surveillance machinery targeting nam1. Collectively, this work brings several insights into the mechanisms used by cis-acting lncRNAs to regulate gene expression and, thereby, major cellular processes such as cell differentiation. Moreover, it also provides insights into the biogenesis of lncRNAs by reporting a new mode of production of lncRNAs.

Der Missbrauch anaboler Substanzen zur Leistungssteigerung wird von den meisten Sportverbänden, dem Olympischen Komitee und vor allem der Welt Anti Doping Agentur (WADA) abgelehnt und sanktioniert. Trotzdessen bleibt der Missbrauch derartiger Substanzen sowohl im Leistungs- als auch im Freizeitsport nicht zuletzt aufgrund der starken Nebenwirkungen ein schwerwiegendes Problem. Allein im Leistungssport sind 2009 ca. 2 % der von der WADA durchgeführten Dopingkontrollen positiv ausgefallen. Dabei konnten in 65 % der positiv-getesteten Proben muskelaufbauende anabole Substanzen nachgewiesen werden. Im Freizeitsport konzentriert sich der Missbrauch dieser verbotenen Substanzen vor allem im Bereich des Bodybuildings. Die einzige rechtlich relevante und routinemäßig genutzte analytische Methode für den Nachweis anaboler Steroide in Urinproben von Sportlern ist die Gas- oder Flüssigkeitschromatographie in Kombination mit der Massenspektrometrie. Diese Methoden sind jedoch sehr kosten- und zeitintensiv. Außerdem können dabei unbekannte Substanzen nur schwer nachgewiesen werden. Ein alternativer Ansatz zum Nachweis androgener anaboler Steroide führt über deren biologische Aktivität. Auf diesem Prinzip beruhen unter anderem Hefeassays. Diese Assays sind kostengünstig, schnell und einfach durchzuführen. In dieser Arbeit wurden zwei neue Hefeassays zum einen in der Hefe Saccharomyces (S.) cerevisiae und zum anderen in der Hefe Schizosaccharomyces (S.) pombe konstruiert und hinsichtlich ihrer Eignung zur Doping-Prescreening Analyse getestet. Diese zwei Hefen wurden genutzt, da sie phylogenetisch sehr weit voneinander entfernt sind und dadurch unter anderem einen unterschiedlichen Metabolismus und einen unterschiedlichen Aufbau der Zellwand besitzen. In Hefeassays können falsch negative und falsch positive Ergebnisse auftreten, da endokrin-wirksame Substanzen in der Hefe und im humanen Organismus eine unterschiedliche Wirkung besitzen können. Humane Zellen unterscheiden sich von Hefezellen unter anderem im Metabolismus von aufgenommenen Substanzen, in der Durchlässigkeit der Zellwand für verschiedene Stoffe und in Transportsystemen, die Substanzen aus der Zelle ausschleusen. Eine Kombination dieser beiden neu konstruierten Assays verspricht den Aktivitätsnachweis eines viel größeren Substanzspektrums, als es mit einem System allein möglich wäre, wodurch eine Reduzierung falsch negativer Ergebnisse erreicht werden kann. Als erster Schritt in dieser Arbeit wurde ein bestehendes Hefesystem von Sohoni und Sumpter (1998) charakterisiert. Der Hefestamm dieses S. cerevisiae Reportergen-Assays exprimiert den humanen Androgenrezeptor (AR) konstitutiv, da das AR Gen durch genetische Manipulation ins Genom der Hefe stabil integriert wurde. Außerdem liegt in der Hefezelle ein so genanntes Reporterplasmid vor. Dieses Plasmid trägt das lacZ Gen, welches in diesem Fall als Reportergen funktioniert und unter der Kontrolle eines androgen-sensitiven Promoters steht. Gelangen nun Androgene in diese Zellen wird das lacZ Gen abgelesen und die beta-Galactosidase gebildet. Dieses Enzym wird ins Hefemedium sekretiert und wandelt dort einen gelben in einen roten Farbstoff um. Dieser Farbumschlag kann nunmehr quantitativ gemessen und als Maß androgener Aktivität ausgewertet werden. Die Eignung dieses Reportergenassays als Doping-Prescreening Test konnte in vielfältigen Experimenten bestätigt werden. Zunächst konnten mit diesem Assay bekannte Dopingsubstanzen und deren Metabolite anhand ihrer biologischen Aktivität nachgewiesen werden. Außerdem konnte die Spezifität des Assays gegenüber Androgenen gezeigt