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Post-translational modification of NF-kappaB regulation of stability and gene expression /

Hertlein, Erin K. January 2006 (has links)
Thesis (Ph. D.)--Ohio State University, 2006. / Full text release at OhioLINK's ETD Center delayed at author's request
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Protein Post Translational Modifications in Human Diseases: Bacterial Glycosylation Profiling by Peptide Microarray / Protein Phosphorylation Analysis in High Risk Neuroblastoma

January 2014 (has links)
abstract: ABSTRACT Post Translational Modifications (PTMs) are a series of chemical modifications with the capacity to expand the structural and functional repertoire of proteins. PTMs can regulate protein-protein interaction, localization, protein turn-over, the active state of the protein, and much more. This can dramatically affect cell processes as relevant as gene expression, cell-cell recognition, and cell signaling. Along these lines, this Ph.D. thesis examines the role of two of the most important PTMs: glycosylation and phosphorylation. In chapters 2, 3 and 4, a 10,000 peptide microarray is used to analyze the glycan variations in a series lipopolysaccharides (LPS) from Gram negative bacteria. This research was the first to demonstrate that using a small subset of random sequence peptides, it was possible to identify a small subset with the capacity to bind to the LPS of bacteria. These peptides bound to LPS not only in the solid surface of the array but also in solution as demonstrated with surface plasmon resonance (SPR), isothermal titration calorimetry (ITC) and flow cytometry. Interestingly, some of the LPS binding peptides also exhibit antimicrobial activity, a property that is also analyzed in this work. In chapters 5 and 6, the role of protein phosphorylation, another PTM, is analyzed in the context of human cancer. High risk neuroblastoma, a very aggressive pediatric cancer, was studied with emphasis on the phosphorylations of two selected oncoproteins: the transcription factor NMYC and the adaptor protein ShcC. Both proteins were isolated from high risk neuroblastoma cells, and a targeted-directed tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) methodology was used to identify the phosphorylation sites in each protein. Using this method dramatically improved the phosphorylation site detection and increased the number of sites detected up to 250% in comparison with previous studies. Several of the novel identified sites were located in functional domain of the proteins and that some of them are homologous to known active sites in other proteins of the same family. The chapter concludes with a computational prediction of the kinases that potentially phosphorylate those sites and a series of assays to show this phosphorylation occurred in vitro. / Dissertation/Thesis / Doctoral Dissertation Biochemistry 2014
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Sumo et le désordre structural font-ils bon ménage ?

Lens, Zoé 16 December 2010 (has links)
La sumoylation représente, après l’ubiquitination, l’exemple le plus étudié de modification post-traductionnelle impliquant la liaison d’une protéine à une autre. Cependant, alors que l’ubiquitination est impliquée principalement dans la dégradation des protéines par le protéasome, la sumoylation semble réguler les propriétés biochimiques de ses substrats (localisation cellulaire, interaction protéique, activité, …). Pour venir lier une protéine appelée Sumo (Small Ubiquitin-like Modifier) sur un substrat, la sumoylation emprunte une voie enzymatique analogue à celle de l’ubiquitination mais utilise des enzymes différentes. A ce jour, bien que plusieurs centaines de substrats de la sumoylation aient été identifiés, seules 5 structures de protéines sumoylées ont été résolues. Elles ne sont vraisemblablement pas représentatives de l’ensemble des substrats de la sumoylation et mon travail de thèse vise à élargir les connaissances structurales sur la sumoylation pour permettre de dégager des concepts généraux. <p>Les études sur la sumoylation se heurtent généralement à la difficulté d’obtenir les substrats sumoylés. Ce projet a donc nécessité, au niveau technique, la mise au point d’un système de sumoylation in vivo en bactérie permettant de modifier des quantités importantes de protéines et de les purifier efficacement. <p>Des analyses bioinformatiques nous ont permis d’identifier des substrats de la sumoylation propices à une étude structurale de leur forme sumoylée. Au terme de ces analyses, nous avons retenu 3 protéines :DJ-1, PPARγ et