La malaria est un des fléaux les plus dévastateurs dans les pays en voie de développement. L’absence d’un vaccin et la résistance aux agents antimalariaux disponibles démontrent le besoin urgent d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Les phosphoinositides (PIP) sont des composants essentiels des membranes cellulaires chez les eucaryotes jouant un rôle important dans la signalisation intracellulaire, la synthèse d’ADN et le trafic protéique, par exemple. Malgré leur importance chez les eucaryotes, on en connaît peu sur leurs fonctions chez le parasite de la malaria Plasmodium falciparum. Dans notre laboratoire, nous avons réalisé un criblage par inactivation génique de 36 effecteurs potentiels de la voie métabolique PIP pour identifier les gènes qui sont essentiels à la prolifération chez P. falciparum. Notre étude a montré que 72% des gènes potentiellement impliqués dans la voie métabolique des PIP ne pouvaient être inactivés et sont donc potentiellement essentiels pour la survie du parasite. L’analyse d’une souche knock-out pour la protéine PfPX, ayant un domaine de liaison aux PIP de type Phox, a démontré un ralentissement sévère de la croissance du parasite. La caractérisation de la protéine PfPX a révélé qu’elle se localisait à la membrane de la vacuole digestive, le site où le parasite digère l'hémoglobine (Hb) de l'hôte afin de subvenir à ses besoins en acides aminés. Nous avons montré que les parasites dépourvus de la protéine Phox accumulaient plus d'Hb et que celle-ci était piégée dans des vésicules à proximité de la vacuole digestive, suggérant un rôle pour cette protéine dans la fusion des vésicules d’Hb avec la membrane de la vacuole digestive. Globalement, nos résultats ont révélé que les PIP ont un rôle important dans le transport de l'Hb chez P. falciparum / Malaria is one of the most devastating curses in developing countries. The absence of a vaccine and resistance to available antimalarial agents demonstrate the urgent need to identify new therapeutic targets. Phosphoinositides (PIPs) are essential components of cell membranes in eukaryotes, playing an important role in intracellular signaling, DNA synthesis and protein trafficking, for example. Despite their importance in eukaryotes, little is known about their functions in the malaria parasite Plasmodium falciparum. In our laboratory, we screened 36 putative effectors of the PIP pathway by gene inactivation to identify the genes that are essential for proliferation in P. falciparum. Our studies showed that 72% of genes possibly involved in the PIP pathway could not be inactivated and are therefore potentially essential for parasite survival. Analysis of a knockout strain for PfPX protein, having a Phox-like PIP binding domain, demonstrated a severe slowdown in parasite growth. Characterization of the PfPX protein revealed that it was localized to the food vacuole membrane, the site where the parasite digests the hemoglobin (Hb) of the host in order to meet his needs in amino acids, and in vesicular type structures. We have shown that parasites lacking the Phox protein accumulate more Hb and that it is trapped in vesicles near the digestive vacuole, suggesting a role for this protein in the fusion of Hb vesicles with the membrane of the digestive vacuole. Overall, our results revealed that PIPs play an important role in the transport of P. falciparum Hb

Les concentrés de protéines de lait sont couramment utilisés comme ingrédients lors de la standardisation du lait de fromagerie. La concentration des protéines est généralement réalisée par ultrafiltration (UF) à l’aide de membranes polymériques ayant un seuil de coupure de 10 kDa, et ce, jusqu’à un facteur de concentration volumique de 3.5X. Dans l’optique d’améliorer l’efficience du procédé d’UF, l’étude avait pour but de caractériser l’impact du mode opératoire (pression transmembranaire constante (465 et 672 kPa) et flux constant) ainsi que la température (10°C et 50°C) sur la performance du système jusqu’à un facteur de concentration volumique de 3.6X. Le module de filtration à l’échelle pilote comprenait une membrane d’UF en polyéthersulfone de 10 kDa d’une surface de 2,04 m2. La performance du système a été caractérisée sur le flux de perméation, la sélectivité et la consommation énergétique totale. L’étude a montré que le flux de perméation était 1,9 fois plus élevé à une température de 50°C comparativement à 10°C lors de l’UF du lait. Le coefficient de rejet des protéines n’a pas été affecté significativement par la pression transmembranaire et la température (P< 0,05). L’effet de la température a été observé au niveau de la teneur en calcium, laquelle était plus élevée de 12% dans les rétentats générés à 50C. La consommation énergétique totale du système d’UF était plus élevée à 10C comparativement à 50C, représentant 