Orientador: João Carlos Pinheiro Ferreira / Banca: Eunice Oba / Banca: Fabiana Ferreira Souza / Banca: Anthony Cesar Castilho / Banca: Anibal Ballarotti Nascimento / Resumo: O objetivo desse estudo foi descrever as características do corpo lúteo (CL) durante a luteólise parcial, em diferentes dias do ciclo estral, após desafio com sub-dose de cloprostenol sódico. Para tanto foram realizados dois experimentos que foram descritos em dois artigos. No artigo I, 32 vacas foram submetidas à sincronização da ovulação (Ovsynch + P4), sendo dessas, 28 ovularam entre 24 e 32 horas (h) após último GnRH (Dia 0) do protocolo. No D6 as vacas foram divididas aleatoriamente em três tratamentos (momento 0h): Controle (2 mL, salina, i.m.; n=10), 2XPGF (duas doses de 500 μg de cloprostenol sódico com 2 horas de intervalo, i.m.; n=8) ou 1/6PGF (83,3 μg de clorprostenol sódico, i.m.; n=10). Amostras de sangue e volume luteal, foram coletadas antes dos tratamentos e a cada 8 h durante às 48 h de observações. Também foram coletadas duas biopsias de CL nos momentos 24 e 40 h pós-tratamento. Valores com P < 0,05 foram considerados diferentes estatisticamente. Nos animais do tratamento 2XPGF, a diminuição da concentração plasmática de progesterona (P4) foi observada a partir de 16 h permaneceu diminuindo até 48 h pós-tratamento. No tratamento 1/6PGF foi observada a luteólise parcial, caracterizada pelas menores concentrações da P4 no momento 16 h seguido do aumento de nos momentos seguintes. As marcações de COX-2 e PGDH foram intensas nos momentos 24 e 40 h, porem a marcação para StAR foi intensa somente no momento 40 h. Ainda no tratamento 1/6PGF o volume luteal também diminuiu com 24 h e esse momento foi caracterizado pela menor área das células luteais grandes (LLC), comparada com o Controle, também algumas células positivas para a marcação de FAS e FAS-L. Nos momentos seguintes o volume luteal aumentou assim como a área das células tiveram tendência em aumentar. No artigo II, 39 vacas foram divididas em dois grupos e submetidas a sincronização da ovulação (Ovsynch + P4), sendo dessas ... / Abstract: We aimed describe the CL characteristics during partial luteolysis, in different days of estrous cycle, after cloprostenol sodium low-dose challenge. Therefore, two projects were conduct and describe in two articles. In the first article, 32 cows were submitted to ovulation synchronization (Ovsunch +P4), 28 cows ovulated between 24 and 32 hours (h) after last GnRH (Day 0) of ovulation synchronization protocol, and were used in the project. At D6, cows were randomly divided in three treatments (moment 0): Control (2 mL of saline 0.9%; IM, n=10), 2XPGF (two doses of 500 μg of cloprostenol sodium with 2 hours interval, n=8) and 1/6PGF (83.33 μg of cloprostenol sodium, IM, n=10). Blood samples and luteal volume were collect before treatments and every 8 h, during 48 h of observations. We also collect two CL biopsies at 24 and 40 h post-treatments. The data was considered statically different when P < 0.05. Animals from 2XPGF had progesterone concentration (P4) decreased 16 h after treatment and it remain low until 48 h after treatment. In 1/6PGF, we observe a partial luteolysis, with decrease on circulating P4 and luteal volume 16 h, after that, we observe an increase in the next moments. The COX-2 and PGDH staining were more intense at 24 and 40 h, however the staining for StAR was intense only on 40 h moment. Still in 1/6PGF treatment, the luteal volume also decrease after 24 h and this moment was characterized by large luteal cells (LLC) minor area than Control, also some positive cell for FAS and FAS-L staining. In the next moments, luteal volume increase as well as cell area tend increase. In the second article, 39 cows were submitted to ovulation protocol (last GnRH = D0), 34 ovulated between 24 and 32 h after GnRH of protocol. The cows were synchronized in a way that data collect were at the same day. Each estrous cycle day were submitted in the same 3 treatments described in Article I: D7 (n=5/2XPGF, n=5/1/6PGF e n=6/control) and ... / Doutor

Orientador: Cezinande de Meira / Banca: João Carlos Pinheiro Ferreira / Banca: Cássia Maria Barroso Orlandi / Resumo: Estudos recentes têm demonstrado diferentes respostas do CL quando da administração de prostaglandina F2α em diferentes doses e momentos. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do tratamento com baixas doses de PGF2α sobre características funcionais e estruturais de CLs em fases distintas do diestro em éguas. As éguas foram distribuídas aleatoriamente em 8 grupos: D2-NaCL (n=6; 2 mL de solução de NaCl à 0,9%); D2-Pgf (n=9; 10 mg de Dinoprost Trometamina); D2-1/10Pgf (n=6; 1 mg de Dinoprost Trometamina); D2-1/20Pgf (n=6; 0,5 mg de Dinoprost Trometamina); D8-NaCl (n=7; 2 mL de solução de NaCl à 0,9%); D8-Pgf (n=6; 10 mg de Dinoprost Trometamina); D8-1/10Pgf (n=7; 1mg Dinoprost Trometamina); D8-1/20Pgf (n=7; 0,5 mg de Dinoprost Trometamina). A área total do CL (AT), a perfusão sanguínea objetiva (PVO) e subjetiva (PVS) do CL e as concentrações plasmáticas de progesterona (P4) foram avaliados a cada 6 horas durante 48 horas (H0 = momento imediatamente antes do tratamento). A AT não