Afin de mieux comprendre la fonction et l'importance de l'interférence à l'ARN (iARN) chez les eucaryotes, l'identification des protéines cellulaires pouvant moduler ou être requises pour le fonctionnement de l'iARN, en particulier pour la fonction de la ribonucléase Dicer, et des protéines régulées par l'iARN est essentielle. Dans le premier volet de cette étude, nous avons réalisé des coimmunoprécipitations pour identifier les protéines cellulaires pouvant interagir avec Dicer chez la levure Schizosaccharomyces pombe (S. pombe). Deux protéines ont ainsi été identifiées par analyse protéomique, soit la protéine ribosomale L12 et la protéine Byr3. Le deuxième volet de cette étude a consisté à identifier les protéines régulées par la voie de l'iARN chez S. pombe. Nous avons donc procédé à des analyses par gel 2D du protéome des lignées Hu303 (type sauvage) et Hu679 (Dcr1?). Ces analyses suggèrent un rôle possible de la voie de l'iARN dans le contrôle de la glycolyse.

Der Missbrauch anaboler Substanzen zur Leistungssteigerung wird von den meisten Sportverbänden, dem Olympischen Komitee und vor allem der Welt Anti Doping Agentur (WADA) abgelehnt und sanktioniert. Trotzdessen bleibt der Missbrauch derartiger Substanzen sowohl im Leistungs- als auch im Freizeitsport nicht zuletzt aufgrund der starken Nebenwirkungen ein schwerwiegendes Problem. Allein im Leistungssport sind 2009 ca. 2 % der von der WADA durchgeführten Dopingkontrollen positiv ausgefallen. Dabei konnten in 65 % der positiv-getesteten Proben muskelaufbauende anabole Substanzen nachgewiesen werden. Im Freizeitsport konzentriert sich der Missbrauch dieser verbotenen Substanzen vor allem im Bereich des Bodybuildings. Die einzige rechtlich relevante und routinemäßig genutzte analytische Methode für den Nachweis anaboler Steroide in Urinproben von Sportlern ist die Gas- oder Flüssigkeitschromatographie in Kombination mit der Massenspektrometrie. Diese Methoden sind jedoch sehr kosten- und zeitintensiv. Außerdem können dabei unbekannte Substanzen nur schwer nachgewiesen werden. Ein alternativer Ansatz zum Nachweis androgener anaboler Steroide führt über deren biologische Aktivität. Auf diesem Prinzip beruhen unter anderem Hefeassays. Diese Assays sind kostengünstig, schnell und einfach durchzuführen. In dieser Arbeit wurden zwei neue Hefeassays zum einen in der Hefe Saccharomyces (S.) cerevisiae und zum anderen in der Hefe Schizosaccharomyces (S.) pombe konstruiert und hinsichtlich ihrer Eignung zur Doping-Prescreening Analyse getestet. Diese zwei Hefen wurden genutzt, da sie phylogenetisch sehr weit voneinander entfernt sind und dadurch unter anderem einen unterschiedlichen Metabolismus und einen unterschiedlichen Aufbau der Zellwand besitzen. In Hefeassays können falsch negative und falsch positive Ergebnisse auftreten, da endokrin-wirksame Substanzen in der Hefe und im humanen Organismus eine unterschiedliche Wirkung besitzen können. Humane Zellen unterscheiden sich von Hefezellen unter anderem im Metabolismus von aufgenommenen Substanzen, in der Durchlässigkeit der Zellwand für verschiedene Stoffe und in Transportsystemen, die Substanzen aus der Zelle ausschleusen. Eine Kombination dieser beiden neu konstruierten Assays verspricht den Aktivitätsnachweis eines viel größeren Substanzspektrums, als es mit einem System allein möglich wäre, wodurch eine Reduzierung falsch negativer Ergebnisse erreicht werden kann. Als erster Schritt in dieser Arbeit wurde ein bestehendes Hefesystem von Sohoni und Sumpter (1998) charakterisiert. Der Hefestamm dieses S. cerevisiae Reportergen-Assays exprimiert den humanen Androgenrezeptor (AR) konstitutiv, da das AR Gen durch genetische Manipulation ins Genom der Hefe stabil integriert wurde. Außerdem liegt in der Hefezelle ein so genanntes Reporterplasmid vor. Dieses Plasmid trägt das lacZ Gen, welches in diesem Fall als Reportergen funktioniert und unter der Kontrolle eines