werden, wobei Steroide anderer Klassen, wie das Mineralocorticoid Aldosteron, das künstliche Glucocorticoid Dexamethason, das Östrogen 17beta-Östradiol und das Gestagen Progesteron und außerdem das Prohormon Dehydroepiandrosteron im Hefeassay geprüft worden sind. Alle diese Substanzen zeigten keinen relevanten Signalanstieg in physiologischen Konzentrationen. Weiterhin wurde die Praktikabilität des Hefeassays für die Doping-Prescreening Analyse anhand eines Trenbolox- und eines Methyltestosteron-Ausscheidungsversuchs untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Hefen dieses Assays eine 20 %ige Urinkonzentration im Medium tolerieren und gleichzeitig die biologische Aktivität von oral eingenommenem Methyltestosteron und Estra-4,9-dien-3,17-dion (Präparatname: Trenbolox) bzw. deren Metabolite in Urinproben detektierbar ist. Außerdem wurden parallel Urinproben von Frauen und Männern, die keine androgen wirksamen Substanzen eingenommen haben, getestet. Diese Urinproben ohne exogene Zufuhr von anabolen Steroiden wiesen keinen bedeutenden Signalanstieg auf. Eine Verbesserung des ursprünglichen Reportergenassays von Sohoni und Sumpter wurde durch den Austausch des Reportergens von lacZ zum optimierten grün fluoreszierenden Protein (EGFP) erreicht. Dadurch konnte eine deutliche Verringerung der Inkubationszeit von 48 auf 24 Stunden bewirkt werden. Auch bei der Konstruktion der beiden neuen Reportergenassays in S. cerevisiae und S. pombe wurde daraufhin EGFP als Reportergen eingesetzt. Dafür wurde ein für die jeweilige Hefe spezifisches Reporterplasmid mit dem EGFP-Gen unter der Kontrolle eines androgen-sensitiven Promoters und ein spezifisches Expressionsplasmid mit dem Gen für den humanen Androgenrezeptor konstruiert und in die jeweilige Hefe eingebracht. Durch Optimierungsversuche wurde festgestellt, dass beide neu konstruierten Hefen eine identische einzusetzende Zellzahl, Inkubationszeit, Inkubationstemperatur und ein identisches Kulturvolumen besitzen. Daraus ergibt sich der Vorteil, dass beide Assays gut kombiniert werden können. Mit Hilfe beider Hefeassays konnte die Wirkung verschiedener dopingrelevanter Substanzen detektiert werden, wobei der S. cerevisiae Assay eine geringfügig höhere Sensitivität zeigte als der S. pombe Assay und sogar als der Reportergenassay von Sohoni und Sumpter. Zum weiteren Vergleich der Sensitivität beider Assays wurden drei Ausscheidungsversuche durchgeführt. Im ersten so genannten Trenbolox-Ausscheidungsversuch zeigte der S. pombe Assay in allen fünf Urinproben ein stärkeres Signal als die Referenzprobe. Im S. cerevisiae Assay konnten nur vier der fünf getesteten Urinproben eine höhere Signalintensität als die Referenzprobe erreichen. Dies lässt auf eine unterschiedliche Sensitivität beider Assays für die eingenommene Substanz Estra-4,9-dien-3,17-dion (Trenbolox) bzw. seiner Metabolite schließen. In einem zweiten Ausscheidungsversuch nach 1-Androsteron Einnahme konnte gezeigt werden, dass im Urin hohe Konzentrationen von ausgeschiedener Ausgangssubstanz oder deren Metabolite bis zu 30 Stunden nach Substanzeinnahme ein positives Signal in beiden Hefeassays hervorriefen. Wohingegen zu späteren Ausscheidungszeitpunkten beide Hefeassays sehr unterschiedliche Ergebnisse zeigten. Beide Hefen scheinen späte Metabolite von 1 Androsteron mit unterschiedlicher Sensitivität zu detektieren. Im dritten Ausscheidungsversuch mit der Substanz Methyltestosteron konnte ebenfalls eine sehr unterschiedliche Sensitivität beider konstruierter Hefeassays gegenüber Methyltestosteron und seiner Metabolite festgestellt werden. Die Ergebnisse der Ausscheidungsversuche scheinen die Annahme zu bestätigen, dass eine Kombination beider Assays den Aktivitätsnachweis eines weiten Spektrums von androgenen Substanzen gewährleistet. Vor allem in der Dopinganalyse wäre dies von großem Vorteil, um bisher unbekannte Substanzen, wie neue so genannte Designer-Steroide, in Kombination mit der MS-Analytik nachzuweisen. Die Hefeassays bieten dabei die Möglichkeit zum einfachen, schnellen und kostengünstigen Doping-Prescreening. Auch der hier erstmals untersuchte direkte Einsatz von unbehandelten Urinproben in Hefeassays ist ein deutlicher Vorteil im Vergleich zu den klassischen Methoden, bei denen die Urinproben aufwendig gereinigt werden müssen. Ein weiteres aus unseren Ergebnissen resultierendes Anwendungsgebiet für die konstruierten Hefeassays könnte der Nachweis der biologischen Aktivität von Antiandrogenen sein.