sofreu interferência da dose de PGF2α independente do dia de tratamento. A P4 apresentou uma correlação positiva com a PVO e PVS, sendo esta última mais sensível na detecção das alterações de P4. O tratamento no D2 não foi capaz de induzir a luteólise completa em nenhuma égua enquanto que o tratamento no D8 promoveu luteólise completa em todas as éguas do grupo controle positivo e parcial e completa em algumas éguas dos grupos D8-1/10Pgf e D8-1/20Pgf. Resposta dose-dependente da PGF2α foi observada, ou seja, quanto menor a dose aplicada menor as quedas em PVS e P4. Conclui-se que a resposta do CL ao tratamento com diferentes doses de PGF2α depende da fase de desenvolvimento do CL / Abstract: Recent studies have demonstrated different response of the CL to different doses of prostaglandin F2α on differente moments. The present experiment aims to evaluate the effect of treatments with PGF2α low doses over functional e structural characteristics of the CLs at two distintic stages. Mares were randomly assigned into groups: D2-NaCL (n=6; 2 mL of saline solution); D2-Pgf (n=9; 10 mg of Dinoprost Tromethamine); D2-1/10Pgf (n=6; 1 mg of Dinoprost Tromethamine); D2-1/20Pgf (n=6; 0,5 mg of Dinoprost Tromethamine); D8-NaCl (n=7; 2 mL of saline solution; D8-Pgf (n=6; 10 mg of Dinoprost Tromethamine); D8-1/10Pgf (n=7; 1mg of Dinoprost Tromethamine); D8-1/20Pgf (n=7; 0,5 mg of Dinoprost Tromethamine). Total area (AT), objective (PVO) and subjective (PVS) vascular perfusion of the CL and plasmatic progesterone (P4) were evaluated every six hours for 48h after treatment (H0 = immediately before treatment). PGF2α did not influenced on AT or day of treatment. P4 showed a positive correlation to PVO and PVS, and PVS was strongly correlated to P4. Treatment on D2 was not able to induce total luteolysis in any mare while treatment on D8 promoted total luteolysis in all mares in group D8-Pgf and 29% and 14% of the mares for the groups D8-1/10Pgf and D8-1/20Pgf, respectively. Parical luteolysis were also detected in groups on D8. The response to PGF2α seems to be dose-dependent, the decrease in PGF2α dose proportionally decreases PVS and P4. It is concluded that CL response to treatment with different doses of PGF2α depends os the CL developmental stage / Mestre

Introdução: leiomiomas uterinos são os tumores benignos mais prevalentes nas mulheres em idade fértil, ocorrem em cerca de 50% da população feminina e são a indicação mais frequente de histerectomia. A importância dos esteroides ovarianos na etiologia dos leiomiomas está bem estabelecida; contudo, as contribuições relativas dos estrógenos e da progesterona no crescimento dos leiomiomas ainda são controversas. Muitos estudos têm apresentado evidências de que a progesterona seria mais importante do que os estrógenos para o desenvolvimento destes tumores, e antiprogestágenos como a mifepristona podem tornar-se uma nova possibilidade de tratamento conservador. Ensaios clínicos têm sugerido que a mifepristona é efetiva no tratamento de leiomiomas, causando redução no tamanho dos tumores. Todavia, a recorrência da proliferação dos tumores após o fim do tratamento e os mecanismos de ação da mifepristona na regulação dos receptores de progesterona ainda não estão esclarecidos. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da mifepristona sobre a proliferação celular e a expressão gênica de receptores de progesterona A e B, em um modelo de cultura de células de miométrio e leiomioma, sob diferentes condições hormonais. Métodos: fragmentos de leiomioma e de miométrio adjacente foram obtidos de cinco pacientes submetidas à histerectomia. Foram padronizadas as culturas primárias de leiomioma e miométrio, e as células de cada tipo de tecido em cultura foram divididas em cinco grupos de tratamento: estradiol, estradiol e mifepristona, estradiol e progesterona, estradiol, progesterona e mifepristona e controle (etanol utilizado como veículo dos hormônios). Foi realizada análise imunocitoquímica para α-actina. A proliferação celular foi avaliada através de contagem em hemocitômetro e ensaio de MTT no tempo 7 (após o tratamento com mifepristona) e no tempo 9 (após a recuperação do tratamento). No dia 7, foi feita extração de RNA para avaliar a expressão de receptores de progesterona (PRs) A e B através de PCR em tempo real. Resultados: o estabelecimento do modelo de cultura de células foi confirmado através da coloração positiva para α-actina e pela observação de características morfológicas típicas de células musculares lisas. As técnicas de avaliação da proliferação celular, contagem e MTT, mostraram correlação positiva. O tratamento com estradiol aumentou a proliferação celular de ambos os tipos de tecido, em relação ao grupo controle. O tratamento com progesterona associada ao estradiol aumentou a proliferação das células de ambos tecidos, em relação ao tratamento com estradiol isoladamente e ao controle. Para os dois tratamentos, as células de leiomioma proliferaram mais do que as células de miométrio. No tempo 7, o tratamento com mifepristona associada ao estradiol inibiu a proliferação celular em leiomioma (42%) e no miométrio (23%), em comparação ao mesmo tecido tratado somente com estradiol. O