IκBα. Bien que la complexité du sujet nous ait ensuite amené à écarter DJ-1 et PPARγ, nous sommes parvenus à purifier la forme sumoylée d’IκBα. Ce résultat nous a permis d’entreprendre une campagne de cristallogenèse d’IκBα complexé au facteur de transcription NF-κB. L’obtention d’IκBα sumoylé permettra également d’aborder des études fonctionnelles pour améliorer la compréhension du rôle de la sumoylation de ce substrat. <p>Nos analyses bioinformatiques ont également révélé que dans plus de 60% des cas, les sites de sumoylation des substrats se trouvent dans des zones prédites intrinsèquement désordonnées. L’importance du désordre dans le processus de sumoylation était jusqu’alors largement sous-estimée. A titre d’exemple, nous avons étudié par diffusion des rayons X aux petits angles la structure du domaine transactivateur du facteur de transcription ERM sous forme non modifiée et sous forme sumoylée. Cette étude indique que la sumoylation d’ERM n’induit pas le repliement de ce domaine transactivateur. De même, il apparait peu probable, au vu de la flexibilité de cette région, que la sumoylation empêche des interactions avec certains partenaires cellulaires. Dans ce contexte, la sumoylation semble servir de plateforme de recrutement de partenaires, reconnaissant de manière spécifique le Sumo. Ce mécanisme pourrait se généraliser à l’ensemble des sites de sumoylation prédits dans des zones intrinsèquement désordonnées. <p>Le système de sumoylation que nous avons développé permet de produire des protéines sumoylées pures en grande quantité et pourra également servir à identifier des protéines reconnaissant spécifiquement les substrats modifiés. Tous ces éléments devraient permettre de progresser dans la compréhension de cette modification post-traductionnelle impliquée dans de nombreux processus cellulaires fondamentaux. <p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished
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Caractérisation fonctionnelle des modifications post traductionnelles de la protéine Arpp19, un inhibiteur de la phosphatase PP2A / Functional characterization of Arpp19, a PP2A inhibitora glance at its post translational modifications

Robert, Perle 21 November 2016 (has links)
La phosphorylation/déphosphorylation des protéines est une modification clé dans les mécanismes qui contrôlent les évènements mitotiques.Classiquement, l’entrée en mitose requiert l’activation de Cdk1. Pour se faire, les phosphorylations inhibitrices sur Cdk1 par Myt1 et Wee1 doivent être éliminées par Cdc25. Le complexe Cdk1-Cycline B (MPF) est ainsi actif, les kinases inhibitrices inactivées.Dernièrement, une nouvelle protéine kinase clé pour l’entrée en mitose a été mise en évidence : Greatwall (Gwl). Les récents résultats publiés par notre équipe montrent que Gwl permet l’entrée et le maintien en mitose en inhibant l’activité de la phosphatase PP2A, la phosphatase responsable de la déphosphorylation des substrats de la protéine kinase Cdk1-Cycline B, via son substrat Arpp19. Gwl phosphoryle Arpp19 sur la sérine 71 lui conférant ainsi la capacité d’inhiber l’activité de la phosphatase PP2A.Une étude sur les modifications post traductionnelles d’Arpp19 a été initiée dans l’équipe et met en évidence plusieurs sites de phosphorylation : <br>• La sérine 71, site de phosphorylation par Gwl <br>• La sérine 28, dont la phosphorylation est attribuée à Cdk1 (vérifié in vitro) <br>• La sérine 113, site de phosphorylation par pKA <br>Ce projet de thèse s’inscrit dans la suite logique du travail déjà effectué dans l’équipe et a pour objectif de caractériser les modifications post traductionnelles d’Arpp19, leurs rôles dans la progression mitotique, leurs incidences sur la liaison et l’inhibition de la cible d’Arpp19, PP2A.Cette partie du projet repose sur la synthèse de mutants d’Arpp19Xe, mutants phosphomimétiques d’une part (sérine transformée en acide aspartique par mutagenèse dirigée) ou mutants dont la phosphorylation est impossible (sérine en alanine). Ces mutants nous ont permis de travailler sur l’impact de ces différentes phosphorylations dans l’extrait d’œufs de Xénope.Ce projet s’attache également à mettre en lumière l’ensemble de la voie de signalisation aboutissant aux différentes modifications post traductionnelles d’Arpp19, leurs chronologies au cours du cycle et ainsi identifier les protéines effectrices de ces phosphorylations sur Arpp19 qui sont autant de leviers potentiels sur lesquels les thérapies anti-tumorales pourraient s’appuyer. / Proteins phosphorylation and dephosphorylation are key post translational modifications controlling mitotic