0,32±0,02 et 0,26±0,04 kWh/kg rétentat respectivement. Les résultats montrent que le ratio d’efficience énergétique (rapport entre le flux de perméation et la consommation énergétique) optimal a été obtenu à faible pression transmembranaire constante et à 50C. L’approche développée dans le cadre de ce projet fournira des outils aux industriels laitiers pour améliorer l’éco-efficience de leurs procédés de séparation baromembranaire. / The milk proteins concentrates are widely used as a dairy ingredient for cheese milk standardization. Milk protein concentrates are generally produced by ultrafiltration (UF) using polymeric membranes with molecular weight cut-off of 10 kDa, until a volume concentration factor of 3.5X. To improve the efficiency of the UF process, this study aimed at characterizing the impact of operating mode (constant transmembrane pressure (465 and 672 kPa) and constant flux) and temperature (10C and 50C) on the UF system performances during skim milk concentration until a volume concentration factor of 3.5X. A pilot-scale filtration module equipped with a 10 kDa polyethersulfone UF membrane with an effective surface of 2,04 m2 was used. System performance was characterized by the permeation flux, membrane selectivity and the total energy consumption. Experiments demonstrated that the permeation flux was 1,9 times higher at 50C compared to 10C. The protein rejection was not significantly affected by the transmembrane pressure and the temperature (P< 0,05). The temperature had an impact in terms of calcium content, which was 12% higher in the retentate generated at 50°C compared to the one produced at 10C. The total energy consumption was higher during UF at 10°C (0,32±0,02 kWh/kg retentate) compared to 50°C (0,26±0,04 kWh/kg retentate). The results showed that the energy efficiency ratio (ratio of the permeation flux and total energy consumption) was optimal at low constant transmembrane pressure and 50°C. The experimental approach developed in this project provides tools to dairy processors to improve the eco-efficiency of their membrane separation systems.

Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2018-2019. / Les fonctions des cellules épithéliales reposent sur la distribution asymétrique de différents constituants cellulaires, organisation structurale nommée polarité épithéliale. Plus de 80% des cancers sont d’origine épithéliale, et l’altération de la polarité cellulaire contribue à la progression du cancer. L’élucidation des mécanismes moléculaires contrôlant la polarité épithéliale est donc primordiale. La protéine Yurt permet de maintenir l’intégrité de la membrane latérale et de limiter la croissance de la membrane apicale dans les épithéliums polarisés. Les orthologues humains de Yurt, EHM2 et EPB41L5, sont surexprimés dans des cellules cancéreuses hautement métastatiques et sont associés à un mauvais pronostic. EPB41L5 est aussi impliquée dans la transition épithélio-mésenchymateuse et dans la formation des métastases. Le développement d’inhibiteurs de EHM2 et EPB41L5 pourrait donc contrer la progression tumorale. L’objectif général de mon doctorat était de mieux comprendre les modes de régulation de ces protéines, ce qui est un préalable essentiel pour la mise en place de stratégies thérapeutiques dans le contexte du cancer. Durant la polarisation des cellules épithéliales, Yurt est confinée à la membrane latérale et assure l’intégrité de ce domaine membranaire en réprimant la machinerie apicale. Aux stades tardifs de l’embryogenèse, le recrutement apical de Yurt permet de restreindre la taille de la membrane apicale. Néanmoins, les mécanismes moléculaires soutenant la dynamique spatiotemporelle de Yurt, et les mécanismes précis par lesquels Yurt inhibe la machinerie apicale étaient non définis. Au cours de mon doctorat, nous avons montré que la kinase apicale aPKC phosphoryle Yurt pour empêcher sa localisation apicale prématurée. Une version non phosphorylable de Yurt démantèle le domaine apical, indiquant que l’exclusion apicale de Yurt dépendante de aPKC est cruciale pour la polarité épithéliale. En retour, Yurt antagonise les fonctions de aPKC pour prévenir l’apicalisation de la membrane plasmique. La capacité de Yurt à lier et restreindre les fonctions de aPKC est centrale pour son rôle dans la polarité épithéliale. En effet, déléter le site de liaison à aPKC neutralise l’activité de Yurt. Ainsi, Yurt et aPKC sont impliquées dans une relation antagoniste bidirectionnelle qui contribue à la ségrégation des domaines membranaires, ce qui soutient l’architecture fonctionnelle des tissus épithéliaux. iv Ensuite, pour comprendre plus en profondeur comment est modulée l’activité de Yurt, nous avons investigué les propriétés biochimiques de Yurt et de ses orthologues. Ces protéines appartiennent à la famille