Pendant les derniers stades de la spermatogenèse, les cellules germinales mâles post-méiotiques subissent une réorganisation dramatique de l'architecture de leur chromatine, impliquant notamment le remplacement presque total des histones par les protamines, créant des noyaux fortement condensés que l'on trouve dans le sperme mature. Au cours de ce processus, un événement précoce clé est la vague d'hyperacetylation des histones, qui précède leur remplacement. Notre équipe a précédemment identifié le facteur d'expression testiculaire de la famille BET, Brdt (BRomoDomain Testis), qui se lie aux histones acétylées via ses deux bromodomaines, comme essentiel au cours de ce processus. Cependant, les mécanismes aboutissant à l'hyperacétylation des histones à l'échelle génomique sont encore inconnus, ce qui reste l'une des questions majeures dans le domaine. La protéine NUclear in Testis (NUT) est un facteur spécifique testiculaire dont la fonction physiologique dans les cellules germinales mâles était inconnue. Cette protéine se trouve exprimée de manière ectopique dans un cancer rare mais très agressif, le carcinome de la ligne médiane (NUT Midline Carcinoma), en fusion avec BRD4, produisant ainsi une protéine de fusion hautement oncogène. Dans les cellules cancéreuses NUT est capable de recruter et d'activer l'histone acétyltransférase p300, contribuant ainsi à l'activité oncogénique de la protéine de fusion BRD4-NUT. Mon projet de doctorat est d'explorer la fonction physiologique de NUT, en étudiant des souris knock-out pour NUT qui ont été générées par notre équipe en collaboration avec Mathieu Gérard (Saclay). L'absence de NUT provoque une stérilité mâle associée à un arrêt de la spermatogenèse lors de l'allongement et de la condensation des spermatides, au stade où normalement les histones sont remplacées. D'autres expériences suggèrent que NUT pourrait agir sur la régulation de marques épigénétiques, y compris l'hyperacétylation des histones. Les mécanismes par lesquels NUT interfère avec la vague d'acétylation et les facteurs en interaction, y compris Brdt, sont explorées. Au total, cette étude démontre la contribution essentielle du NUT à la régulation épigénétique et au remplacement des histones au cours de la maturation post-méiotique des cellules germinales mâles. / During the late stages of spermatogenesis, post-meiotic male germ cells undergo a dramatic reorganization of their chromatin architecture involving the almost genome wide replacement of histones by protamines, creating highly condensed nuclei that are found in the mature sperm. During this process a key early event is known to be the wave of histone hyperacetylation, which precedes their replacement. Our team previously reported that the testis specific BET factor BRDT (BRomoDomain Testis specific), which binds acetylated histones, is essential during this process. However, how this genome wide hyperacetylation occurs has remained one of the major questions in the field. NUclear protein in Testis (NUT) is a testis specific factor whose physiological function in male germ cells was unknown. It has been found ectopically expressed in NUT Midline Carcinoma, a rare but highly aggressive cancer, in fusion with BRD4, resulting in a highly oncogenic fusion protein. In cancer cells, NUT is able to recruit and activate the histone acetyltransferase p300, hence contributing to the oncogenic activity of the BRD4-NUT fusion protein. My Ph.D. project investigates the original function of NUT by using NUT knockout mice that were generated by our team in collaboration with Mathieu Gerard (Saclay). The absence of NUT causes male sterility associated with a spermatogenic arrest during spermatids elongation/condensation, at a stage when histone replacement normally takes place. Additional experiments suggest that NUT could act through the regulation of epigenetic marks, including histone hyperacetylation. The mechanisms by which NUT interferes with the hyperacetylation wave and interacting factors, including Brdt, are explored. Altogether this study demonstrates the essential contribution of NUT to the epigenetic regulation and histone replacement during the post-meiotic maturation of male germ cells.