De nombreux processus métaboliques nécessitent la présence de fer en tant que cofacteur. Paradoxalement, la surabondance en fer peut contribuer à la formation de dérivés oxygénés hautement réactifs qui sont toxiques pour la cellule. Ceci fait en sorte que sa concentration intracellulaire doit être finement régulée. Chez la levure à fission, Schizosaccharomyces pombe, plusieurs mécanismes participent à l'établissement de l'homéostasie du fer. Parmi ces mécanismes, on y retrouve des protéines de transport du fer à la surface cellulaire, ainsi que d'autres responsables de la séquestration de l'ion à l'intérieur de la vacuole. Un rôle pour la vacuole consiste à emmagasiner le fer afin de détoxifier la cellule s'il est trop abondant. Du même coup, la vacuole sert de réservoir qui pourra redonner le fer plus tard à la cellule si cette dernière croît en condition de rareté pour cet élément. La voie par laquelle le fer peut ressortir de la vacuole n'a cependant pas encore été identifiée. L'objectif de cette étude est d'identifier le transporteur responsable du relâchement du fer de la vacuole vers le compartiment cytosolique. Nos recherches ont permis d'identifier un candidat, un transporteur transmembranaire de type ABC (ATP binding cassette) nommé Abc3, dont l'expression augmente de 16.9 fois en carence de fer selon des études comparatives par biopuces à ADN. Tout d'abord, l'étude de la régulation du gène abc3[indice supérieur +] a été effectuée selon la présence ou non de fer dans le milieu de culture. L'expression du gène abc3[indice supérieur +] a été comparée avec d'autres gènes codant pour d'autres protéines de la même famille. Seul le gène abc3[indice supérieur +] a montré une expression variant selon le statut en fer. Il est réprimé en présence de fer et activé en carence de ce dernier. Par la suite, des éléments en cis du promoteur abc3[indice supérieur +] pouvant être responsables de la régulation selon le statut en fer ont été analysés. Parmi ces derniers, nous avons démontré que seul l'élément de régulation le plus près du cadre de lecture est fonctionnel permettant la répression du gène abc3[indice supérieur +] en présence de fer. Un essai fonctionnel permettant de montrer l'importance de la protéine Abc3 a été mis au point. Ainsi, une souche nulle pour le gène abc3[indice supérieur +] montre une perte de croissance en présence de cérulénine, un antibiotique qui inhibe la biosynthèse des acides gras. La souche abc3[delta] mutante est également sensible à la présence du chélateur de fer, le 2,2-dipyridyl (Dip), lorsque le système de transport de surface constitué de Fio1 et de Fip1 est inactivé. Une protéine Abc3 portant une étiquette fluorescente exprimée sous le contrôle du promoteur endogène abc3[indice supérieur +] a permis de localiser la protéine Abc3-GFP au niveau des vacuoles en carence de fer. Des analyses de profils transcriptionnels ont indiqué que l'expression forcée du gène abc3[indice supérieur +] en présence de fer active le répresseur Fep1. La surexpression du transporteur Abc3 libérerait plus de fer de la vacuole ce qui aurait pour effet d'activer Fep1, résultant en la répression de la transcription des gènes impliqués dans l'acquisition du fer à la surface cellulaire. Les résultats obtenus sur Abc3 suggèrent fortement que cette protéine pourrait être impliquée dans l'exportation du fer de la vacuole vers le cytoplasme de la levure lorsque cette dernière croît en carence de fer.