tratamento com mifepristona em associação com estradiol e progesterona inibiu a proliferação celular em leiomioma (105%) e miométrio (56%), em comparação ao mesmo tecido tratado com estradiol e progesterona. No tempo 9, após a recuperação do tratamento com mifepristona, células de miométrio mostraram maior resposta proliferativa do que células de leiomioma. Todavia, o tratamento com mifepristona não foi capaz de inibir completamente a proliferação celular, visto que todos os grupos tratados mostraram aumento de proliferação do tempo 7 até o tempo 9. Foi demonstrada a expressão das duas isoformas de PRs, A e B, em miométrio e leiomioma in vitro; contudo, as comparações entre os grupos de tratamento não foram possíveis devido ao reduzido tamanho amostral. Conclusões: culturas primárias de células de miométrio e leiomioma são um modelo viável para avaliação da proliferação celular em diferentes condições hormonais, e o ensaio de MTT pode ser um bom método de avaliação. A mifepristona inibiu a proliferação celular em ambos os tipos de tecido, com o maior efeito quando associada ao estradiol e à progesterona e em células de leiomioma. Células de miométrio e leiomioma expressam as duas isoformas de PRs in vitro. Mais estudos são necessários para esclarecer o papel da mifepristona na regulação da expressão gênica e proteica dos PRs. / Introduction: uterine leiomyomata are the most common benign tumors in women of reproductive age, with an estimated incidence greater than 50% and being the most common indication for hysterectomy. Importance of ovarian steroids in the etiology of leiomyomas is well established; however, relative contributions of estrogens and progesterone in leiomyomas growth are still controversial. Many studies have presented evidences that progesterone is more important than estrogens for the development of these tumors, and antiprogestins like mifepristone have become a new possibility for conservative treatment. Clinical trials suggest that mifepristone is effective in treating leiomyomata, producing reduction of their size. However, recurrence of tumor proliferation after treatment and molecular mechanisms of mifepristone action in regulating progesterone receptors remains unknown. Therefore, the aim of this study was to evaluate the effect of mifepristone on cell proliferation and progesterone receptors A and B gene expression, in a model of leiomyoma and matched myometrium cell cultures under different hormonal conditions. Methods: human leiomyoma and matched myometrial tissues were obtained from five patients undergoing hysterectomy. Cells maintened in culture from each tissue were divided into 5 treatment groups: estradiol, estradiol and mifepristone, estradiol and progesterone, estradiol, progesterone and mifepristone, and control group (ethanol as a vehicle from hormones). Immunocytochemistry analysis for α-actin was performed. Cell proliferation was evaluated by hemocytometer counting and MTT assay at day 7 (after mifepristone treatment) and day 9 (after recovery from treatment). RNA extraction was performed at day 7 to evaluate progesterone receptors (PRs) A and B expression by real time PCR. Results: culture cell establishment was confirmed by positive staining for α-actin and by observed morphological characteristics from smooth muscle cells. Cell proliferation evaluating techniques, hemocytometer counting and MTT, showed positive correlations. Estradiol treatment increased cell proliferation for leiomyoma and myometrium cells compared to control group. Progesterone combined to estradiol increased cell proliferation in both cell types, compared to estradiol alone and control group. For both hormonal treatments, leiomyoma showed significantly higher proliferation than myometrial cells. At day 7, mifepristone treatment in association with estradiol inhibited cell proliferation in leiomyoma (42%) and myometrial cells (23%), compared to the same tissue treated with estradiol alone. Mifepristone treatment in association with estradiol and progesterone also inhibited cell proliferation in leiomyoma (105%) and myometrial cells (56%), compared to the same tissue treated with estradiol and progesterone. At day 9, after recovery from mifepristone treatment, myometrial cells showed greater proliferative response than leiomyoma cells. However, mifepristone treatment was not able to completely inhibit cell proliferation, whereas treated groups showed increased proliferation from day 7 to 9. We have found that two isoforms of PRs, A and B, were expressed in both myometrial and leiomyoma in vitro; however, comparisons between groups were not possible due to the small sample size. Conclusions: primary myometrial and leiomyomata cell cultures are a viable model for cell proliferation analysis under different hormonal conditions, and MTT assay could also be a good evaluation method. Mifepristone inhibited cell proliferation of both types of tissue, with maximum effect in association with estradiol and progesterone in leiomyoma cells. PRs A and B were expressed in myometrial and leiomyoma cells in vitro. Further investigation is needed to clarify whether mifepristone regulates gene and protein expression of PRs.

