L?????tude qui vous est pr??sent??e dans ce m??moire est r??alis??e chez l???organisme Schizosaccharomyces pombe et elle porte sur la caract??risation de la prot??ine Nab2, une prot??ine liant les queues poly(A) ainsi que sur son implication dans la r??gulation g??nique. Tout d???abord, il faut savoir qu???il existe quatre modes de r??gulation (transcriptionnel, post-transcriptionnel, traductionnel et post-traductionnel) dans lesquels interviennent diff??rents types de prot??ines, en particulier des prot??ines liant les queues poly(A) des ARN, aussi connues sous le nom de PABPs. Ces prot??ines reconnaissent l???ARN ?? l???aide de diff??rents domaines de liaison et elles se subdivisent en deux cat??gories : les PABPs nucl??aires ou cytoplasmiques, repr??sent??es respectivement par PABPN1 et PABPC1 chez les mammif??res. Comprendre la fonction des PABPs rev??t un int??r??t particulier puisqu???elles sont impliqu??es ?? diff??rents stades de la r??gulation g??nique. Des maladies ont aussi ??t?? associ??es ?? deux PABPs nucl??aires humaines, PABPN1 et ZC3H14, mais aucune association entre leur fonction r??ciproque et la maladie n???a pu ??tre ??tablie. Une des fa??ons de comprendre leur r??le est d?????tudier celui de leurs orthologues respectifs. Chez la levure ?? fission, un orthologue de PABPN1 a ??t?? caract??ris?? et il s???agit de Pab2. S. pombe poss??de cependant une seconde PABP nucl??aire, Nab2, qui est caract??ris??e dans ces travaux. Des m??thodes in vivo et in vitro ont ??t?? utilis??es afin de confirmer le statut de la prot??ine, ?? savoir qu???il s???agit bel et bien d???une PABP nucl??aire et que celle-ci est non essentielle. L???identification de partenaires prot??iques de Nab2 par spectrom??trie de masse a aussi permis de relier Nab2 avec des processus de r??gulation g??nique tels que l?????pissage et la d??gradation. Puisque Pab2 est aussi associ??e ?? des fonctions en lien avec la d??gradation, il est possible de faire un parall??le entre ces deux prot??ines et de supposer qu???elles interagissent ensemble. La deuxi??me partie de ces travaux porte donc sur l?????tude de la relation fonctionnelle entre Nab2 et Pab2 et elle a permis de montrer un m??canisme de r??gulation opportuniste bas?? sur la liaison de la cible ARN par l???une ou l???autre de ces PABPs. En effet, l?????tude de la r??gulation du g??ne mod??le RPL30-2 indique que Nab2 et Pab2 ont des r??les oppos??s puisqu???ils sont respectivement des r??gulateurs positifs et n??gatifs de l???expression de son transcrit.

In eukaryotes, the endoplasmic reticulum is the site where folding of secretory proteins and the assembly of multimeric cell surface receptors take place. These processes are mediated by molecule chaperones that include the ER membrane bound chaperone calnexin and the sequence related calreticulin. Using a PCR strategy, a homologue for the mammalian calnexin/calreticulin family, CNE1, was isolated in S. cerevisiae. The CNE1 gene product, Cne!p, is an integral membrane glycoprotein of the ER. Disruption of the CNE1 gene did not lead to inviable cells or to gross effects on the levels of secreted wild type proteins. However, in CNE1 disrupted cells, there was an increase in the cell-surface expression of a normally intracellularly retained temperature sensitive mutant of the $ alpha$-pheromone receptor, Ste2-3p. In addition, an increase in the secretion of heterologously expressed mammalian $ alpha sb1$-antitrypsin was also observed in CNE1 disrupted cells. In order to study calnexin function in another genetically manipulable organism, a Schizosaccharomyces pombe calnexin homologue was sought. Using a similar PCR strategy, a S. pombe calnexin homologue, $cnx1 sp+$, was identified. The $cnx1 sp+$ gene product, Cnx1p, was shown to be a calcium binding type I integral membrane glycoprotein. Unlike the sequence related S. cerevisiae CNE1 gene, the $cnx1 sp+$ gene was essential for cell viability. Full length Cnx1p was able to complement the $cnx1 sp+$ gene disruption but full length mammalian calnexin could not. The ER lumenal domain of Cnx1p, which was secreted from cells, was capable of complementing the $cnx1::ura4 sp+$ lethal phenotype. Both wild type PI M1 (Val 213) $ alpha sb1$-antitrypsin and the ER retained PI Z variant were expressed in S. pombe cells. As in mammalian cells, wild type $ alpha sb1$-antitrypsin was normally secreted whereas the PI Z variant was retained intracellularly. Rescue of the secretion defective phenotype of the PI Z variant occurred in

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Thesis (Ph. D. in Cell and Developmental Biology)--Vanderbilt University, May 2005. / Title from title screen. Includes bibliographical references.