Le fer est un cofacteur essentiel à la croissance des organismes. Cependant, un surplus de fer conduit à la production de dérivés toxiques de l’oxygène qui sont dangereux pour les cellules. La concentration intracellulaire de fer doit donc être régulée. Lorsque la biodisponibilité du fer s’amenuise, la plupart des cellules augmentent leur acquisition du fer environnemental tout en réduisant sa consommation en réprimant plusieurs voies métaboliques fer-dépendantes non-essentielles. Alors que les mécanismes qui régissent l’augmentation de l’acquisition du fer sont assez bien caractérisés, les composantes qui contrôlent la promotion de l’économie du fer sont largement méconnues. Mes travaux ont porté sur l’étude des mécanismes de contrôle de l’économie du fer chez la levure à fission Schizosaccharomyces pombe. Php4, une sous-unité du complexe liant les boîtes CCAAT, est responsable de la répression des gènes codants pour des protéines qui utilisent du fer lorsque ce dernier est en faible concentration. Il est déjà connu qu’en présence de fer, l’expression du gène php4+ est réprimée via le facteur de transcription Fep1. De plus, la protéine Php4 est inactivée et exportée hors du noyau lorsque les cellules croissent en présence de fer. Ce processus est dépendant à la fois de la présence de l’exportine Crm1 et de la monothiol glutarédoxine Grx4. L’objectif de recherche est de découvrir le mécanisme par lequel Grx4 inhibe Php4 en réponse à la présence de fer. L’approche du double-hybride a été utilisée pour quantifier la force de l’interaction entre Php4 et Grx4 et identifier les domaines de ces protéines qui y participent. Ce système nous a permis de déterminer que Php4 interagit de façon constitutive avec le domaine thiorédoxine (TRX) de Grx4, alors que l’interaction entre Php4 et le domaine glutarédoxine (GRX) est dépendante de la présence de fer. Nous avons déterminé que la cystéine 35 du domaine TRX et la cystéine 172 du domaine GRX sont essentiels pour l’interaction de chacun de ces domaines avec Php4. Des régions minimales de Php4 nécessaires pour son interaction avec chacun des domaines GRX et TRX ont aussi été identifiées. Par la suite, nous avons démontré que l’expression du domaine GRX seul de Grx4 est suffisante pour l’inactivation de Php4 en présence de fer. Puis, par des essais de fluorescence par complémentation bimoléculaire (BiFC), nous avons démontré que le domaine GRX de Grx4 interagit de façon fer-dépendante avec Php4 et qu’il est suffisant pour l’exportation de Php4 hors du noyau en présence de fer. Ces résultats révèlent que le mécanisme par lequel Php4 est inhibé en présence de fer dépend de son interaction avec le domaine GRX de Grx4. À la suite des résultats obtenus, un modèle illustrant l’interaction fer-dépendante entre Grx4 et Php4 suggère la présence potentielle d’un centre fer-soufre qui pourrait expliquer la nature de l’interaction fer-dépendante entre les deux protéines.