A manipulação neonatal (MN) é um modelo experimental que examina como alterações ambientais no início da vida afetam estruturas neurais levando a modificações neuroendócrinas e comportamentais estáveis. Estas modificações estão relacionadas às alterações no cuidado materno que podem provocar alterações no desenvolvimento dos filhotes. Ratos manipulados, tanto machos quanto fêmeas, apresentam redução do comportamento sexual. Em fêmeas, a manipulação neonatal provoca diversas alterações morfológicas em regiões do sistema nervoso central relacionadas com o controle da reprodução, como a área pré-óptica medial, amígdala medial e o bulbo olfatório. Além disso, ratas manipuladas apresentam ciclos anovulatórios e alterações em concentrações hormonais, como ausência do pico de hormônio luteinizante (LH), diminuição da concentração plasmática de estradiol, prolactina, hormônio folículo estimulante e LH na tarde do proestro. Trabalhos demonstram que feromônios presentes na urina de ratos modulam a fisiologia reprodutiva de ratas, agindo através do órgão vomeronasal e do bulbo olfatório acessório, induzindo alterações na secreção de esteróides gonadais. A estimulação feromonal através da aplicação de urina de machos provoca a ativação de estruturas neurais relacionadas à facilitação do comportamento de lordose. O objetivo deste trabalho foi avaliar, em ratas adultas (90 dias) não-manipuladas e manipuladas durante o período neonatal, os efeitos do estímulo olfatório por feromônios da urina de machos sobre o comportamento sexual e concentração de esteróides gonadais. Para isso, foi realizada a borrifação de solução salina ou urina de ratos próxima às narinas de ratas manipuladas e não-manipuladas na noite do proestro. Este procedimento foi realizado com um spray manual a cada 10 minutos durante uma hora. Setenta e cinco minutos após o término da aplicação com o spray foi registrado o comportamento sexual e imediatamente após foi coletado o sangue para dosagem de estradiol e progesterona. Os resultados do trabalho confirmam dados anteriores em que a manipulação neonatal altera o comportamento sexual diminuindo o quociente de lordose e a frequência de intromissões penianas. Além disso, ratas manipuladas expostas à solução salina apresentaram uma tendência à diminuição da concentração de progesterona após o comportamento sexual quando comparadas às ratas não-manipuladas. Assim, podemos inferir que ratas manipuladas respondem menos às estimulações olfatórias e táteis realizadas pelo macho durante o acasalamento. O estímulo prévio com a urina de ratos machos reverteu o efeito da manipulação neonatal sobre o quociente de lordose, enquanto os níveis de progesterona não diferem dos observados nas ratas não-manipuladas. Assim, o aumento do quociente de lordose em ratas manipuladas que foram estimuladas com urina de ratos machos antes do comportamento sexual pode estar relacionado à elevação na concentração de progesterona.

A manipulação neonatal (MN) é um modelo experimental que examina como alterações ambientais no início da vida afetam estruturas neurais levando a modificações neuroendócrinas e comportamentais estáveis. Estas modificações estão relacionadas às alterações no cuidado materno que podem provocar alterações no desenvolvimento dos filhotes. Ratos manipulados, tanto machos quanto fêmeas, apresentam redução do comportamento sexual. Em fêmeas, a manipulação neonatal provoca diversas alterações morfológicas em regiões do sistema nervoso central relacionadas com o controle da reprodução, como a área pré-óptica medial, amígdala medial e o bulbo olfatório. Além disso, ratas manipuladas apresentam ciclos anovulatórios e alterações em concentrações hormonais, como ausência do pico de hormônio luteinizante (LH), diminuição da concentração plasmática de estradiol, prolactina, hormônio folículo estimulante e LH na tarde do proestro. Trabalhos demonstram que feromônios presentes na urina de ratos modulam a fisiologia reprodutiva de ratas, agindo através do órgão vomeronasal e do bulbo olfatório acessório, induzindo alterações na secreção de esteróides gonadais. A estimulação feromonal através da aplicação de urina de machos provoca a ativação de estruturas neurais relacionadas à facilitação do comportamento de lordose. O objetivo deste trabalho foi avaliar, em ratas adultas (90 dias) não-manipuladas e manipuladas durante o período neonatal, os efeitos do estímulo olfatório por feromônios da urina de machos sobre o comportamento sexual e concentração de esteróides gonadais. Para isso, foi realizada a borrifação de solução salina ou urina de ratos próxima às narinas de ratas manipuladas e não-manipuladas na noite do proestro. Este procedimento foi realizado com um spray manual a cada 10 minutos durante uma hora. Setenta e cinco minutos após o término da aplicação com o spray foi registrado o comportamento sexual e imediatamente após foi coletado o sangue para dosagem de estradiol e progesterona. Os resultados do trabalho confirmam dados anteriores em que a manipulação neonatal altera o comportamento sexual diminuindo o quociente de lordose e a frequência de intromissões penianas. Além disso, ratas manipuladas expostas à solução salina apresentaram uma tendência à diminuição da concentração de progesterona após o comportamento sexual quando comparadas às ratas não-manipuladas. Assim, podemos inferir que ratas manipuladas respondem menos às estimulações olfatórias e táteis realizadas pelo macho durante o acasalamento. O estímulo prévio com a urina de ratos machos reverteu o efeito da manipulação neonatal sobre o quociente de lordose, enquanto os níveis de progesterona não diferem dos observados nas ratas não-manipuladas. Assim, o aumento do quociente de lordose em ratas manipuladas que foram estimuladas com urina de ratos machos antes do comportamento sexual pode estar relacionado à elevação na concentração de progesterona.