Zellen sind darauf angewiesen, ihre Lebensbedingungen wahrzunehmen und darauf zu reagieren. Der TOR („Target of Rapamycin“)-Signalweg spielt dabei eine wichtige Rolle, indem er das Wachstum in Abhängigkeit von Nährstoffen und Hormonen reguliert. In dieser Arbeit wurde die Spalthefe Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) als Modellorganismus für die Untersuchungen des TOR-Signalweges verwendet. Dabei zeigte sich, dass in S. pombe, wie in Säugern und der Bäckerhefe, zwei TOR-Komplexe existieren. Ko-Immunpräzipitationsexperimente zeigten, dass sich der TOR-Komplex 1 aus SpTor2, SpMip1 und SpWat1 zusammensetzt. Bei SpTor1, SpSin1, SpSte20 und SpWat1 handelt es sich um Mitglieder des TOR-Komplex 2. Phänotypische Analysen von Mutanten in Genen, die für TOR-Komplex 2-Komponenten kodieren, unterstreichen, dass diese Proteine in der Zelle ähnliche Funktionen bei der Antwort auf verschiedene Stresssituationen ausüben. Die heterologe Expression von wat1+ in einer S. cerevisiae delta lst8-Mutante komplementiert deren Wachstumsdefekt, was untermauert, dass diese beiden Proteine tatsächlich gleiche Funktionen in der Zelle ausüben. Eine Membranassoziation der TOR-Komplexe, wie sie in Säugern und S. cerevisiae bereits beschrieben wurde, konnte in dieser Arbeit für die TOR-Komplex 2-Komponente SpSte20 nachgewiesen werden. Möglicherweise spielt dabei die Interaktion zwischen der leichten Kette des Clathrins mit SpSte20 eine Rolle. Auch für die homologen Proteine aus S. cerevisiae, ScCLC1 und ScAVO3, konnte mittels des "Zwei-Hybrid"-Systems eine Bindung nachgewiesen werden. Dieses deutet eine Konservierung dieser Proteininteraktion innerhalb von Eukaryonten an. Obwohl das vegetative Wachstum von S. pombe durch Rapamycin nicht gehemmt wird, zeigen die hier aufgeführten Daten eine in vivo-Bindung von SpFkh1 an sowohl SpTor1 als auch SpTor2 in Anwesenheit von Rapamycin. Das Phosphorylierungslevel von SpGad8, dem bisher einzigen postulierten TOR-Komplex 2-Zielprotein, wird durch die Bindung des SpFkh1-Rapamycin-Komplexes an SpTor1 jedoch nicht beeinflusst. Dies und die Tatsache, dass delta gad8-Mutanten ein Rapamycin-sensitives Wachstum zeigen, lassen vermuten, dass noch weitere bisher unbekannte SpTOR-Komplex-Zielproteine durch Rapamycin beeinflusst werden. Zusammengenommen unterstreichen die Daten dieser Arbeit die Konservierung der Komplexe und des von ihnen vermittelten Signaltransduktionsweges. Sie zeigen aber auch, dass die Wirkung von Rapamycin nicht einfach durch eine generelle Hemmung der Aktivität der Komplexe beschrieben werden kann, was insbesondere für die klinische Anwendung von Rapamycin von Bedeutung ist.

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(生命科学) / 甲第18626号 / 生博第317号 / 新制||生||42(附属図書館) / 31526 / 京都大学大学院生命科学研究科統合生命科学専攻 / (主査)教授 上村 匡, 教授 西田 栄介, 教授 James Hejna / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Philosophy in Life Sciences / Kyoto University / DGAM

