O objetivo deste estudo foi determinar o papel do GDF-9 sozinho ou em combinaÃÃo com FSH sobre a viabilidade, crescimento e expressÃo do RNAm para PCNA, HAS 1, HAS 2, versican e perlecan em folÃculos secundÃrios bovinos cultivados in vitro. Para estudos in vitro, folÃculos secundÃrios bovinos foram isolados e cultivados por doze dias, na presenÃa de MEM sozinho ou suplementado com GDF-9 (200 ng/mL), FSH (D0-D6: 100 ng/mL e de D7-D12: 500 ng/mL) ou ambos. DiÃmetro folicular, viabilidade e formaÃÃo de antro foram avaliados durante o cultivo. Para avaliar os nÃveis de RNAm para PCNA, HAS 1, HAS 2, perlecan e versican em folÃculos apÃs 12 dias de cultivo, o RNA total foi extraÃdo e o cDNA foi sintetizado. Os nÃveis de RNAm foram quantificados por PCR em tempo real. O teste Kruskal-Wallis foi usado para comparar o diÃmetro folicular. O teste Qui-quadrado foi utilizado para comparar a porcentagem de viabilidade e formaÃÃo de antro de folÃculos apÃs o cultivo in vitro (p<0,05), enquanto ANOVA seguido pelo teste de Tukey foram utilizados para avaliar os dados de expressÃo do RNAm nos folÃculos cultivados (p<0,05). Os resultados mostram que apÃs 6 dias de cultivo, FSH sozinho ou associado com GDF-9 aumentaram o diÃmetro folicular em relaÃÃo ao meio controle. AlÃm disso, apÃs 12 dias de cultivo, FSH promoveu um aumento no diÃmetro folicular, enquanto a associaÃÃo de FSH com GDF-9 reduziu significativamente o diÃmetro folicular quando comparado com folÃculos cultivados em MEM acrescido de FSH. AlÃm disso, FSH e GDF-9 aumentaram a formaÃÃo de antro apÃs 12 dias de cultivo (P<0,05). Apesar de GDF-9 ter reduzido significativamente os nÃveis de RNA para HAS 1 quando comparado ao MEM, esse fator aumentou os nÃveis de versican e perlecan. AlÃm disso, a presenÃa de ambos FSH e GDF-9 aumentaram os nÃveis de RNAm para HAS 2, porÃm, reduziu os nÃveis de RNAm para PCNA. AlÃm disso, FSH tambÃm atua reduzindo os nÃveis de RNAm para o PCNA. Em conclusÃo, FSH e/ou GDF-9 promovem o crescimento folicular e formaÃÃo de antro, e GDF-9 estimula a expressÃo de versican e perlecan e interage positivamente com FSH para o aumento da expressÃo de HAS 2. / The aim of this study was to determine the role of GDF-9 alone or in combination with FSH on growth, viability and on the mRNA expression of PCNA, HAS 1, HAS 2, versican and perlecan in bovine secondary follicles cultured in vitro. For in vitro studies, bovine secondary follicles were isolated and cultured for twelve days in the presence of MEM alone or supplemented with GDF-9 (200 ng/mL), FSH (D0-D6: 100 ng/mL and of D7-D12: 500 ng/mL) or both. Follicular diameter, viability and antrum formation were evaluated during culture. To evaluate the mRNA levels for PCNA, perlecan, versican, HAS 1 and 2 in follicles after 12 days of culture, total RNA was extracted and cDNA was synthesized. The levels of mRNA were quantified by real time PCR. Kruskal-Wallis test were used to compare the follicular diameter. The chi-square test was used to compare the percentage of viability and antrum formation of follicles after in vitro culture (p<0.05), whereas ANOVA followed by Tukey's test were used to evaluate the mRNA expression data in cultured follicles (p<0.05). The results show that after 6 days of culture, FSH alone or associated with GDF-9 increased follicular diameter in relation to control medium. Moreover, after 12 days of culture, FSH promoted an increase in follicular diameter, while the association of FSH with GDF-9 significantly reduced follicular diameter when compared with follicles cultured in MEM plus FSH. Furthermore, FSH and GDF-9 increased the antrum formation after 12 days of culture (P<0.05). Despite GDF-9 had significantly reduced the levels of mRNA for HAS 1 when compared to MEM, this factor has increased the levels of versican and perlecan. In addition, the presence of both FSH and GDF-9 increased mRNA levels for HAS 2, but reduced level those for PCNA. In addition, FSH also acts by reducing mRNA levels for PCNA. In conclusion, FSH and/or GDF-9 promotes the follicular growth and antrum formation, and GDF-9 stimulates the expression of versican and perlecan and interact positively with FSH to the increased expression of HAS 2