Introdução: leiomiomas uterinos são os tumores benignos mais prevalentes nas mulheres em idade fértil, ocorrem em cerca de 50% da população feminina e são a indicação mais frequente de histerectomia. A importância dos esteroides ovarianos na etiologia dos leiomiomas está bem estabelecida; contudo, as contribuições relativas dos estrógenos e da progesterona no crescimento dos leiomiomas ainda são controversas. Muitos estudos têm apresentado evidências de que a progesterona seria mais importante do que os estrógenos para o desenvolvimento destes tumores, e antiprogestágenos como a mifepristona podem tornar-se uma nova possibilidade de tratamento conservador. Ensaios clínicos têm sugerido que a mifepristona é efetiva no tratamento de leiomiomas, causando redução no tamanho dos tumores. Todavia, a recorrência da proliferação dos tumores após o fim do tratamento e os mecanismos de ação da mifepristona na regulação dos receptores de progesterona ainda não estão esclarecidos. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da mifepristona sobre a proliferação celular e a expressão gênica de receptores de progesterona A e B, em um modelo de cultura de células de miométrio e leiomioma, sob diferentes condições hormonais. Métodos: fragmentos de leiomioma e de miométrio adjacente foram obtidos de cinco pacientes submetidas à histerectomia. Foram padronizadas as culturas primárias de leiomioma e miométrio, e as células de cada tipo de tecido em cultura foram divididas em cinco grupos de tratamento: estradiol, estradiol e mifepristona, estradiol e progesterona, estradiol, progesterona e mifepristona e controle (etanol utilizado como veículo dos hormônios). Foi realizada análise imunocitoquímica para α-actina. A proliferação celular foi avaliada através de contagem em hemocitômetro e ensaio de MTT no tempo 7 (após o tratamento com mifepristona) e no tempo 9 (após a recuperação do tratamento). No dia 7, foi feita extração de RNA para avaliar a expressão de receptores de progesterona (PRs) A e B através de PCR em tempo real. Resultados: o estabelecimento do modelo de cultura de células foi confirmado através da coloração positiva para α-actina e pela observação de características morfológicas típicas de células musculares lisas. As técnicas de avaliação da proliferação celular, contagem e MTT, mostraram correlação positiva. O tratamento com estradiol aumentou a proliferação celular de ambos os tipos de tecido, em relação ao grupo controle. O tratamento com progesterona associada ao estradiol aumentou a proliferação das células de ambos tecidos, em relação ao tratamento com estradiol isoladamente e ao controle. Para os dois tratamentos, as células de leiomioma proliferaram mais do que as células de miométrio. No tempo 7, o tratamento com mifepristona associada ao estradiol inibiu a proliferação celular em leiomioma (42%) e no miométrio (23%), em comparação ao mesmo tecido tratado somente com estradiol. O tratamento com mifepristona em associação com estradiol e progesterona inibiu a proliferação celular em leiomioma (105%) e miométrio (56%), em comparação ao mesmo tecido tratado com estradiol e progesterona. No tempo 9, após a recuperação do tratamento com mifepristona, células de miométrio mostraram maior resposta proliferativa do que células de leiomioma. Todavia, o tratamento com mifepristona não foi capaz de inibir completamente a proliferação celular, visto que todos os grupos tratados mostraram aumento de proliferação do tempo 7 até o tempo 9. Foi demonstrada a expressão das duas isoformas de PRs, A e B, em miométrio e leiomioma in vitro; contudo, as comparações entre os grupos de tratamento não foram possíveis devido ao reduzido tamanho amostral. Conclusões: culturas primárias de células de miométrio e leiomioma são um modelo viável para avaliação da proliferação celular em diferentes condições hormonais, e o ensaio de MTT pode ser um bom método de avaliação. A mifepristona inibiu a proliferação celular em ambos os tipos de tecido, com o maior efeito quando associada ao estradiol e à progesterona e em células de leiomioma. Células de miométrio e leiomioma expressam as duas isoformas de PRs in vitro. Mais estudos são necessários para esclarecer o papel da mifepristona na regulação da expressão gênica e proteica dos PRs. / Introduction: uterine leiomyomata are the most common benign tumors in women of reproductive age, with an estimated incidence greater than 50% and being the most common indication for hysterectomy. Importance of ovarian steroids in the etiology of leiomyomas is well established; however, relative contributions of estrogens and progesterone in leiomyomas growth are still controversial. Many studies have presented evidences that progesterone is more important than estrogens for the development of these tumors, and antiprogestins like mifepristone have become a new possibility for conservative treatment. Clinical trials suggest that mifepristone is effective in treating leiomyomata, producing reduction of their size. However, recurrence of tumor proliferation after treatment and molecular mechanisms of mifepristone action in regulating progesterone receptors remains unknown. Therefore, the aim of this study was to evaluate the effect of mifepristone on cell proliferation and progesterone receptors A and B gene expression, in a model of leiomyoma and matched myometrium cell cultures under different hormonal conditions. Methods: human leiomyoma and matched