events.Traditionally, mitotic entry requires Cdk1 activation. To allow this to occur, inhibitory phosphorylations on Cdk1 by Myt1 and Wee1 kinases must be removed by phosphatase Cdc25. Thus, the Cdk1-Cyclin B complex, also called MPF (Mitotic Promoting Factor), is active and inhibitory kinases inactivated.Along this canonic scheme, another key kinase has been shown to play a critical role: the Greatwall (Gwl) kinase also called MAST-L for MAST like. Results published by our team show that in Xenopus laevis, Gwl allows entry and maintains mitosis by inhibiting the activity of the phosphatase responsible for dephosphorylation of Cdk1/Cycline B substrates: PP2A. This activity is driven by Gwl target: Arpp19. Gwl phosphorylates Arpp19 on its 71st residue turning it into a potent inhibitor of PP2A.A study of Arpp19 post translational modifications of Arpp19 has been initiated in the team which will allow the further study of several phosphosites: <br>• Serine 71, Gwl phosphosite, the best documented site. <br>• Serine 28, shown in vitro to be a Cdk1-CycB phosphosite. <br>• Serine 113, assigned to PKA. <br>This thesis project joins logically after the work already made in the team and has for objective to characterize the post translational modifications of Arpp19, their roles in mitotic progress, their incidences on binding and inhibition of Arpp19’s target, PP2A.This part of the project relies on mutants' synthesis of Arpp19Xe, phosphomimetics’ mutants on one hand (serine transformed into aspartic acid by mutagenesis) or mutants unable to be phosphorylated (serine into alanine). These mutants allowed us to work on the impact of these various phosphorylations in Xenopus eggs extracts.This project also attempts to highlight the whole signalization pathway ending in the various post translational modifications of Arpp19, their timelines during the cycle and thus to identify effector proteins of these phosphorylations on Arpp19 which are as much as potential levers on which can serve as targets for cancer therapy.
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Development of a novel liquid chromatography based tool to study post-translational modifications

Lam, Wing Kai Edgar 11 1900 (has links)
There are many tools available for the study of post-translational modifications. The majority of these tools is specific towards the individual modification and involves separation of modified proteins from non-modified ones. The drawback of using a modification specific method is that there is a lack of flexibility in its usage for other modifications. The goal of these studies was to investigate the possibility of obtaining a similar separation effect by fractionating post-translationally modified proteins based on the physical properties of proteins. The post-translational modification chosen to be the basis of this study was the O-GlcNAc modification. Using the C2C12 mouse myoblast cell line, it was determined that the optimal conditions for producing lysates containing increased yields of O-GlcNAc modified proteins was to treat differentiated C2C12 cells with 10nM insulin, 12g/L glucose and 2mM of the O-GlcNAcase inhibitor Streptozotocin for 24 hours. Using the optimized lysis buffer, it was shown that protein separation by surface charge using standard anion exchange separation did not provide enough resolution or material to obtain any identifications of modified proteins. However, when a chromatofocusing method which separates proteins on the basis of their isoelectric points was used, a separation scheme with larger capacity and higher resolution was possible. Using this separation method followed by gel electrophoresis of individual fractions, proteins which are potentially O-GlcNAc modified were identified by mass spectrometry. It was evident from the number of protein bands observed per fraction on the Coomassie stained gels and the number of proteins identified per protein band by mass spectrometry that further reduction in sample complexity was required to assist in the positive identification of O-GlcNAc modified proteins. Among the identified proteins, 32 percent were metabolic proteins, 21 percent were protein processing proteins, 16 percent were structural proteins and the remainder a mix of other proteins. Unfortunately, it was not possible to validate the presence or absence of the O-GlcNAc modification on these proteins using available methodologies such as immunoprecipitation. As such, further work is required to optimize the separation strategy and to verify the usefulness of this separation strategy in identifying O-GlcNAc/post-translationally modified proteins. / Medicine, Faculty of / Medicine, Department of / Experimental Medicine, Division of / Graduate