des protéines à domaine « Four-point-one, Ezrin, Radixin, Moesin » (FERM). Elles possèdent également un domaine adjacent à FERM (FA pour « FERM-adjacent »), définissant un sous-groupe de la famille FERM. Certaines protéines de cette famille ont la capacité de former des homo-oligomères, ce qui module leurs fonctions. Nos résultats indiquent que Yurt et EPB41L5 sont également capables de s’homo-oligomériser. Nous avons démontré que l’unité FERM-FA définit une interface oligomérique. De plus, nous avons montré que la phénylalanine 281 (F281) et le tryptophane 283 (W283) sont particulièrement importants pour l’interaction homotypique de Yurt. En effet, la substitution de ces résidus en arginine (R) abolit l’interaction homotypique de Yurt in vitro. Nous avons alors généré une lignée de drosophile exprimant YurtF281R, W283R à partir du locus endogène yurt grâce à la technique CRISPR/Cas9. Les embryons exprimant YurtF281R, W283R sont phénotypiquement similaires aux embryons complètement dépourvus de Yurt, suggérant fortement que la multimérisation de Yurt est cruciale pour ses fonctions in vivo. Nous avons également démontré que la kinase aPKC déstabilise l’oligomère de Yurt conduisant à une répression de ses fonctions. Ceci révèle un mécanisme par lequel cette kinase supporte la formation du domaine apical. En résumé, mes travaux de doctorat ont permis de décrypter le mécanisme d’exclusion apicale de Yurt par la kinase aPKC dans les cellules épithéliales immatures. Nous avons également mis en évidence une relation antagoniste bidirectionnelle entre Yurt et aPKC. Ceci contribue à maintenir la bonne ségrégation des domaines membranaires, et ainsi soutenir l’architecture fonctionnelle des tissus épithéliaux. De plus, nous avons démontré que l’oligomérisation de Yurt est cruciale pour ses fonctions in vivo. Cette propriété biochimique est conservée chez son orthologue humain EPB41L5. Ceci offre donc une opportunité unique dans la lutte contre le cancer. En effet, des composés interférant avec cette oligomérisation pourraient limiter l’activité de EPB41L5, et ainsi combattre la progression tumorale. / The polarized architecture of epithelial cells along the apical-basal axis is crucial for epithelial tissue morphogenesis, physiology and homeostasis. Over 80% of cancers are of epithelial origin, and the alteration of cell polarity contributes to cancer progression. Elucidating the molecular mechanisms controlling epithelial polarity is therefore essential. The protein Yurt stabilizes the lateral membrane and limits apical membrane growth in polarized epithelia. The human Yurt orthologs EHM2 and EPB41L5 are overexpressed in many cancers. This correlates with poor outcome for patients. EPB41L5 also supports epithelial-mesenchymal transition and metastasis. Elaborating strategies limiting EHM2 and EPB41L5 activity is of special interest in oncology. The general objective of my PhD was to decipher the regulation of these proteins to pave the way for new therapeutic strategies for the treatment of cancer. During organogenesis, Yurt is confined to the lateral membrane and supports the stability of this membrane domain by repressing the apical machinery. At later stages of embryogenesis, the apical recruitment of Yurt establishes a local negative regulatory feedback loop that restricts the size of the apical membrane. However, the molecular basis sustaining the spatiotemporal dynamics of Yurt, and the precise mechanisms by which Yurt inhibits apical promoting factors were undefined. During the first part of my Ph.D., we demonstrated that aPKC phosphorylates Yurt to prevent its premature apical localization. A non-phosphorylatable version of Yurt dominantly dismantles the apical domain, showing that its aPKC-mediated exclusion is crucial for epithelial cell polarity. In return, Yurt counteracts aPKC functions to prevent apicalization of the plasma membrane. The ability of Yurt to bind and restrain aPKC signaling is central for its role in polarity, as removal of the aPKC binding site neutralizes Yurt activity. Thus, Yurt and aPKC are involved in a reciprocal antagonistic regulatory loop that contributes to the segregation of discrete and mutually exclusive membrane domains, thereby sustaining the functional architecture of epithelial tissues. To further define how Yurt activity is modulated, we investigated the biochemical properties of Yurt and its orthologs. Yurt and EPB41L5 belong to the Four-point-one, Ezrin, Radixin, Moesin (FERM) domain protein family. These proteins also contain a FERM-adjacent (FA) domain which defines a subfamily of FERM proteins. Some proteins of this superfamily have the ability to multimerize. Our results indicate that both Yurt and EPB41L5 oligomerize. Our data also establish that the FERM-FA unit forms an oligomeric interface, and that