myometrial tissues were obtained from five patients undergoing hysterectomy. Cells maintened in culture from each tissue were divided into 5 treatment groups: estradiol, estradiol and mifepristone, estradiol and progesterone, estradiol, progesterone and mifepristone, and control group (ethanol as a vehicle from hormones). Immunocytochemistry analysis for α-actin was performed. Cell proliferation was evaluated by hemocytometer counting and MTT assay at day 7 (after mifepristone treatment) and day 9 (after recovery from treatment). RNA extraction was performed at day 7 to evaluate progesterone receptors (PRs) A and B expression by real time PCR. Results: culture cell establishment was confirmed by positive staining for α-actin and by observed morphological characteristics from smooth muscle cells. Cell proliferation evaluating techniques, hemocytometer counting and MTT, showed positive correlations. Estradiol treatment increased cell proliferation for leiomyoma and myometrium cells compared to control group. Progesterone combined to estradiol increased cell proliferation in both cell types, compared to estradiol alone and control group. For both hormonal treatments, leiomyoma showed significantly higher proliferation than myometrial cells. At day 7, mifepristone treatment in association with estradiol inhibited cell proliferation in leiomyoma (42%) and myometrial cells (23%), compared to the same tissue treated with estradiol alone. Mifepristone treatment in association with estradiol and progesterone also inhibited cell proliferation in leiomyoma (105%) and myometrial cells (56%), compared to the same tissue treated with estradiol and progesterone. At day 9, after recovery from mifepristone treatment, myometrial cells showed greater proliferative response than leiomyoma cells. However, mifepristone treatment was not able to completely inhibit cell proliferation, whereas treated groups showed increased proliferation from day 7 to 9. We have found that two isoforms of PRs, A and B, were expressed in both myometrial and leiomyoma in vitro; however, comparisons between groups were not possible due to the small sample size. Conclusions: primary myometrial and leiomyomata cell cultures are a viable model for cell proliferation analysis under different hormonal conditions, and MTT assay could also be a good evaluation method. Mifepristone inhibited cell proliferation of both types of tissue, with maximum effect in association with estradiol and progesterone in leiomyoma cells. PRs A and B were expressed in myometrial and leiomyoma cells in vitro. Further investigation is needed to clarify whether mifepristone regulates gene and protein expression of PRs.

Os fibroadenomas são os tumores benignos mais comuns da mama feminina, afetando principalmente mulheres jovens. Os mecanismos de crescimento e desenvolvimento destas lesões proliferativas não estão bem esclarecidos. Por terem uma influência hormonal muito semelhante à mama normal, sugere-se que os receptores de hormônios esteróides possam desempenhar um papel importante na formação destes tumores. O objetivo deste estudo foi avaliar a expressão gênica e protéica dos receptores de progesterona A e B (PRA e PRB) e a expressão protéica do receptor de estrogênio-α (ER-α) em amostras de fibroadenoma, comparativamente ao tecido mamário normal adjacente. Foram obtidas amostras de fibroadenomas e de tecido normal adjacente de 18 pacientes em idade reprodutiva submetidas à cirurgia para retirada de fibroadenoma. Os tecidos foram submetidos à extração de RNA total, pelo método de Chomzynski e Sacchi (1987), para análise da expressão gênica pela técnica de RT-PCR em tempo real.Também foi realizada a extração de proteínas para análise da expressão protéica pela técnica de Western blot. Foi ainda realizada a dosagem de progesterona e estradiol no soro das pacientes, para determinação da fase do ciclo menstrual. Não foram observadas alterações nos níveis gênicos e protéicos dos PRs e da proteína ER-α entre as fases do ciclo menstrual, tanto nos tecidos normais quanto nos fibroadenomas. Foi observada uma maior expressão protéica de ambos receptores de progesterona (A e B) nos fibroadenomas (teste t pareado de Student, P=0,038 e P=0,031, respectivamente), enquanto não houve variação dos níveis de mRNA dos PRs entre os dois tecidos (teste T de Wilcoxon, P=0,721 e P=0,139). Também não foi observada diferença significativa na expressão protéica de ER-α entre tecido normal e tumor (teste T de Wilcoxon, P=0,508). A relação entre as isoformas (PRA:PRB) não foi diferente entre os tecidos e mostrou uma forte correlação entre ambos(correlação de Spearman, r=0,964, P=0,0001). Alterações da relação PRA:PRB são observadas na carcinogênese da glândula mamária, assim como o aumento da expressão de ER-α. Assim, nossos dados sugerem uma participação dos receptores de progesterona no crescimento e formação dos fibroadenomas, mesmo sem alteração da proporção PRA:PRB nestes tumores. A expressão protéica inalterada do receptor de estrogênio-α pode ser uma resposta característica do fibroadenoma, ao contrário do que ocorre nos cânceres de mama. / Fibroadenomas are the most common benign breast tumors, occurring mainly in young women. The mechanisms of growth and development of these proliferative lesions are not elucidate. These lumps seem to have same hormonal environment that normal breast tissue, which suggest that steroid receptors can play a role on