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The role of alsin in early Xenopus development

Gill, Pendeep January 2012 (has links)
Mutation within the human ALS2 gene, which encodes the protein Alsin, causes a number of recessive motor neuron diseases. The ALS2 gene encodes a 180kDa protein, which has been shown to localize to early endosomes. The Alsin protein comprises three predicted guanine exchange factor (GEF) domains, the best characterised of which is the VPS9 domain for Rab5 GTPase, which is involved in the endocytosis membrane trafficking pathway, particularly in the docking and fusion of early endosomes. Furthermore, Alsin contains a Rho-GEF domain which specifically interacts with Rac-1 GTPase in the PI3K/AKT signal transduction pathway. This pathway has been implicated in numerous biological processes, including control of protein translation, via the mTOR branch of the pathway. To date, most work on the human ALS2 disease phenotypes has focused on the role of alsin in membrane trafficking, and neglected alsin’s potential role in signalling via its Rho-GEF domain. The focus of this project was to study the role of alsin in signalling during early Xenopus development, a period rich in well-characterised cell-cell signalling. I have shown that alsin is maternally loaded and zygotically expressed in the early Xenopus embryo. In cell culture, alsin is localised to early endosomes. Knockdown of alsin protein through the use of mopholinos (MO), resulted in a gastrulation defect, in particular, failure to close the blastopore caused by disrupted mesoderm induction and convergent extension movements. An animal cap assay was used to study mesoderm induction in the presence of als2-MO and activin protein, a potent mesoderm inducer. These animal caps extended normally, indicating proper mesoderm induction. By contrast, als2-MO animal caps failed to extend when co-injected with activin mRNA suggesting that alsin is important for the production and/or secretion of the activin ligand in the source cell. Subsequently it was determined that knockdown of alsin reduced the precursor protein levels of TGF-β family members activin and Xnr-2. These results suggest a novel role for alsin in mRNA stability, translational regulation or post-translational control of specific mesoderm-inducer mRNAs.
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Obésité et résistance à la leptine : étude de nouveaux mécanismes et potentiels thérapeutiques / Obesity and leptin resistance : Study of New Mechanisms and Therapeutic Perspectives

Roujeau, Clara 27 June 2016 (has links)
L’obésité est un problème de santé publique, de par son incidence et son association avec d’autres pathologies. La leptine est une hormone clé pour l’homéostasie énergétique et glucidique, en activant son récepteur OBR, exprimé majoritairement dans l’hypothalamus. L’obésité est fréquemment associée à une résistance à la leptine, caractérisée par une diminution de la sensibilité à l’hormone. Comprendre les mécanismes moléculaires à l’origine de cette résistance, afin de la prévenir ou de la corriger, constitue un enjeu thérapeutique majeur. L’objectif de mes travaux de thèse a été d’étudier deux nouveaux mécanismes de la régulation de la fonction d’OBR, suspectés être à l'origine de la résistance à la leptine associée à l’obésité.Concernant le premier mécanisme, notre laboratoire a découvert la protéine Endo1, qui interagit avec OBR, et le retient dans des compartiments intracellulaires, limitant ainsi la sensibilité de la cellule à l’hormone. Mon travail a contribué à montrer que l'extinction d'Endo1, dans le noyau arqué de l’hypothalamus, associée au retour à un régime classique, permet de corriger l’installation de la résistance à la leptine et de l’obésité de souris rendues obèses par régime gras. En revanche, l'extinction d'Endo1 n’arrive pas à corriger l’altération de l’homéostasie glucidique de ces animaux sous régime gras, montrant ainsi une dissociation entre obésité et diabète de type II. Sur le plan moléculaire, nous montrons qu'Endo1 régule de façon différentielle les voies de signalisation d’OBR. Endo1 inhibe, comme attendu, l'activation de la voie anorexigène STAT3 ; mais de façon plus surprenante, Endo1, en interagissant avec la sous-unité régulatrice de la PI3K (p85), semble nécessaire à l'activation de la voie PI3K/AKT, voie impliquée dans le métabolisme du glucose. Ces résultats suggèrent le rôle crucial d’Endo1 comme (i) régulateur de la sensibilité neuronale à la