Made available in DSpace on 2016-08-15T20:30:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 GabrielaLL_DISSERT.pdf: 3154281 bytes, checksum: e51e3f107ffe738761818a96584d12a8 (MD5) Previous issue date: 2011-01-10 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / It were done the estimative of the follicular population of the collared peccaries ovaries and the short term preservation of it using PBS or ACP. Pair of ovaries from 6 females were collected. A half of one ovary was designated to the estimative and characterization of the follicle population, and it was immediately submitted to histology and transmission electron microscopy (TEM). The other ovary was divided into 9 fragments and one of it was immediately submitted to histology procedures, the other fragments were stored either in phosphate-buffered saline (PBS; control group) or ACP medium in isothermal Styrofoam boxes containing biological ice packs. The boxes were sealed and opened only after 12, 24, or 36 h. After opening each box, the ovarian fragments were submitted to histological analysis and TEM. The temperature into the boxes and pH of the medium were checked. A total of 33273.45 ± 3019.30 preantral follicles (PF) were estimated for each ovary. Most of them was morphologically normal (94.4%) and just a few was atretic (5.6%). At histological analysis, a lot of lipids droplets was observed at oocyte cytoplasm, which was confirmed by TEM. About short term storage, it was observed that the follicular integrity was kept until 4 h, using ACP medium. The medium pH was kept constant. This work shows, for the first time, the estimative of the PF population of the ovary, totally and in each follicle category, and it´s characterization in collared peccaries (Tayassu tajacu). It could be concluded that the ACP medium may be used as an alternative medium for the short term preservation of PF in that specie. / Foram realizados a estimativa da população folicular ovariana de catetos, e ainda a refrigeração dos mesmos utilizando PBS ou ACP por curtos períodos. Os pares de ovários de 6 catetos foram coletados. Metade de um dos ovários foi destinada a estimativa e caracterização da população folicular, sendo imediatamente submetida ao processamento para histologia clássica e microscopia eletrônica de transmissão (MET). O outro ovário foi dividido em 9 fragmentos e um deles foi imediatamente destinado à histologia, os demais foram colocados em tubos com solução salina fosfatada tamponada (PBS) ou em solução à base de água de coco em pó (ACP) e acondicionados em caixas isotérmicas de 5L. As caixas foram lacradas e abertas 4h,12h, 24h e 36h após, e os fragmentos ovarianos foram submetidos à histologia e processamento para MET. A temperatura das caixas e o pH do meio foram aferidos. Um total de 33273.45 ± 3019.30 folículos pré antrais (FOPA) foram estimados para a população em cada ovário. A maioria dos FOPA apresentava-se como morfologicamente normal (94.4%) e apenas poucos deles eram atrésicos (5.6%). Na análise histológica, uma grande quantidade de gotas de lipídios foi observada no citoplasma oocitário, os quais foram confirmados através da análise ultraestrutural. Quanto à refrigeração, verificou-se que a integridade folicular foi mantida até as 4 h utilizando-se ACP. O pH dos meios de conservação permaneceu constante. Este trabalho mostra pela primeira vez a estimativa da população de FOPA do ovário, total e por categoria, e também a caracterização destes folículos em catetos (Tayassu tajacu). E pôde-se concluir que a ACP® pode ser utilizada como um meio alternativo para conservação de folículos pré-antrais.