tumor development. The objective of this study was to evaluate gene and protein expression of progesterone receptors A and B (PRA and PRB) and protein expression of estrogen receptor α (ER-α) in fibroadenomas samples, comparing to adjacent normal breast. The samples provided from 18 premenopausal women undergoing surgical removal of breast fibroadenomas. Half of each sample fragment was submitted to RNA extraction by the guanidinium thiocyanate method (Chomzynski e Sacchi, 1987) to gene expression analysis by real time RT-PCR. The remaining fragment of each sample was submitted to protein extraction to analyze protein expression by Western Blot.Progesterone and estradiol determination were carried out from serum obtained from venous blood samples collected on the same day of surgical removal of tumor. No alterations on PRs gene and protein expression and ER-α protein expression were observed between follicular and luteal phase of menstrual cycle, neither in normal breast nor in fibroadenomas. Protein levels of progesterone receptors A and B were higher in fibroadenomas as compared with normal breast (Student’s paired t test, P=0.038 and P=0.031, respectively), while the PRs mRNA levels were similar in both tissues (Wilcoxon’s T test, P=0.721 and P=0.139). There were no differences of ER-α protein expression between normal breast and fibroadenomas (Wilcoxon’s T test, P=0.508). The ratio PRA:PRB was similar in the tissues, and also showed a strong correlation in both (Spearman’s correlation, r=0.964, P=0.0001). Alterations in the ratio PRA:PRB are seen in mammary gland carcinogenesis, like higher levels of ER-α. Thus, our data suggest arole of progesterone receptors in the growth and development of fibroadenomas, although without alterations of PRA:PRB ratio in these tumors. The absence of alterations in ER-α protein levels could be a characteristic behavior of fibroadenomas, unlike breast cancer.

Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2018-03-01T13:13:54Z No. of bitstreams: 1 Felipe Augusto Boudoux Martins Sales.pdf: 1079255 bytes, checksum: 2666e9a73de4a8b99f43fc79ffa1ef0d (MD5) / Made available in DSpace on 2018-03-01T13:13:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Felipe Augusto Boudoux Martins Sales.pdf: 1079255 bytes, checksum: 2666e9a73de4a8b99f43fc79ffa1ef0d (MD5) Previous issue date: 2016-02-29 / The objective of this study was to evaluate the best day to perform the embryo transfer, using ultrasound Doppler morphological characteristics of the corpus luteum (CL) and blood perfusion by analyzing the points of pixels compared to the concentration of progesterone (P4) on the day of embryo transfer. Currently, in addition to morfoecogênicas characteristics obtained by the B-mode images, it is possible to evaluate changes in the uterine hemodynamics and ovarian throughout the estrous cycle and during pregnancy by Doppler color ultrasound. The intimate relationship between the secretory function of the CL and luteal blood perfusion during diestrus and pregnancy may help to select embryos to recipients. This work was divided into study according to the day of inovulção G1 (day 3), G2 (4th), G3 (5th) and G4 (6th) using in the experiment 30 mares crossbred receptor, the animals were selected randomly and evaluated only on the day of embryo transfer. The post ovulation characteristics examined were tone, morphoechogenicity and vascularization of the uterus, the cervix tone, diameter and corpus luteum area, objective vascularization (concentration of pixels) and vascularization subjective. Also, blood samples were taken to determine the serum concentration of progesterone. a high correlation between the serum concentration of P4 was found, the objective and the subjective vascularization vascularization of CL, indicating that the evaluation of the receiver using the Doppler ultrasound tool increases security in the selection of the recipient. / Objetivou-se nesse trabalho avaliar o melhor dia para realização da inovulação, através do ultrassom doppler as características morfológicas do corpo lúteo (CL) e da perfusão sanguínea pela análise dos pontos de pixels, comparando com a concentração de Progesterona (P4) no dia da inovulação. Atualmente, além das características morfoecogênicas obtidas por imagens no modo-B, é possível avaliar mudanças na hemodinâmica uterina e ovariana durante todo o ciclo estral e ao longo da gestação por meio da ultrassonografia colorida Doppler. A íntima relação entre a função secretora do CL e a perfusão sanguínea luteal durante o diestro e a gestação pode auxiliar na seleção de receptoras de embriões. O grupos do experimento foram divididos de acordo com o dia de inovulção G1(dia 3), G2(dia 4), G3(dia 5) e G4(dia 6) utilizando no experimento 30 éguas receptoras mestiças, os animais foram selecionados aleatóriamente e avaliados apenas no dia da inovulação. As características examinadas pós ovulação foram tônus, morfoecogenicidade e vascularização do útero, o diâmetro e área do corpo lúteo, vascularização objetiva (concentração de pixels) e vascularização subjetiva. Também foram coletadas amostras de sangue para determinar a concentração sérica de progesterona. Foi encontrada uma alta correlação entre a concentração sérica de P4, a vascularização objetiva e a vascularização subjetiva do CL, indicando que a avalição da receptora utilizando a ferramenta do ultrassom doppler aumenta a segurança na seleçao da receptora.