androgen-sensitiven Promoters steht. Gelangen nun Androgene in diese Zellen wird das lacZ Gen abgelesen und die beta-Galactosidase gebildet. Dieses Enzym wird ins Hefemedium sekretiert und wandelt dort einen gelben in einen roten Farbstoff um. Dieser Farbumschlag kann nunmehr quantitativ gemessen und als Maß androgener Aktivität ausgewertet werden. Die Eignung dieses Reportergenassays als Doping-Prescreening Test konnte in vielfältigen Experimenten bestätigt werden. Zunächst konnten mit diesem Assay bekannte Dopingsubstanzen und deren Metabolite anhand ihrer biologischen Aktivität nachgewiesen werden. Außerdem konnte die Spezifität des Assays gegenüber Androgenen gezeigt werden, wobei Steroide anderer Klassen, wie das Mineralocorticoid Aldosteron, das künstliche Glucocorticoid Dexamethason, das Östrogen 17beta-Östradiol und das Gestagen Progesteron und außerdem das Prohormon Dehydroepiandrosteron im Hefeassay geprüft worden sind. Alle diese Substanzen zeigten keinen relevanten Signalanstieg in physiologischen Konzentrationen. Weiterhin wurde die Praktikabilität des Hefeassays für die Doping-Prescreening Analyse anhand eines Trenbolox- und eines Methyltestosteron-Ausscheidungsversuchs untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Hefen dieses Assays eine 20 %ige Urinkonzentration im Medium tolerieren und gleichzeitig die biologische Aktivität von oral eingenommenem Methyltestosteron und Estra-4,9-dien-3,17-dion (Präparatname: Trenbolox) bzw. deren Metabolite in Urinproben detektierbar ist. Außerdem wurden parallel Urinproben von Frauen und Männern, die keine androgen wirksamen Substanzen eingenommen haben, getestet. Diese Urinproben ohne exogene Zufuhr von anabolen Steroiden wiesen keinen bedeutenden Signalanstieg auf. Eine Verbesserung des ursprünglichen Reportergenassays von Sohoni und Sumpter wurde durch den Austausch des Reportergens von lacZ zum optimierten grün fluoreszierenden Protein (EGFP) erreicht. Dadurch konnte eine deutliche Verringerung der Inkubationszeit von 48 auf 24 Stunden bewirkt werden. Auch bei der Konstruktion der beiden neuen Reportergenassays in S. cerevisiae und S. pombe wurde daraufhin EGFP als Reportergen eingesetzt. Dafür wurde ein für die jeweilige Hefe spezifisches Reporterplasmid mit dem EGFP-Gen unter der Kontrolle eines androgen-sensitiven Promoters und ein spezifisches Expressionsplasmid mit dem Gen für den humanen Androgenrezeptor konstruiert und in die jeweilige Hefe eingebracht. Durch Optimierungsversuche wurde festgestellt, dass beide neu konstruierten Hefen eine identische einzusetzende Zellzahl, Inkubationszeit, Inkubationstemperatur und ein identisches Kulturvolumen besitzen. Daraus ergibt sich der Vorteil, dass beide Assays gut kombiniert werden können. Mit Hilfe beider Hefeassays konnte die Wirkung verschiedener dopingrelevanter Substanzen detektiert werden, wobei der S. cerevisiae Assay eine geringfügig höhere Sensitivität zeigte als der S. pombe Assay und sogar als der Reportergenassay von Sohoni und Sumpter. Zum weiteren Vergleich der Sensitivität beider Assays wurden drei Ausscheidungsversuche durchgeführt. Im ersten so genannten Trenbolox-Ausscheidungsversuch zeigte der S. pombe Assay in allen fünf Urinproben ein stärkeres Signal als die Referenzprobe. Im S. cerevisiae Assay konnten nur vier der fünf getesteten Urinproben eine höhere Signalintensität als die Referenzprobe erreichen. Dies lässt auf eine unterschiedliche Sensitivität beider Assays für die eingenommene Substanz Estra-4,9-dien-3,17-dion (Trenbolox) bzw. seiner Metabolite schließen. In einem zweiten Ausscheidungsversuch nach 1-Androsteron Einnahme konnte gezeigt werden, dass im Urin hohe Konzentrationen von ausgeschiedener Ausgangssubstanz oder deren Metabolite bis zu 30 Stunden nach Substanzeinnahme ein positives Signal in beiden Hefeassays hervorriefen. Wohingegen zu späteren Ausscheidungszeitpunkten beide Hefeassays sehr unterschiedliche