Le principal intérêt de nos études présentées dans ce manuscrit, correspond à la compréhension des évènements, reliés aux acylations d’histones au niveau des lysines (Ks) dans les cellules germinales post méiotiques, qui régulent spécifiquement l’expression des gènes à l’échelle du génome entier.Dans la première partie de mon travail, nous avons élaboré une stratégie afin d’analyser le rôle des « histones acetyl transférases » (HATs), Cbp et p300, dans les cellules germinales post méiotiques. Pour ce faire, nous avons généré une lignée de souris conditionnellement et partiellement invalidée pour les gènes Cbp et p300 dans les cellules post méiotiques. Bien que les souris mâles sont fertiles et que la spermatogénèse semble se dérouler normalement, une analyse transcriptomique des cellules germinales haploïdes post méiotiques précoces et tardives nous a permis d’identifier une série de gènes dont l’expression est augmentée dans les cellules spermatogéniques tardives et qui sont sensibles à la diminution des niveaux de Cbp et p300. Ces résultats ont permis de révéler un programme spécifique d’expression de gènes dans les cellules germinales post méiotiques dépendant des HATs correspondantes.Prenant en compte qu’il existe une variété d’acylations des histones au niveau des lysines, nous avons étendu nos études à une modification à « quatre-carbone », la butyrylation. Nous avons alors initié une analyse comparative de l’acétylation et de la butyrylation de l’histone H₄ en positions K5 et K8 dans les cellules germinales mâles en différentiation. Nous avons cartographié à l’échelle du génome les marques H4K5ac, H4K5bu, H4K8ac, et H4K8bu au niveau de deux étapes développementales critiques avec les cellules méiotiques et les cellules post méiotiques haploïdes. Cette cartographie montre que la majorité des gènes exprimés fortement, à la fois dans les cellules méiotiques et les spermatides précoces rondes haploïdes, qu’au niveau des sites d’initiation de la transcription (TSSs) l’acétylation et la butyrylation sont interchangeables. De façon intéressante, beaucoup de ces promoteurs correspondants sont aussi reconnus par un régulateur essentiel de l’expression des gènes lors de la spermatogénèse, le factor à bromodomaine, Brdt. Une étude détaillée, des capacités de liaison du facteur Brdt sur les parties N-terminales de l’histone H4 portant des combinaisons variées d’acétylation et/ou de butyrylation en position K5 et K8, montre que la marque H4K5bu inhibe fortement la liaison du facteur Brdt. Nos résultats suggèrent qu’en addition à la fonction activatrice de Brdt vis-à-vis du programme d’expression de gènes méiotiques et post méiotiques, l’échange (« turnover ») induit par la butyrylation d’H4K5 est également important. Ce travail montre comment une interconnexion entre deux différentes acylations d’une même lysine peut jouer un rôle régulateur essentiel en augmentant la dynamique de liaison de la chromatine par un lecteur de lysine acétylé, Brdt.Enfin, au cours d’un travail collaboratif portant sur des approches structurales, nous avons montré, malgré le fait que p300 soit répertoriée comme une acétylase robuste, que son activité est réduite lorsque la longueur des chaines acyl augmente. Ces résultats suggèrent qu’in vivo, p300 puisse utiliser un co-facteur spécifique pour assurer des acylations d’histones autre qu’une acétylation.Ces investigations mettent en lumière comment la programmation du génome mâle est guidée par diverses acylations d’histone et révèlent pour la première fois l’existence d’un réseau moléculaire qui régule ces acylations et transmet un impact fonctionnel. / The main focus of the investigations reported in this manuscript is the understanding of the regulatory events that are based on histone lysine modifications in post-meiotic male germ cells, where specific and chromosome-wide regulations of gene expression occur. In the first part of my work we designed a strategy to specifically investigate the role of the histone acetyl-transferases (HATs), Cbp and p300, in post-meiotic male germ cells.Accordingly, we generated double Cbp and p300 conditional knock-out mice resulting in a partial depletion of Cbp and p300 in post-meiotic cells. Although the mice were fertile and spermatogenesis seemed to take place normally, a transcriptomic analysis of early and late post-meiotic germ cells led to the identification of a specific subset of genes with an increased expression in late spermatogenic cells that is highly sensitive to the decreased amounts of Cbp and p300. In conclusion, these results have revealed an interesting new gene expression program specific to post-meiotic male germ cells that are specifically regulated by the considered HATs.Taking into account the occurrence of a variety of histone lysine acylations, we extended these investigations to a four-carbon histone lysine modification, butyrylation. Accordingly, we have undertaken a comprehensive comparative analysis of histone H4 acetylation and butyrylation on its K5 and K8 positions in differentiating male germ cells. Genome-wide mapping of H4K5ac, H4K5bu, H4K8ac and H4K8bu at two critical developmental stages, meiotic and post-meiotic haploid cells, shows an interchangeable use of acetylation and butyrylation in the Transcriptional Start Sites (TSSs) of the most highly expressed genes in both meiotic and haploid round spermatids. Interestingly, many of these promoters are also bound by the essential regulator of spermatogenic gene expression, the BET bromodomain-containing factor, Brdt. A detailed analysis of Brdt binding capacity of H4 tails bearing various combinations of K5 and K8 acetylation and butyrylation showed that H4K5 butyrylation severely interferes with Brdt-binding. Our results therefore indicate that not only Brdt is required for the activation of a meiotic and post-meiotic gene expression program, but also its turnover induced by H4K5 butyrylation is equally important. This work hence highlights how an interplay between two different acylations occurring on the same lysines can play an essential regulatory role by increasing the chromatin binding dynamics of a critical lysine acetyl-reader, Brdt.Finally, in a collaborative work with structural biologists we showed that while p300 is a robust acetylase, its activity gets weaker with increasing acyl chain length. These results suggest that in vivo, p300 would use a specific co-factor to ensure non-acetyl histone acylations.Overall, these investigations shed an important light on how the male genome programming is guided by histone acylations and revealed for the first time a molecular network that regulates histone acylations and mediates its functional impact.