O trabalho teve como objetivo avaliar a concentração sérica de estrógeno e progesterona em cadelas durante o ciclo estral por imunoensaio multianalito (Luminex® xMAP®), visando avaliar a aplicabilidade fisiológica e comparar os resultados obtidos com os valores já estabelecidos na literatura pelo método de radioimunoensaio (RIE). Foram utilizadas 7 cadelas da raça Border Collie, residentes do Canil Espaço Ducão (Valinhos/SP) de diferentes idades e ao primeiro sinal de sangramento vulvar (proestro/estro) foram coletadas amostras a cada 48 hs e ao seu termino (diestro), foi realizado coletas semanalmente (intervalo de 7 dias) durante aproximadamente 3 semanas. Houve correlação positiva apenas entre os valores de progesterona na fase de proestro/estro (p=0,001). Apesar de não ter ocorrido correlação entre as outras fases, as medias dos valores séricos de estradiol e progesterona foram estatisticamente significantes, em ambas as fases, sendo os valores obtidos pelo Luminex® maiores que os obtidos pelo RIE. Os valores de progesterona confirmaram os dados fisiológicos esperados em ambas as metodologias, porém os valores de estradiol não foram compatíveis com o esperado fisiologicamente, exceto quando analisados a partir das medias globais em ambas as fases. Novos estudos de validação laboratorial serão necessários para confirmar a validação fisiológica, principalmente no perfil da progesterona. Podemos concluir ainda que os valores de referência para o Luminex® devem ser diferentes dos valores já estabelecidos pelo RIE para ambos os hormônios testados / The study aimed to evaluate the serum concentration of estrogen and progesterone in female dogs during the estrous cycle by multiplex immunoassay (Luminex® xMAP®), to evaluate the physiological applicability and compare the results with the values established in the literature by radioimmunoassay (RIA). We used seven Border Collie bitches, residents in Kennel Espaço Ducão (Valinhos/SP), of different ages and for the first sign of vulvar bleeding (proestrus/estrus) samples were collected every 48 hours and its end (diestrus) were collected weekly (every 7 days) for about three weeks. There was a positive correlation only between progesterone values in the proestrus/estrus phase (p = 0.001). Despite having not occurred correlation between the other phases, the median of serum estradiol and progesterone values were statistically significant in both phases, the values obtained by Luminex® is higher than by RIA. Progesterone values confirmed the expected physiological data in both methods, however estradiol values were not physiologically compatible with the expected, except when analyzed from the global mean in both phases. A laboratory validation studies will be needed to confirm the physiological validation, especially in progesterone profile, and we can conclude that the reference values for the Luminex® should be different from the values established by RIE for both hormones tested

Vários autores já enfatizaram a importância do monitoramento do ciclo estral em cadelas e citaram exemplos de como ele pode ser feito. O objetivo deste estudo foi avaliar a técnica de dosagem de progesterona salivar para monitorar o ciclo estral da espécie. Para composição do grupo experimental, foram utilizadas 13 cadelas. As amostras de sangue e saliva foram colhidas paralelamente em todos os animais, a partir dos primeiros sinais de proestro. As amostras salivares foram obtidas com o uso de dispositivo específico para coleta Salivette®, método que se mostrou eficaz, visto que foi possível obter volume suficiente para dosagem de progesterona na grande maioria das amostras. As concentrações de progesterona no soro foram determinadas pela técnica de RIE e na saliva por EIE. Embora haja uma relação linear crescente e positiva entre a progesterona sérica e salivar (r=0,704; p<0,0001), não é possível utilizar o parâmetro salivar para determinar o momento da ovulação. / Several authors have already emphasized the importance of monitoring estrous cycle in bitches and mentioned examples of how it can be done. The aim of this study was to evaluate the salivary progesterone quantification technique in order to monitor the estrous cycle in this species. To compound the experimental group, 13 bitches were used. Blood and saliva samples were collected simultaneously in all animals, starting about the first day of proestrus signs. Salivary samples were collected with a specific device: Salivette®. This method was effective, since it was possible to obtain enough volume in almost all samples to quantify progesterone. Serum progesterone was quantified by radioimmunoassay and salivary progesterone by enzyme immunoassay. Although there is an increasing, linear and positive correlation between salivary and serum progesterone (r=0,704; p<0,0001), it is not possible to use the salivary parameter to set the moment of ovulation.