La synthèse d’un ARNm eucaryotique dépend d’une suite d’étapes qui inclut notamment l’ajout d’une queue poly(A) à son extrémité 3’. Au noyau, la queue poly(A) des ARNms est liée par PABPN1 (poly(A)-binding protein nuclear 1). PABPN1 fut notamment caractérisée, d’après des études in vitro, pour stimuler la réaction de polyadénylation en plus de contrôler la taille ultime des queues poly(A). Cela dit, la ou les fonction(s) biologique(s) de PABPN1 est/sont cependant largement méconnue(s). Chez Schizosaccharomyces pombe (S. pombe), Pab2 est l’orthologue présumé de PABPN1. Or, mes travaux indiquent que Pab2 est fonctionnellement différente de PABPN1 à l’égard de son rôle sur le processus général de polyadénylation. Ainsi, in vivo, l’absence de Pab2 entraîne l’expression et l’accumulation d’un groupe limité d’ARNs hyperadénylés parmi lesquels se trouvent de nombreux petits ARNs nucléolaires non-codants (snoRNAs) lesquels constituent normalement un groupe abondant d’ARN poly(A)-. Mes résultats supportent ainsi un mécanisme par lequel des snoRNAs immatures poly(A)+, sont convertis en une forme mature poly(A)- par le biais de Pab2 et de l’activité 3’-->5’ exoribonucléase de l’exosome à ARN. Ces observations sont inusitées dans la mesure où elles associent une fonction pour une PABP dans la maturation d'ARNs non-codants, contrairement à la notion que les PABPs travaillent exclusivement au niveau des ARNms, en plus de procurer une nouvelle perspective face au mécanisme de recrutement de l'exosome à ARN à des substrats poly(A)+. La formation de l’extrémité 3’ d’un ARN est un processus étroitement lié à la terminaison de sa transcription. Pour les gènes codants, la terminaison transcriptionnelle est initiée par le clivage endonucléolytique du pré-ARNm. Ce clivage génère une extrémité d’ARN 5’ libre laquelle sera ciblée par une exoribonucléase 5'-->3’ afin de mener à bien l’éviction de l’ARNPII de la matrice d’ADN (terminaison transcriptionnelle de type torpedo). Au contraire, chez Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae), la majorité des gènes non-codants, incluant les snoRNAs, dépendent plutôt du complexe NNS (Nrd1/Nab3/Sen1) pour la terminaison de leur transcription. Cela dit, il est incertain si le complexe NNS est conservé chez d’autres espèces. À cet égard, mes travaux indiquent que S. pombe est dépourvu d’un mécanisme de terminaison de la transcription de type NNS. Seb1, l’orthologue présumé de Nrd1 chez S. pombe, s’associe plutôt à la machinerie de clivage et de polyadénylation et influence la sélection de site de polyadénylation à l’échelle du génome. Mes résultats supportent ainsi l’utilisation de la machinerie de maturation 3’ des ARNms comme principal vecteur de terminaison transcriptionnelle chez S. pombe et identifient Seb1 comme un facteur clé de ce processus. L’évènement transcriptionnel étant hautement complexe, des erreurs peuvent arriver de manière stochastique menant à l’accumulation d’ARNs aberrants potentiellement néfastes pour la cellule. Or, mes travaux ont mis en lumière un mécanisme de surveillance co-transcriptionnel des ARNs impliquant l’exosome à ARN et lié à la terminaison de la transcription. Pour ce faire, l’exosome à ARN promeut la terminaison transcriptionnelle via la dégradation d’une extrémité 3’ libre d’ARN devenue émergente suite au recul de l’ARNPII le long de la matrice d’ADN (phénomène de backtracking). Mes résultats supportent ainsi une terminaison de la transcription de type torpedo inversé (3'-->5’) réévaluant par la même occasion le concept voulant que la terminaison de la transcription s’effectue uniquement selon une orientation 5’-->3’. Somme toute, mes travaux de doctorat auront permis d’identifier et de caractériser plus en détail les facteurs et mécanismes impliqués dans la maturation 3’ et la terminaison de la transcription des gènes codants et non-codants chez l’organisme modèle S. pombe.