Ergebnisse zeigten. Beide Hefen scheinen späte Metabolite von 1 Androsteron mit unterschiedlicher Sensitivität zu detektieren. Im dritten Ausscheidungsversuch mit der Substanz Methyltestosteron konnte ebenfalls eine sehr unterschiedliche Sensitivität beider konstruierter Hefeassays gegenüber Methyltestosteron und seiner Metabolite festgestellt werden. Die Ergebnisse der Ausscheidungsversuche scheinen die Annahme zu bestätigen, dass eine Kombination beider Assays den Aktivitätsnachweis eines weiten Spektrums von androgenen Substanzen gewährleistet. Vor allem in der Dopinganalyse wäre dies von großem Vorteil, um bisher unbekannte Substanzen, wie neue so genannte Designer-Steroide, in Kombination mit der MS-Analytik nachzuweisen. Die Hefeassays bieten dabei die Möglichkeit zum einfachen, schnellen und kostengünstigen Doping-Prescreening. Auch der hier erstmals untersuchte direkte Einsatz von unbehandelten Urinproben in Hefeassays ist ein deutlicher Vorteil im Vergleich zu den klassischen Methoden, bei denen die Urinproben aufwendig gereinigt werden müssen. Ein weiteres aus unseren Ergebnissen resultierendes Anwendungsgebiet für die konstruierten Hefeassays könnte der Nachweis der biologischen Aktivität von Antiandrogenen sein.

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karolinska institutet, 2009. / Härtill 4 uppsatser.

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karolinska institutet, 2007. / Härtill 3 uppsatser.

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karolinska institutet, 2007. / Härtill 4 uppsatser.

Une fraction non négligeable de protéines qui contrôlent la dynamique de la chromatine et la transcription est conservée au cours de l'évolution chez les eucaryotes. Ces protéines se retrouvent dérégulées dans de nombreuses maladies, dont les cancers. Dans cette étude, nous avons exploité la purification de deux protéines associées à la chromatine pour étudier de nouveaux acteurs impliqués dans la réduction au silence (ou silencing) de la transcription au sein de l'hétérochromatine et/ou de l'euchromatine chez la levure Schizosaccharomyces pombe, un modèle de référence pour la biologie de la chromatine.Mmi1 est un facteur de liaison à l'ARN capable de guider la formation d'hétérochromatine facultative sur des gènes méiotiques. Parmi les protéines partenaires de Mmi1, nous nous sommes intéressés à Ccr4-Not, un complexe multifonctionnel, conservé de la levure à l'Homme, important pour la maturation de l'extrémité 3' des ARNs et pour le contrôle de l'expression des gènes. Nos travaux montrent que Ccr4-Not est également nécessaire pour le dépôt de la marque H3K9 méthylée aux gènes cibles de Mmi1, ainsi que pour le silencing de la transcription au sein de l'hétérochromatine constitutive, indépendamment de Mmi1.En parallèle, nous avons étudié deux nouveaux partenaires potentiels de RITS (RNA-Induced Transcriptional Silencing), un complexe nécessaire à la formation de l'hétérochromatine et l'inactivation de gène. Ces partenaires agiraient à l'interface entre la régulation de la chromatine et de la transcription. Le premier partenaire est l'histone chaperonne Spt6. Une caractérisation initiale entreprise sur Spt6 a montré son rôle crucial dans le silencing des gènes à l'hétérochromatine constitutive et facultative. Le second partenaire est Abo1, une histone chaperonne putative et homologue à la protéine humaine ATAD2, une protéine exprimée dans de nombreuses tumeurs et considérée comme une cible prometteuse pour le traitement de certains cancers, bien qu'à ce jour il n'y ait que peu d'information disponible sur sa fonction moléculaire. Nous avons dans un premier temps montré qu'Abo1 est nécessaire pour le silencing de la transcription au sein de l'hétérochromatine constitutive. Cependant, l'analyse du transcriptome des cellules abo1Δ a montré qu'Abo1 est également nécessaire au silencing transcriptionel de nombreux gènes codant et non-codant