leptine, (ii) et médiateur de la signalisation de la leptine.Le second projet, mené en collaboration avec l'équipe du Dr Prévot, a permis d’identifier une nouvelle modification post-traductionnelle (PTM) affectant OBR. Nous avons étudié les conséquences de cette PTM sur l’activation d’OBR, sa signalisation et sur le développement de la résistance à la leptine et l'obésité. Des résultats in vivo ont montré que l’enzyme responsable de la PTM voit son activité augmentée dans l’hypothalamus de souris rendues obèses par régime gras. L’inactivation génétique ou pharmacologique de cette enzyme prévient la mise en place d’une résistance à la leptine, de façon dépendante d’OBR. Au niveau moléculaire, nous avons identifié certains résidus d’OBR comme cibles de cette PTM. La modification de ces résidus cruciaux altère l’état d’activation moléculaire d’OBR et abolie l’activation des voies de signalisation induites par la leptine. En outre, cette enzyme interagit avec OBR dans des cellules hypothalamiques ; sa suractivation au niveau cellulaire, après traitement au palmitate mimant le régime gras, abolit l’activation de la voie PI3K/AKT induite par la leptine. Aussi, ces résultats démontrent que cette PTM affectant OBR est un nouveau mécanisme à l’origine de la résistance à la leptine et ouvre donc de nouvelles perspectives thérapeutiques. / Obesity is a major issue of public health because of its incidence and association with other pathologies. Leptin is a key hormone involved in the regulation of energy and glucose homeostasis, through the activation of its receptor OBR, mainly expressed in the hypothalamus. Obesity is frequently associated with leptin resistance, characterized by a decreased sensitivity to the hormone. Understanding the molecular mechanisms related to leptin resistance, in order to prevent or reverse it, represents major therapeutic concerns. The objective of my PhD work was to explore two new mechanisms involved in the regulation of OBR function, suspected to be related to leptin resistance associated with obesity.Regarding the first mechanism, the laboratory described a new protein namely Endo1, which interacts with OBR and retains the receptor in intracellular compartments, leading to decreased cellular leptin sensitivity. We showed that Endo1 silencing, specifically in the arcuate nucleus of hypothalamus, combined with a switch to chow diet, reverses the establishment of leptin resistance and obesity of obese mice fed a high fat diet (HFD). However, Endo1 silencing cannot reverse the alteration of glucose homeostasis upon HFD feeding, underlying a disassociation between obesity and type II diabetes. At the molecular level, we showed that leptin-induced signaling pathways are differentially regulated by Endo1. Endo1 inhibits, as expected, the anorectic STAT3 pathway; but surprisingly, by interacting with the PI3K regulatory subunit (p85), Endo1 seems to be necessary for the activation of PI3K/AKT pathway, which is involved in glucose homeostasis. These results indicate a crucial role for Endo1 as (i) a regulator of neuronal leptin sensitivity, (ii) a scaffolding protein involved in leptin signaling transduction.The second mechanism, investigated in collaboration with Dr. Prevot’s team, is based on the discovery of a new post-translational modification (PTM) on OBR. We studied the functional consequences of this PTM on OBR activation state, its signaling and the development of leptin resistance and obesity. In vivo results showed that the enzyme responsible for the PTM has an increased activity in the hypothalamus of obese mice fed a HFD. Genetic or pharmacological inactivation of this enzyme prevents the establishment of leptin resistance, in an OBR dependent manner. At the molecular level, we identified some OBR residues that can undergo this PTM. Modifications of those crucial residues by the PTM impair the molecular activation state of OBR and subsequently abolish the activation of leptin-induced signaling pathways. Likewise, this enzyme interacts with OBR in hypothalamic cell; and its overactivation at the cellular level after palmitate treatment (mimicking HFD), abolishes the leptin-induced PI3K/AKT activation. These results demonstrate that the PTM targeting OBR is a new mechanism underlying leptin resistance and thus open new therapeutic perspectives against obesity.
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Analyse structurale des régions prédites comme dépliées de l’enveloppe nucléaire : exemple de l’émerine et de la lamine A. / Structural analysis of regions predicted as unfolded at the nuclear envelope : example of emerin and lamin A.