Cdt1 is a conserved and essential eukaryotic protein that is required for the licensing step of DNA replication. In order to control replication licensing and ensure a single round of DNA replication occurs per cell cycle, Cdt1 is subject to strict regulation. In Metazoa and S. pombe, Cdt1 is targeted for ubiquitylation and proteolysis in S phase and after DNA damage by the CRL4Cdt2 ubiquitin ligase. CRL4Cdt2 is activated in Metazoa by an unusual mechanism that requires an interaction between the substrate and chromatin-loaded proliferating cell nuclear antigen (PCNA). This study addressed the involvement of PCNA in S. pombe Cdt1 proteolysis. A mutational analysis was undertaken to establish whether the Cdt1-PCNA interaction is conserved in S. pombe and the extent to which it regulates CRL4Cdt2-dependent turnover of the protein. S. pombe Cdt1 was shown to interact with PCNA in vivo and two variant PCNA-interacting peptide (PIP) motifs were identified in the protein. The two motifs function near-redundantly to promote both the Cdt1-PCNA interaction and the CRL4Cdt2-dependent proteolysis of Cdt1 in S phase and after DNA damage. The mutational analysis also resulted in the characterisation of two in-frame AUG codons in the cdt1+ reading frame. The second in-frame AUG codon was shown to be the principal initiator codon and was required to maintain wildtype Cdt1 protein levels and cell viability. CRL4Cdt2 is emerging as an important regulator of proteins that are involved in the control of cell cycle progression and the maintenance of genome stability. However, there are a number of outstanding questions regarding the mechanism and regulation of CRL4Cdt2. In order to address these questions, a genomics approach was taken to identify novel genes involved in Cdt1 regulation. A screen of non-essential S. pombe genes identified 17 candidate genes that, when inactivated, caused up-regulation of Cdt1. Unexpectedly, deletion of genes involved in homologous recombination resulted in a Rad3-dependent up-regulation of Cdt1. Further work is required to establish the biological significance of this finding.

Nucleotide synthesis is a conserved and highly regulated response to DNA damage, required for the efficient repair of DNA double strand breaks (DSB) by homologous recombination (HR). This is essential to prevent loss of heterozygosity (LOH) and maintain genome stability. The aim of this study was to identify new genes important for HR through roles in damage-induced nucleotide synthesis. A screen was performed to identify S. pombe gene deletion strains whose DSB sensitivity was suppressed by deleting the ribonucleotide reductase (RNR) inhibitor spd1⁺ to promote nucleotide synthesis. The screen identified a number of genes including ddb1⁺, cdt2⁺, rad3⁺ and csn1⁺ which have known roles in nucleotide synthesis. Distinct roles were identified for the DNA damage checkpoint in suppressing LOH. rad3⁺, rad26⁺, rad17⁺ and the rad9⁺, rad1⁺ and hus1⁺ genes encoding the 9-1-1 complex were required for DNA damage-induced nucleotide synthesis through Cdt2 induction to promote Spd1 degradation. The HR repair defect of rad3⁺ and rad26⁺ deletion strains was partially suppressed by spd1⁺ deletion. However, the HR repair defect of rad17⁺, rad9⁺, rad1⁺ and hus1⁺ deletion strains was not suppressed. An additional role was confirmed for Rad17 and the 9-1-1 complex in preventing LOH by promoting DSB resection. A role was identified for the Gcn5 histone acetyl transferase (HAT) protein module, consisting of Gcn5, Ngg1, Ada2 and Sgf29, in suppressing DSB sensitivity by promoting nucleotide synthesis. This was independent of Cdt2 or RNR protein levels. The Gcn5 HAT module was also found to regulate DSB repair pathway choice consistent with previous observations. Deletion of gcn5⁺, ngg1⁺ or ada2⁺ decreased HR and increased non-homologous end joining. Surprisingly, deletion of spd1⁺ in a gcn5∆, ngg1∆ or ada2∆ background also promoted HR. This predicts a role for nucleotide pools in regulating DSB repair pathway choice. Eleven other candidates showed repeatable suppression of DSB sensitivity following spd1⁺ deletion. However many of these candidates did not show reduced nucleotide levels. This suggests deleting spd1⁺ may also suppress DSB sensitivity by a different mechanism.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