localisés dans l'euchromatine. Par la suite, nous avons purifié Abo1 et identifié par spectrométrie de masse le réseau des protéines qui lui est associé. Cette approche protéomique a montré qu'Abo1 est connectée à de nombreuses protéines impliquées dans le contrôle de la transcription, comme des histones chaperonnes et des complexes de remodelage ATP-dépendant de la chromatine. Enfin, nous avons montré que le défaut de croissance sévère observé dans les cellules abo1Δ est complètement rétabli par l'expression de ATAD2 humain. Ce dernier résultat indique que la caractérisation fonctionnelle d'Abo1, entreprise dans la levure, a le potentiel de fournir des informations importantes sur la fonction moléculaire non seulement d'Abo1, mais aussi d'ATAD2 et de son lien avec les cancers.En résumé, nos résultats permettent une meilleure compréhension de la fonction de trois acteurs impliqués dans le silencing de la transcription chez la levure fissipare. De plus, la caractérisation plus approfondie d'Abo1 pourrait grandement contribuer à élucider la fonction d'ATAD2 et de son rôle dans les cancers. / A sizeable fraction of proteins controlling chromatin dynamics and transcription are conserved throughout eukaryotes and are deregulated in many diseases, including cancer. In this study, we exploited the purification of two chromatin-associated proteins to characterize new actors in the context of euchromatic and/or heterochromatic gene silencing in Schizosaccharomyces pombe, a reference model for the biology of chromatin.Mmi1 is an RNA binding factor that can guide the formation of facultative heterochromatin assembly at meiotic genes. Among new proteins interacting with Mmi1, we examined the function of Ccr4-Not, which is a conserved multifunctional complex processing 3'ends of RNAs and regulating gene expression. We found that Ccr4-Not is also required for the deposition of H3K9 methylation mark at Mmi1 target genes and for gene silencing in a Mmi1-independent manner at constitutive heterochromatin.In parallel, we studied two new potential partners of RITS (RNA-Induced Transcriptional Silencing), a complex required for heterochromatin formation and gene silencing. Both partners are believed to act at the interface between chromatin and transcription regulation. The first one is the histone chaperone Spt6. An initial functional characterization conducted on this protein showed its implication in gene silencing, both at constitutive and facultative heterochromatin. The second one is Abo1, a putative histone chaperone which is homologue to human ATAD2 protein, a male germ factor ectopically expressed in many tumors and considered as a promising target for cancer therapy, although little is known about its molecular function. We first showed that Abo1 is necessary for proper heterochromatin gene silencing at constitutive heterochromatin. However, transcriptomic analysis of abo1∆ cells further extended Abo1's function in gene silencing to protein-coding and non-coding regions within euchromatin. In addition, we purified Abo1 and identified by mass spectrometry the network of its associated proteins. This proteomic approach showed that Abo1 is connected to several chromatin- and transcription-linked proteins, such as histone chaperones and ATP-dependent chromatin remodeling complexes. Finally, we demonstrated that the severe growth defect observed in abo1Δ is completely rescued by the expression of human ATAD2. This later finding indicates that the functional characterization of Abo1 in yeast has the potential to provide important insights into the molecular function not only of Abo1, but also of the cancer linked ATAD2 protein.Altogether, our results permitted a better understanding of three actors involved in chromatin-based gene silencing in fission yeast. In addition, a further characterization of Abo1 may contribute elucidating the function of ATAD2 and its role in cancer.