multimerization of Yurt is crucial for its function in epithelial cell polarity regulation. Finally, we demonstrated that aPKC destabilizes the Yurt oligomer to repress its functions, thereby revealing a mechanism through which this kinase supports apical domain formation. In summary, my Ph.D. work has deciphered the mechanism sustaining the apical exclusion of Yurt by aPKC in immature epithelial cells. We have also demonstrated a reciprocal antagonistic regulatory loop between Yurt and aPKC. This contributes to maintaining the proper segregation of membrane domains, and thus supporting the functional architecture of epithelial tissues. In addition, we have demonstrated that Yurt oligomerization is crucial for its in vivo functions. This biochemical property is conserved in its human ortholog EPB41L5. This offers a unique opportunity in the fight against cancer. Indeed, compounds interfering with this oligomerization could limit the activity of EPB41L5, and thus counteract tumor progression.

La polarité apico-basale des cellules épithéliales est indispensable au maintien de l’intégrité des tissus et sa dérégulation contribue à la progression tumorale. L’interaction antagoniste des protéines basolatérales Lethal giant larvae (Lgl) et Yurt (Yrt) avec les composants apicaux Crumbs (Crb) et la protéine kinase C atypique (aPKC) permet de définir le domaine apical et latéral. Crb et aPKC sont cruciales à la croissance du domaine apical. Les domaines apical et latéral sont délimités par les jonctions adhérentes (JA), une structure impliquée dans la cohésion cellulaire et la polarité. La protéine Girdin est essentielle à la morphogenèse des tissus épithéliaux chez Drosophila melanogaster et régule la stabilité des JA. Notre objectif est de déterminer si Girdin joue un rôle dans la polarité épithéliale et, si oui, via quels mécanismes. Nous avons montré que la diminution du niveau de Girdin, mais pas celle de composantes majeures des JA, amplifie l’apicalisation des cellules épithéliales dans les mutants zygotiques lgl ou yrt. L’activité résiduelle de Lgl et Yrt est donc réprimée suite à la réduction du niveau de girdin, possiblement suite à une sur-activation de leur répresseur aPKC. De plus, nous avons observé qu’une réduction de l’activité de girdin restaure partiellement l’intégrité épithéliale des embryons déplétés en aPKC ou mutants hypomorphes crb, un substrat apical d’aPKC, ce qui suggère que Girdin réprime l’activité d’aPKC et de Crb. Nous avons constaté que l’absence de Girdin entraîne une augmentation du niveau de phosphorylation de Yrt et Lgl, deux substrats basolatéraux d’aPKC. Girdin pourrait donc, tout en régulant les JA, moduler l’activité d’aPKC en s’y liant directement ou en s’associant à Yrt ou Lgl, deux protéines qui répriment aPKC et Crb. Nos résultats indiquent que Girdin agit comme régulateur négatif d’aPKC. Ceci place Girdin au coeur de la régulation de la polarité épithéliale, la morphogenèse tissulaire et la progression tumorale. / Apical-basal polarization of epithelial cells is indispensable for maintaining tissue integrity, and its deregulation contributes to tumor progression. The antagonistic interactions between the basolateral proteins Lethal giant larvae (Lgl) and Yurt (Yrt) and the apical components Crumbs (Crb) and the atypical protein kinase C (aPKC) define apical and basolateral domains. Crb and aPKC are essential for apical membrane growth. The apical and lateral domains are segregated by adherens junctions (AJ), a structure involved in cell-cell cohesion and polarity. The protein Girdin is essential for epithelial tissues morphogenesis in Drosophila melanogaster and mediates AJ stabilization. Our objective is to determine if Girdin has a role in regulating epithelial polarity. We have shown that reducing Girdin levels, but not the levels of other major AJ components, exacerbates the apicalization of epithelial cells in lgl or yrt zygotic mutants. Residual activity of Lgl and Yrt is thus repressed when girdin dosage is reduced, probably due to an over-activation of their repressor aPKC. Moreover, we observed that a reduction of girdin activity partially rescues the epithelial integrity of aPKC-depleted or hypomorphic crb mutant embryos, Crb being an apical substrate of aPKC. This suggests that Girdin represses aPKC and Crb activity. We noticed that the absence of Girdin leads to an increase of the basolateral aPKC substrates Yrt and Lgl phosphorylation levels. Therefore, in parallel to regulating the AJ complex, Girdin may modulate aPKC activity by either interacting directly with the kinase or by associating to Yrt or Lgl, two repressors of aPKC and Crb. Our results indicate that Girdin acts as a negative regulator of aPKC. This places Girdin as a hub in epithelial polarity regulation, tissue morphogenesis and tumor progression.