Celli, Florian 23 November 2018 (has links)
Les lamines sont le principal composant du nucléosquelette. Elles sont principalement localisées à l’enveloppe nucléaire, où elles interagissent avec la membrane nucléaire interne, les protéines associées à la chromatine ainsi qu’avec des modulateurs de la signalisation cellulaire. Le gène LMNA code pour la prélamine A et la lamine C. La région C-terminale de la prélamine A est prédite pour être désordonnée et est la cible de plusieurs événements de maturation. En effet, la protéine est farnésylée, coupée, carboxyméthylée, puis coupée à nouveau ; perdant finalement son groupement farnésyl. Un mutant de cette protéine, dont 50 acides aminés sont manquants, est responsable du syndrome d’Huchtinson-Gilford, appelé progéria (Eriksson et al., 2003). Chez ce mutant, appelé progérine, le site de coupure finale est absent et la protéine reste constitutivement farnésylée. La lamine A est connue pour interagir avec la protéine de la membrane nucléaire interne, l’émerine. L’absence d’émerine est responsable de la dystrophie musculaire d’Emery Dreifuss. L’émerine contient un LEM, suivi d’une région prédite comme désordonnée, essentielle pour l’auto-assemblage de l’émerine (Berk et al., 2014). L’oligomérisation de l’émerine régule ses interactions avec plusieurs partenaires à la membrane nucléaire interne et à la chromatine. Nous avions auparavant démontré que la région nucléoplasmique de l’émerine peut s’auto-associer pour former des filaments in vitro (Herrada et al., 2015) et nous avons récemment révélé que ces filaments sont capables d’interagir directement avec la queue de la lamine A (Samson et al., 2018). Ici, je me suis intéressé à l’analyse structurale des régions prédites comme désordonnées chez (1) l’émerine (2) la prélamine A. Dans le cas de l’émerine, j’ai analysé la conformation de la région nucléoplasmique d’émerine avant et après auto-assemblage, en travaillant avec l’émerine sauvage et plusieurs mutants entraînant des myopathies. J’ai montré que deux fragments de l’émerine 1-187 et 67-221 peuvent polymériser, tandis que leur région commune 67-187, reste toujours monomérique dans nos conditions (Samson et al., 2018). Nous avons aussi montré que le domaine LEM est au moins partiellement déplié au cours de l’assemblage de la région 1-187. J’ai également attribué les signaux RMN de la région désordonnée 67-170, dans le but d’étudier par la suite l’impact des phosphorylations de cette région sur la structure de l’émerine et sur ses propriétés d’auto-assemblage (Samson et al., 2016). Dans le cas de la lamine A, j’ai étudié la région C-terminale de la prélamine A, prédite comme dépliée et qui est le siège de nombreuses modifications post-traductionnelles. J’ai attribué les signaux RMN du peptide prélamine A ainsi que de son mutant progérine (Celli et al., 2018). J’ai montré que ces deux peptides sont en effet déplés et possèdent une hélice  transitoire très conservée. Je propose cette hélice comme site de liaison pour un partenaire encore non identifié. J’ai également démontré que le peptide prélamine A possède une tendance à s’auto-assembler. Cependant, la prélamine A et le peptide progérine sauvages et farnésylés, n’interagissent pas avec le domaine IgFold de la lamine A ni avec BAF, deux domaines associés avec la progéria. J’ai étudié par la suite les interactions de ces peptides avec deux autres partenaires associés à la progéria : la protéine de la membrane nucléaire interne SUN1 et la protéine associée à la chromatine RBBP4. SUN1 est également intrinsèquement désordonnée et très peu soluble dans nos conditions. Les résultats montrent que le peptide prélamine A ne lie pas RBBP4 mais pourrait avoir besoin de la partie C-terminale qui la précède. Cependant, RBBP4 lie directement le partenaire de la lamine BAF. Sur les bases de ces résultats, je propose une série d’expériences pour identifier les détails moléculaires des interactions entre la queue C-terminale de la lamine A, BAF et RBBP4. / Lamins are the main components of the nucleoskeleton. They are primarily located at the nuclear envelope, where they interact with inner nuclear membrane proteins, chromatin-associated proteins and cell signaling modulators. The LMNA gene codes for prelamin A and lamin C. The C-terminal region of prelamin A is predicted to be unfolded and is the target of several maturation events. Indeed, the protein is farnesylated, cleaved, carboxymethylated and cleaved again; losing eventually its farnesyl group. A mutant of this protein, lacking 50 amino acids, is responsible for the Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome (Eriksson et al., Nature 2003). In this mutant, called progerin, the final cleavage site is absent and the protein stays constitutively farnesylated. Lamin A is reported to interact with the inner nuclear membrane protein emerin. Lack of emerin is responsible for Emery Dreifuss Muscular Dystrophy. Emerin contains a folded LEM domain, followed by a region that is predicted to be disordered and is essential for emerin self-assembly (Berk et al., 2014). Emerin oligomerization regulates its interaction with several partners at the inner nuclear membrane and at the chromatin. We previously showed that the nucleoplasmic region of emerin can self-assemble to form curvilinear filaments in vitro (Herrada et al., 2015) and we recently revealed that these filaments are able to directly bind to the lamin A tail (Samson et al., 2018).Here I focused on the structural analysis of regions that are predicted to be unfolded in (1) emerin, (2) prelamin A. In the case of emerin, I analysed the conformation of the nucleoplasmic region of emerin before and after self-assembly, working on wild-type emerin as well as several mutants causing myopathies. I showed that the two fragments of emerin 1-187 and 67-221 were able to self-assemble, whereas their common