Un nouveau procédé intensifié de vinification continue avec un mélange de levures S.cerevisiae et Sch.pombe immobilisées dans des billes d’alginate est proposé. A l’échelle laboratoire, l’étude de la teneur en billes et de la configuration du réacteur conduit à l’obtention d’un réacteur de type lit fixe permettant une production de vin en 35 heures. Des validations du procédé aux échelles pilote (170 L) puis industrielle (120 hL) montrent que, en cave, du vin de qualité semblable au témoin est produit en 2 à 3 jours. Une analyse du comportement du réacteur a identifié des raisons de pertes de performances liées à l’hydrodynamique lors du changement d’échelle ainsi que des axes améliorations possibles. Ce procédé permet d’obtenir un vin de qualité maitrisée et un gain de temps de plusieurs semaines / From a batch to another, produced wines are usually different because of the different alcoholic and malolactic fermentation courses. To blend wines quality and continue wine production industrialization, a new continuous process, using Ca-alginate immobilized yeast cells, was developed for red wine-making. Working with a blending of S.cerevisiae and Sch.pombe allowed the regrouping of the alcoholic and malolactic fermentations in a unique step. After testing different reactor set-ups at lab scale, the selected process, a vertical bed reactor, was used in real wine-making conditions, firstly in a pilot reactor (170 L) and then in an industrial one (120 hL). The results showed that continuous wine-making was possible in 2 to 3 days. The wine presented nearly the same sensory profile compared to a classical one. Thanks to the analysis of the reactor behaviour, we were able to explain the efficiency losses linked to the hydrodynamic, observed during the scale-up. This new intensified process enables to obtain a wine with a controlled quality and to save several weeks of production time

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karolinska institutet, 2007. / Härtill 4 uppsatser.

Condensine est un complexe protéique organisateur du génome qui conduit l’assemblage des chromosomes et promeut leur transmission fidèle en anaphase. De nombreuses études ont rapporté des changements dans les niveaux des ARNs cellulaires quand Condensine est défaillante, suggérant un rôle pour Condensine dans la régulation de l’expression génique. Cependant, les mécanismes sous-jacents sont demeurés énigmatiques, et l’on ignore dans quelle mesure le rôle joué par Condensine dans l’expression génique est lié ou non à sa fonction dans l’organisation des chromosomes. Lors de ma thèse, j’ai étudié l’activité de Condensine dans la régulation de l’expression génique en utilisant la levure S. pombe comme organisme modèle. Contrairement à l’idée communément admise, mes résultats montrent que Condensine ne joue aucun rôle direct dans le maintien du transcriptome, ni en interphase, ni en mitose chez cette levure. En accord avec les études précédentes, j’observe des changements de niveau et de qualité des ARNs dans les cellules mutantes pour Condensine au sortir de la mitose ; des ARNs non codants et des ARNs aberrants, étendus en 3’, s’accumulent. En revanche, je démontre que ces changements sont la conséquence de défauts de transmission des chromosomes en anaphase. L’inactivation de Condensine cause la non-disjonction de l’ADN ribosomique et du nucléole, entrainant une déplétion de l’ARN-exosome des cellules filles, lesquelles accumulent alors des ARNs normalement dégradés par l’ARN-exosome. De façon cruciale, je montre qu’empêcher les anomalies de migration des chromosomes restaure une expression normale des gènes malgré l’inactivation de Condensine, démontrant que c’est l’instabilité chromosomique qui est source des changements d’expression génique observés quand Condensine est défaillante, et non le complexe Condensine en tant que tel. Ce travail remet en question le concept de régulation de l’expression génique par les complexes Condensine et appelle à la prudence lorsque l’on cherche à étudier les fonctions de ces complexes en dehors de la condensation de la chromatine en mitose. / Condensin is a genome organiser that shape chromosomes and promote their accurate transmission in anaphase. Several studies have related changes in RNA level when Condensin is defective, suggesting that the complex has also a role in gene expression. However, the mechanisms have remained enigmatic and we still don’t know to what extent it is related to its role in chromosome organization. During my thesis, I studied the role played by Condensin in the regulation of gene expression using S. pombe as a model system. In contrast to previous studies, my results provide compelling evidence that Condensin plays no direct role in the maintenance of the transcriptome, neither during interphase nor during mitosis in this yeast. Accordingly to previous studies, I observed changes in RNA level in cells mutated for Condensin; non coding and 3’ extended RNA accumulate. However, I showed that the changes in gene expression in post-mitotic fission yeast cells that result from Condensin inactivation are largely a consequence of chromosome missegregation during anaphase, which notably depletes the RNA-exosome from daughter cells. Crucially, preventing karyotype abnormalities in daughter cells restores a normal transcriptome despite Condensin inactivation. Thus, chromosome instability, rather than a direct role of Condensin in the transcription process, changes gene expression. This work challenges the concept of gene regulation by canonical Condensin complexes and ask for caution when studying Condensin role outside chromosome condensation in mitosis.