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie héréditaire liée au chromosome X. Elle est principalement causée par la délétion d’un ou plusieurs exons du gène DMD, ce qui entraine un changement du cadre de lecture et l’obtention d’une protéine dystrophine tronquée et inactive. L’édition de génome par les systèmes TALEN ou CRISPR/Cas9 est devenue dans les dernières années un grand espoir pour le développement de traitements pour ce type de maladie. Dans ce travail, nous illustrons la faisabilité d’un traitement pour la DMD en utilisant les protéines TALENs ou le complexe CRISPR/Cas9 purifiés. Ces protéines sont donc transduites afin de générer des cassures double brin dans l’ADN génomique. Ainsi, la correction de cette mutation par recombinaison non homologue pourra corriger le cadre de lecture du gène codant pour la protéine dystrophine, produisant ainsi une protéine tronquée, mais active, telle que pour les patients Becker. Bien que les protéines TALENs montrent une bonne activité in vitro, l’efficacité de coupure n’a pas pu être observée dans les cellules, ce qu’indiquerait un défaut lors de la transduction protéique. Toute fois, dans le cas du système CRISPR/Cas9, l’essai surveyor a permis d’observer les produits de coupure attendus lors de la transduction de ce système avec des lipides cationiques. Ceci indique donc que le système CRISPR/Cas9 peut être utilisé de façon efficace sous forme protéique tout en ciblant le gène DMD. Finalement, l’utilisation de ce système a été confirmée in vivo chez la souris hDMD, où il a été possible d’observer la présence des délétions ciblées. La transduction de protéines en utilisant le système CRISPR/Cas9 illustre donc une approche thérapeutique prometteuse dans le but de développer un traitement pour les maladies génétiques. / Duchenne muscular dystrophy (DMD) is an hereditary disease linked to chromosome X. It is mainly caused by the deletion of one or more exons of the DMD gene, which causes a change in the reading frame, obtaining a truncated and inactive protein. Genome editting by TALEN or CRISPR/cas9 systems has become in the recent years a powerfull tool for developing treatments for this type of disease. However, the use of plasmids encoding these systems leads to a prolonged expression, which may increase the off-target risk. Thus, it is important to note that today, viruses vectors remain the most effective delivery system for these plasmids, which always entails a risk of integration into the genome, increasing the probability of side effects for a treatment. In this work, we illustrate the development of a genome edditing treatment for DMD, but using purified protein TALENs or Cas9. These proteins are transduced in order to generate double strand breaks in the genomic DNA. Thus, the correction of this mutation by non-homologous end joining can correct the reading frame of the gene, producing a functional Dystrophin protein, as for Becker patients. Although TALEN proteins show a good activity in vitro, the cut-effectiveness has not been observed in the cells. It would indicate a defect in the protein transduction. However, in the case of CRISPR/cas9 system, we have obtained the expected cleavage products during the transduction with cationic lipids in both cell lines. These results are similar with those obteined when the plasmids coding for both systems were transfected. This indicates that the CRISPR/cas9 system can be used effectively in protein form while targeting a gene specifically. Protein therapy using the CRISPR/cas9 system can be a promising method in order to develop an alternative treatment for genetic diseases. Finally, in order to confirm that this system can be used in vivo, we will soon test it in the hDMD mouse model, containing the complete human DMD gene.