Chez la levure Schizosaccharomyces pombe (S. pombe), la voie de l'interférence à l'ARN (iARN) est un mécanisme endogène de régulation génique transcriptionnelle et posttranscriptionnellc médié par de petits acides ribonucleiques (ARN) non-codants générés par la ribonucléase III Dicer (Dcrl). Le rôle et la fonction de Dcrl, cependant, demeure méconnus. Une étude réalisée au laboratoire a précédemment permis l'identification, par une analyse en spectrométrie de masse, de la protéine Byr3 dans des immunoprécipitats de Dcrl. Cette observation suggère la possibilité que Byr3 interagisse avec Dcrl et qu'elle soit impliquée dans la voie de l'iARN. L'homologue de Byr3 chez l'humain est la protéine CNBP, « ccllular nuclcic acid binding protein ». L'interaction entre CNBP et Dicer est donc également envisageable. L'objectif principal de mon travail est de déterminer si la protéine Byr3 et son homologue humain peuvent interagir avec la ribonucléase Dicer, et ainsi être impliquées dans la voie de l'iARN. Chez S. pombe, la création de lignées mutées et d'outils moléculaires a permis d'étudier la protéine Byr3. Chez l'humain, des approches de microscopic par immunofluorescenec et de co-immunoprécipitation (co-IP) ont permis de définir une interaction entre la CNBP et Dicer. Notre travail pave la voie à une caractérisation plus approfondie de l'importance et de la signification de l'interaction entre Byr3 et Dcrl dans la voie de l'iARN / In the fission yeast Schizosaccharomyces pombe (S. pombe), the RNA interference (RNAi) pathway is an endogenous mechanism of transcriptional and posttranscriptional gene regulation by non-coding small ribonuclcic acids (RNAs) generated by the ribonuclease III Dicer (Dcr1). The role and function of Dcr1 though remains unclear. A previous study in our laboratory allowed the identification, by mass spectroscopy, of the Byr3 protein in Dcr1 immunoprecipitates. This observation suggests the possibility that Byr3 interacts with Dcr1 and is involved in the RNAi pathway. The main objective of my project was to define whether Byr3 and its human homolog, the cellular nucleic acid binding protein, (CNBP), can interact with the ribonuclease Dicer and be implicated in the RNAi pathway. In S. pombe, the creation of mutated strains and molecular tools allowed the study of the protein Byr3. In the human cellular model, methods of immunofluorescence microscopy and co-immunoprecipitation allowed the delineation of an interaction between CNBP and Dicer. Our study paves the way to an in-depth characterization of the importance and significance of the interaction between Byr3 and Dcr1 in the RNAi pathway.

Une étude précédente visant à mieux comprendre le rôle et le contexte cellulaire dans lequel la ribonucléase Dicer (Dcrl) évolue nous a permis d'identifier des protéines pouvant être régulées par un mécanisme post-transcriptionnel impliquant Dcrl et la voie de l'interférence à l'ARN (iARN) chez Schizosaccharomyces pombe. Parmi ces protéines se trouvaient trois enzymes impliquées dans la voie de la glycolyse. Nous avons tenté de caractériser le mécanisme et l'implication fonctionnelle de leur régulation en effectuant des expériences de FACS combinées à l'utilisation d'un système de gène rapporteur basé sur la « Green fluorescent protein » et en effectuant des tests de croissance, respectivement. La régulation de la voie de la glycolyse ne semble pas nécessaire à la croissance des levures, ce qui suggère la présence de mécanismes compensatoires. L'étude précédente nous avait également permis d'identifier la protéine ribosomale L12 comme interacteur potentiel de Dcrl pouvant être impliqué dans sa régulation. Nous avons tenté de comprendre le rôle de L12 dans cette régulation en confirmant son interaction avec Dcrl et en caractérisant l'aspect fonctionnel de cette interaction en produisant des lignées délétionnelles de L12. La localisation intracellulaire de la protéine L12 nous permet de croire qu'elle pourrait amener Dcrl dans des structures spécifiques du cytosol, où elle pourrait jouer un rôle dans la régulation génique post-transcriptionnelle. Ce rôle demande toutefois à être confirmé.