region, 67-187, is always a monomer in our conditions (Samson et al., 2018). I also revealed that the LEM domain is at least partially unfolded during self-assembly of region 1-187, as a mutant with a destabilized LEM domain self-assembles faster and a mutant with a LEM domain locked in its folded conformation cannot self-assemble (Samson et al., 2017). I also assigned all the NMR signals of the unfolded region 67-170, in order to further study by NMR the impact of phosphorylation of this region on emerin structure and self-assembly properties (Samson et al., 2016). In the case of lamin A, I studied the C-terminal region of prelamin A that is predicted as unfolded and is heavily post-translationally modified. I assigned the NMR signals of this prelamin A peptide as well as its mutant peptide corresponding to the progerin sequence (Celli et al., 2018). I showed that both peptides are indeed unstructured and exhibit a partially populated  helix that has a highly conserved sequence. I propose that this helix is a binding site for a yet unidentified partner. I also revealed that the prelamin A peptide has a tendency to self-assemble. However, the monomeric prelamin A and progerin peptides, wild-type as well as farnesylated, do not interact with the immunoglobulin-like domain of lamin A/C and with BAF, two domains associated with progeria. Then, I investigated the interactions mediated by these peptides and two other important partners associated to progeria: the inner nuclear membrane SUN1 and the chromatin-associated protein RBBP4. However, SUN1 is also intrinsically disordered and poorly soluble in our conditions. First results showed that the prelamin peptide does not bind to RBBP4 but might need the remaining part of the lamin A tail for this interaction. However, RBBP4 directly binds to the lamin partner BAF. Based on my results, I propose a set of experiments to identify the molecular details of the interactions between the lamin A tail, BAF and RBBP4.
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Dynamics of protein structures and its impact on local structural behaviors / Dynamique des structures protéiques et son impact sur les comportements structuraux locaux

Narwani, Tarun Jairaj 27 June 2018 (has links)
Les structures protéiques sont de nature hautement dynamique contrairement à leur représentation dans les structures cristallines. Une composante majeure de la dynamique structurelle est la flexibilité des protéines inhérentes. L'objectif principal de cette thèse est de comprendre le rôle de la dynamique inhérente dans les structures protéiques et leur propagation. La flexibilité des protéines est analysée à différents niveaux de complexité structurelle, du niveau d'organisation primaire au niveau quaternaire. Chacun des cinq premiers chapitres traite un niveau différent d'organisation structurelle locale avec le premier chapitre traitant des structures secondaires classiques tandis que le second analyse la même chose en utilisant un alphabet structurel - les blocs protéiques. Le troisième chapitre se concentre sur l'impact d'événements physiologiques spéciaux comme les modifications post-traductionnelles et le désordre sur les transitions d'ordre sur la flexibilité des protéines. Ces trois chapitres indiquent une mise en œuvre dépendante du contexte de la flexibilité structurelle dans leur environnement local. Dans les chapitres suivants, des structures plus complexes sont prises en compte. Le chapitre 4 traite de l'intégrine αIIbβ3 impliquée dans des troubles génétiques rares. L'impact des mutations pathologiques sur la flexibilité locale est étudié dans deux domaines rigides de l'intégrine αIIbβ3 ectodomaine. La flexibilité inhérente dans ces domaines est montrée pour moduler l'impact des mutations vers les boucles. Le chapitre 5 traite de la modélisation structurelle et de la dynamique d'une structure protéique plus complexe du récepteur des chimiokines des antigènes du groupe Duffy incorporé dans un système de membrane mimétique érythrocytaire. Le modèle est soutenu par l'analyse phylogénétique la plus complète sur les récepteurs de chimiokines jusqu'à ce jour, comme expliqué dans le dernier chapitre de la thèse. / Protein structures are highly dynamic in nature contrary to their depiction in crystal structures. A major component of structural dynamics is the inherent protein flexibility. The prime objective of this thesis is to understand the role of the inherent dynamics in protein structures and its propagation. Protein flexibility is analyzed at various levels of structural complexity, from primary to quaternary levels of organization. Each of the first five chapters’ deal with a different level of local structural organization with first chapter dealing with classical secondary structures while the second one analysis the same using a structural alphabet - Protein Blocks. The third chapter focuses on the impact of special physiological events like post-translational modifications and disorder to order transitions on protein flexibility. These three chapters indicate towards a context dependent implementation of structural flexibility in their local environment. In subsequent chapters, more complex structures are taken under investigation. Chapter 4 deals with integrin αIIbβ3 that is involved in rare genetic disorders. Impact of the pathological mutations on the local flexibility is studied in two rigid domains of integrin αIIbβ3 ectodomain. Inherent flexibility in these domains is shown to modulate the impact of mutations towards the loops. Chapter 5 deals with the structural modelling and dynamics of a more complex protein structure of Duffy Antigen Chemokine Receptor embedded in an erythrocyte mimic membrane system. The model is supported by the most comprehensive phylogenetic analysis on chemokine receptors till date as explained in the last chapter of the thesis.