La cornée, en raison de sa localisation anatomique superficielle, est particulièrement vulnérable à divers traumatismes, lesquels peuvent mener à des déficiences visuelles importantes. Les changements dans la matrice extracellulaire (MEC) qui accompagnent les lésions de l'épithélium cornéen sont perçus par les intégrines qui, en retour, activent différentes voies signalétiques intracellulaires, menant ultimement à la réparation de l'épithélium lésé. L’objectif de cette étude consistait, d’une part, à identifier les médiateurs signalétiques dont l’expression et/ou l’activité était modifiée durant la guérison des plaies cornéennes, et, d’autre part, à analyser l’impact de l’inhibition d’un de ces médiateurs signalétiques, la kinase WNK1, sur la guérison des plaies cornéennes. L’analyse des données obtenues en profilage génique et profilage de kinases a permis d’identifier d’importantes altérations dans l’expression et l’activité de plusieurs médiateurs, dont la kinase WNK1, en réponse aux changements dans la MEC qui ont lieu durant la guérison des plaies cornéennes. En utilisant la culture de cellules épithéliales cornéennes humaines (hCECs) en monocouche et la cornée humaine reconstruite par génie tissulaire (hTEC) comme modèles, il a été possible de démontrer que l’inhibition pharmacologique de WNK1 par le WNK463 ralentit la fermeture des plaies cornéennes. De plus, des analyses de buvardage Western et des mesures de taux de croissance ont permis de démontrer que l’inhibition de WNK1 empêche l’activation de ses protéines cibles en aval SPAK et OSR1 et altère les propriétés prolifératives des hCECs. Enfin, ces résultats ont permis d’identifier WNK1 comme un joueur important dans la guérison des plaies cornéennes, attribuant ainsi une toute nouvelle fonction à cette kinase. De plus, ces résultats contribueront à une meilleure compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la cicatrisation de la cornée et pourraient mener à l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques dans le traitement des lésions cornéennes. / The cornea, because of its superficial anatomical location, is continually subjected to abrasive forces and various traumas, which can lead to significant visual impairments. Damages to the corneal epithelium trigger important changes in the composition of the extracellular matrix (ECM) to which the basal human corneal epithelial cells (hCECs) attach. These changes are perceived by integrins that activate different intracellular signalling pathways, ultimately leading to reepithelialization of the injured epithelium. The aims of this study was, first, to identify the signalling mediators whose expression and/or activation was altered during the healing process of the cornea, and second, to analyze the impact of the inhibition of one of these signalling mediators, the WNK1 kinase, on the corneal wound healing. Analysis of the gene profiling data and kinase arrays revealed important alterations in the expression and activity of several mediators, including the WNK1 kinase, in response to the ECM changes that occur during corneal wound healing. Using both monolayers of hCECs and tissue-engineered human corneas (hTECs) as in vitro models, we demonstrated that pharmacological inhibition of WNK1 by WNK463 significantly reduced the rate of corneal wound closure. In addition, Western blot analyzes and growth rate measurements have shown that inhibition of WNK1 prevents the activation of its downstream target proteins SPAK and OSR1, and alters the proliferative properties of hCECs, respectively. Finally, these results allowed the identification of WNK1 as an important player in the wound healing of the cornea, thus assigning a new function to this kinase. These results will therefore contribute to a better understanding of the cellular and molecular mechanisms involved in corneal wound healing and could lead to the identification of new therapeutic targets in the treatment of corneal wounds.