Les cassures double-brin (CDBs) de l’ADN sont généralement néfastes pour la cellule, toutefois il existe une exception importante à cette règle. Chez la levure et les autres eucaryotes, Spo11 (ou Rec12 chez S. pombe) est décrit comme étant capable de créer des CDBs, bris de l’ADN nécessaire à l’initiation de la recombinaison méiotique. Des analyses génétiques et bioinformatiques ont démontré que les homologues de Spo11 lient l'ADN double-brin sous la forme d’un dimère. Leur activité topoisomérase permet d’ailleurs de cliver l’ADN pour générer des intermédiaires ADN-protéine transitoires et covalents. Cependant, cette observation a été mise en doute par les biochimistes, mais aussi par le fait qu'il est extrêmement difficile de purifier les protéines Spo11 dans des conditions natives. Pour mieux comprendre comment Schizosaccharomyces pombe Spo11 (Rec12) génère des CDBs, nous avons établi un protocole de purification par triple affinité et effectué des essais in vitro permettant de montrer le rôle de Spo11 dans la formation de CDBs. Nous avons également purifié Rec12 - Y98F (mutant catalytique) et Rec12 - G202E (mutant de liaison à l'ADN). La protéine Rec12 s’avère être capable de catalyser la formation de CDBs de l'ADN superenroulé alors que les mutants Rec12-Y98F et Rec12-G202E sont inactivés. En accord avec l'accumulation de Spo11 aux CDBs durant la méiose, nous observons que Rec12 possède plusieurs sites de liaison à l’ADN préférant l'ADN 5'-protubérant à l'ADN 3’-protubérant. Nous avons également analysé biochimiquement le mécanisme par lequel Rec12 est enlevé des CDBs par la nucléase Rad32 (Mre11). Certains des résultats présentés ont été confirmés à l'aide Spo11 humain et de S. cerevisiae. Le rôle des activités endo- et exonuclease du complexe MRE11 - RAD50 - NBS1 (MRN) dans la régulation de la voie de réparation des CDBs par l’utilisation d’inhibiteurs (endo ou exo) spécifiques à la structure de MRE11 sera discuté. En somme, nos résultats démontrent que Rec12 est responsable de la formation de CDBs et que cette activité est régulée par plusieurs domaines de liaison à l'ADN. Cette étude représente une première analyse de la fonction biochimique de Spo11 chez la levure et l’humain dans des conditions natives. / Double-strand breaks are generally harmful to the cell, although there is an important exception to this rule. In yeast and other eukaryotes, Spo11 (or S. pombe Rec12) is known to create double-strand DNA breaks (DSBs), which are important to initiate meiotic recombination. Genetic and bioinformatic analyses proposed that Spo11 homologues bind double-strand DNA as a dimer and cleave the DNA by a topoisomerase-like reaction to generate transient, covalent protein-DNA intermediates. However, this view has been challenged by biochemists, but also by the fact that it is extremely difficult to purify proteins Spo11 under native conditions. To understand how Schizosaccharomyces pombe Spo11 (Rec12) generates double-strand breaks, we established a protocol for triple affinity purification. We performed in vitro assays, reminiscent of the function of Spo11 in DSB formation. The resulting purified Rec12 was pure as judged by Sypro staining. We also purified Rec12-Y98F (catalytic mutant) and Rec12-G202E (DNA binding mutant). Purified Rec12 catalysed double-strand break formation on supercoiled DNA whereas Rec12-Y98F and Rec12–G202E were inactivated. Rec12 showed activity on supercoiled DNA but not in short double-stranded DNA oligonucleotides. We mapped the possible DNA binding motifs on Rec12. Using purified mutants, we biochemically confirmed that Rec12 contains multiple DNA binding sites. Rec12 binds 5’-tailed DNA but not 3’-tailed DNA, which is reminiscent of the accumulation of Spo11 on meiotic DNA double-strand breaks. We also analyzed biochemically how Rec12 is removed from DSBs by the Rad32 (Mre11) nuclease to produce single-strand overhang that can undergo DNA recombination. Some of the results presented were also confirmed using human and S. cerevisiae Spo11. We also discuss how endo- and exonuclease activities of MRE11-RAD50-NBS1 (MRN) complex regulates double-strand break repair pathway choice. By using structure-based designed MRE11 endo- or exonuclease inhibitors we represented here specific nuclease roles in DSB repair. Altogether, our results indicate that Rec12 is responsible for the formation of double-strand breaks, an activity that is regulated by multiple DNA binding sites. This study represents a first glimpse of the biochemical function of yeast or human Spo11 under native conditions.

Peu de données sont connues à savoir comment des protéines méiotiques régulent la recombinaison homologue de façon biochimique. Lors d'études effectuées chez l'humain, il a été démontré que hRad51 se comporte sensiblement comme le fait son homologue bactérien, RecA. Malgré que hDmc1 possède une séquence d'acides aminés possédant 52% d'identité à celle de hRad51, ses caractéristiques et ses capacités sont différentes. Afin d'étudier si cette disparité est conservée chez l'organisme Schizosaccharomyces pombe nous avons purifié et étudié biochimiquement la protéine Dmc1 de cet organisme. Nous montrons que spDmc1 lie préférentiellement l'ADN simple brin et protubérant à l'ADN double brin, une propriété similaire à son homologue bactérien RecA. SpDmc1 purifiée est capable de catalyser des réactions d'échange de brins, telles que rencontrées durant la recombinaison homologue. Contrairement à la protéine humaine, spDmc1 a la capacité de lier l'ADN et d'y former un filament hélicoïdal, la signature des recombinases classiques.