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Étude des mécanismes de régulation synaptique de la balance sumoylation/désumoylation / Investigating the molecular pathways driving the sumoylation/desumoylation balance in rat hippocampal synapses

Schorova, Lenka 28 March 2018 (has links)
La SUMOylation est une modification post-traductionnelle essentielle pour toutes les cellules eucaryotes. C’est un processus enzymatique qui permet la liaison covalente du polypeptide SUMO sur des résidus lysine de protéines cibles. La SUMOylation est un processus réversible sous l’action de désumoylases appelées SENP. Il est critique de maintenir un équilibre entre forme modifiée et non modifiée d’un substrat donné. En effet, la dérégulation de la balance SUMOylation/déSUMOylation a été mise en évidence dans plusieurs pathologies cérébrales. La synapse est le point de contact entre les neurones où s’effectue la communication synaptique. Ce sont des structures très denses où le processus de SUMOylation régule l’interaction et la fonction de multiples protéines. Durant ma thèse, j'ai combiné l’utilisation de l'imagerie en temps réel sur cellules vivantes avec des approches biochimiques et pharmacologiques pour identifier les mécanismes de régulation du transport de SENP1. J'ai ainsi démontré que l'activation neuronale augmente les niveaux synaptiques de SENP1. Cette augmentation synaptique résulte de la modification de la vitesse de diffusion de l’enzyme SENP1 entre les dendrites et les synapses d’une part, et d’autre part, de l’augmentation importante du temps de rétention synaptique de l’enzyme. Je rapporte également que ce mécanisme de régulation dynamique de SENP1 implique l'activation des récepteurs métabotropiques du glutamate. De plus, je suggère la participation du processus de phosphorylation dans cette régulation synapto-dendritique de SENP1 mettant ainsi en lumière un nouveau mécanisme de régulation de la balance neuronale entre SUMOylation et déSUMOylation. / Sumoylation is a vital eukaryotic posttranslational modification. Sumoylation occurs as an enzymatic cycle that conjugates SUMO proteins to target proteins. SUMO proteases (SENP) deconjugate SUMO from modified proteins and thus maintain balanced levels of SUMOylated and un-SUMOylated proteins required for physiological homeostasis. Neuronal synapses are protein-rich structures that underlie synaptic transmission and plasticity. Strong evidence exists that sumoylation occurs in synapses and regulates the function of synaptic proteins. Indeed, distortion of the SUMO balance has been linked to several pathologies of the synapse. Gaining a deeper understanding into the molecular mechanisms regulating the SUMO balance is a prerequisite to envisaging the development of novel therapies. In my PhD work, I used a combination of live-cell confocal imaging, protein biochemistry and pharmacological approaches to identify SENP1 regulatory mechanisms at synapses. I provided evidence that synaptic activation increases SENP1 protein levels at synapses. I showed that the increase in synaptic SENP1 upon synaptic activation is a result of two processes: Although (a) fewer SENP1 proteins enter into spines at low diffusion speed (b) a significant proportion of SENP1 becomes immobile and is retained in spines. I demonstrate that the regulatory mechanisms of SENP1 dynamics involve a direct activation of mGlu1/5 receptors. Moreover, I suggest that phosphorylation may play an important regulatory role in SENP1 synapto-dendritic diffusion. Altogether, I propose a novel mechanism driving for the SUMO balance at synapses.

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