La condensation mitotique des chromosomes est l'un des mécanismes assurant la transmission fidèle de l'information génétique. Les complexes condensines et leur association à la chromatine sont nécessaires à cette condensation. Cependant, les mécanismes par lesquels ces complexes s'associent aux chromosomes et contribuent à leur condensation sont mal compris. L'objectif de ma thèse était d'identifier et de caractériser des facteurs de condensation encore inconnus collaborant avec le complexe condensine présent chez S. pombe. Par un crible génétique, nous avons recherché des mutants viables lorsque le complexe condensine est complètement fonctionnel mais morts lorsque ce complexe est partiellement défectif. Nous avons ainsi identifié 7 protéines jusqu'alors jamais impliquées dans la condensation mitotique. Parmi ces dernières, nous avons identifié des protéines impliquées dans le remodelage de la chromatine et des facteurs de transcription comme Gcn5, une HAT très conservée, connue pour son rôle de coactivateur de la transcription ; suggérant un lien entre la condensation et la machinerie transcriptionnelle. Gcn5 s'associe à la chromatine au niveau des promoteurs des gènes où elle acétyle principalement H3K9, H3K14 et H3K18. Sa présence au niveau des promoteurs est directement corrélée avec le niveau de transcription des gènes correspondants. Bien que la majorité de la chromatine soit dé-acétylée et que la présence de Gcn5 soit réduite au niveau des chromosomes en mitose, des traces de H3K9 acétylée persistent au niveau de certains promoteurs. Nos résultats suggèrent que cette acétylation persistante pourrait être liée au recrutement du complexe condensine à la chromatine / From yeasts to human, Condensin is essential for mitotic chromosome condensation. However, how Condensin binds to chromatin and, in this context, shapes mitotic chromosome remain poorly understood. Mappings performed from yeasts to mouse have revealed that condensin is enriched near highly expressed genes along chromosome arms, suggesting that as yet identified features associated with transcription take part in condensin binding to chromatin. To identify factors that collaborate with Condensin we performed a synthetically lethal genetic screen in fission yeast. We searched for mutants that are alive when Condensin is fully functional but dead when Condensin is partly defective. We identified 7 proteins never known for their roles in the mitotic condensation, such as some chromatin remodelling and some transcription factors. All these results were consistent with a link between condensation and transcription. Among theses 7 proteins, we found Gcn5, which encodes a conserved HAT, well known for the role it plays as a transcriptional co-activator. Gcn5 binds to gene promoters where it acetylates mainly H3K9, K14 and K18, and its occupancy correlates with transcription rates. Remarkably, although the bulk of chromatin is de-acetylated and Gcn5 reduced from chromatin upon mitosis entry, traces of Gcn5 dependant H3K9 acetylated persist at condensin binding sites. Here, we provide evidence that Gcn5-mediated histone H3 K9 acetylation could assist the binding of Condensin to chromatin