RNA interference (RNAi) is a conserved pathway that plays key roles in heterochromatin formation, gene regulation and genome surveillance across a wide range of eukaryotes. One of the most utilised model organisms for studying the RNAi pathway is the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. However, this species is somewhat atypical, in that it has not retained the ancestral role for RNAi in the silencing of mobile genetic elements. In contrast, the related fission yeast S. japonicus has a large and diverse retrotransposon complement that appears to give rise to abundant siRNAs. For this reason, we believe that S. japonicus may be a more suitable model for studying the role of RNAi in silencing mobile genetic elements, a function that is conserved in many higher eukaryotes. Functional analysis of the S. japonicus RNAi pathway proved more challenging than expected, as it was generally not possible to recover strains bearing deletions of core RNAi components (Ago1/Clr4/Rdp1/Arb1/Arb2). This suggests that a functional RNAi pathway may be required for viability in S. japonicus, unlike in S. pombe. However, disruption mutants were isolated for the sole Dicer ribonuclease Dcr1, at very low frequency. Analysis of these mutants revealed that disruption of Dcr1 impaired the generation of retrotransposon derived siRNAs, and caused de-repression of retroelement transcript accumulation and mobilisation in an element dependent manner. Surprisingly however, Dcr1 appeared dispensable for the maintenance of H3K9me2 at transposons, suggesting that, in contrast to S. pombe, silencing may occur principally at the post-transcriptional level. It is also possible that the isolated Dcr1 mutants represent rare survivors that are viable due to the presence of suppressor mutations elsewhere in the genome. I utilised my genome wide RNA sequencing data to help improve the annotation of the S. japonicus genome, with a specific focus on the retrotransposon complement. From this, I identified 12 new families of LTR retrotransposon, which increased the annotated retrotransposon complement by around 40% in S. japonicus. Finally, I characterised the integrative preference of the S. japonicus retrotransposon Tj1, and found that it shares characteristics associated with the S. cerevisiae retrotransposons Ty1 and Ty3, mostly integrating upstream of RNA PolIII transcribed tRNA genes. The findings of this work highlight some potentially key differences in the way the RNAi pathway functions across the fission yeast clade, both in terms of its importance for viability and its mode of action. The work undertaken here also contributes to the establishment of S. japonicus as a model for the study of RNA interference and genome regulation.

Cette thèse a pour objet de coupler la microfluidique et la microthermique pour réaliser des dispositifs miniaturisés de mesure et de contrôle de température. Nous avons utilisé les faibles constantes de temps des échanges thermiques aux échelles micrométriques et la capacité d'intégration offerte par la microfluidique, pour développer de nouveaux outils afin d'explorer d'autres domaines scientifiques. Dans le domaine de la physique, nous avons fabriqué un micro-conductimètre thermique afin d'étudier certaines des propriétés thermiques des nanofluides. Dans le domaine de la thermochimie nous avons mis au point un microcalorimètre à flux continu intégrable dans un laboratoire sur puce. Les possibilités offertes par la rapidité des transferts thermiques aux échelles micrométriques nous ont permis de développer des dispositifs de contrôle de température appliqués à la biologie cellulaire. Ce type de dispositif permet de confiner une colonie de cellules et d'effectuer des changements de température du milieu, en quelques secondes. Nous avons ainsi la possibilité de contrôler l'activité de protéines thermosensibles et d'étudier certaines propriétés du cytosquelette de S.Pombe. Les caractéristiques de ce type de dispositif ouvrent la voie à de nouvelles recherches en biologie cellulaire, particulièrement sur le rôle de protéines d'intérêt thérapeutique rendues préalablement thermosensibles.