Le profilage transcriptomique global des gènes humains a permis d'estimer que 95% des gènes subissent un épissage alternatif. L'épissage alternatif élargit la diversité de notre génome et le module par des mécanismes de régulation croisée. Les principales petites ribonucléoprotéines nucléaires (snRNP), à savoir U1, U2, U4, U6 et U5, catalysent l'excision des introns d'une manière concertée. Certains des modèles d'épissage prédominants par lesquels l'AS étend la diversité du génome incluent le saut d'exon, les exons mutuellement exclusifs, le site d'épissage alternatif 5' et la sélection du site d'épissage alternatif 3'. Les protéines de liaison à l'ARN (RBP) jouent un rôle majeur dans la régulation de l´épissage alternatif en modulant le recrutement des snRNP aux niveaux des séquences cis-régulatrices; (« enhancer » et « silencer ») situées dans les exons ou les introns. L´objectif actuel dans le domaine de l´épissage est d´établir un « code d´épissage » pour chaque RBP afin de permettre la prédiction de son type d´activité en fonction de la région liée. Des applications récentes à l'échelle du génome, telles que les microréseaux et l'ARN-Seq, ont mis en lumière des modèles d'épissage souvent négligés, tels que la polyadénylation intronique et la rétention intron. La protéine de liaison à l'ARN, SAM68, module l'épissage alternatif de mTor - qui code mTOR, le régulateur principal de la croissance cellulaire et de l'homéostasie. SAM68 favorise l'épissage intron 5 normal de mTor. Des pré-adipocytes chez des souris déficientes en Sam68 ont montré des défauts de différenciation et une diminution de l'engagement dans la lignée adipocytaire. Ces souris étaient maigres et insensibles à l'obésité d'origine alimentaire. L'analyse à l'échelle d'une micropuce du tissu adipeux blanc de souris Sam68-null a permis d'identifier une régulation à la hausse d'une isoforme tronquée de mTor ; mTori5, qui se termine par transcription dans l'intron 5, en raison d'un manque d'épissage au site 5´ d´épissage. Cependant, le mécanisme par lequel SAM68 régule les événements d'épissage, en particulier dans le contexte de la reconnaissance du site d'épissage, n'a pas encore été caractérisé à ce jour. Dans cette thèse de doctorat, je décris une étude approfondie sur le rôle de SAM68 et des régions d'amplificateur intronique dans mTor intron 5 dans la reconnaissance de son site d'épissage 5' amont. Mes résultats mettent en évidence un nouveau rôle du SAM68 dans la modulation du recrutement du snRNP U1 snRNP sur des sites d'épissage de 5'. Je décris la caractérisation biochimique de l'interaction de SAM68 avec U1A, le composant central du snRNP U1 et le rôle de la phosphorylation de la tyrosine SAM68 dans la modulation de cette interaction. Je décris également comment SAM68 par son interaction avec U1 snRNP joue un rôle crucial dans le masquage des signaux de polyadénylation intronique cryptique dans un sous-ensemble de gènes. Collectivement, cette étude contribuera à une meilleure compréhension des éléments introniques et du rôle de SAM68 dans les décisions cruciales en matière d'épissage. / Global transcriptome profiling of human genes have led to the estimation that 95% of genes undergo alternative splicing. Alternative splicing expands the diversity of our genome and modulates it by cross-regulatory mechanisms. Major small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs) namely U1, U2, U4, U6 and U5 catalyzes intron excision in a concerted manner. Some of the predominant splicing patterns by which alternative splicing expands genome diversity includes include exon skipping, mutually exclusive exons, alternative 5´splice site and alternative 3´splice site selection. RNA binding proteins play a major role in the regulation of alternative splicing by modulating snRNP recruitment and they do so by binding directly to pre-mRNA sequences called splicing enhancers or silencers that are located in exons and/or introns. A current goal in the splicing field is to establish a ‘splicing code’ for each RBP, whereby its activity, as in splicing activation or repression can be predicted based on its binding region relative to splice sites. Recent genome wide applications such as microarray and RNA-Seq have shed light on the often overlooked splicing patterns such as intronic polyadenylation and intron retention. The RNA binding protein, SAM68, modulates the alternative splicing of mTor – that encodes mTOR, the master regulator of cell growth and homeostasis. SAM68 promotes normal intron 5 splicing of mTor. Pre-adipocytes of Sam68 deficient mice showed differentiation defects and decreased commitment to adipocyte lineage. These mice were lean and unresponsive to dietary induced obesity. Exon-wide microarray analysis of white adipose tissue from Sam68-null mice identified upregulation of a truncated isoform of mTor; mTori5 , that transcriptionally terminates within intron 5 due to lack of splicing at the upstream 5´splice sites. However, the mechanism by which SAM68 regulates splicing events, particularly in the context of splice site recognition, has not been characterized till date. In this doctoral thesis, I describe an in-depth study on the role of SAM68 and the intronic enhancer regions in mTor intron 5 in the recognition of its upstream 5´splice site. My results uncover a novel role of SAM68 in modulating U1 snRNP recruitment at 5´splice sites. I describe the biochemical characterization of SAM68 interaction with U1A, the core component of U1 snRNP and the role of SAM68 tyrosine phosphorylation in modulating this interaction. I also describe how SAM68 by its interaction with U1 snRNP plays a crucial role in masking cryptic intronic polyadenylation signals in a subset of genes. Collectively, this study will contribute to advanced understanding of intronic elements and the role of SAM68 in affecting crucial splicing decisions.

La protéine Girdin humaine est surexprimée dans divers types de cancers où elle contribue à la progression tumorale. Elle favorise notamment la migration et l’invasion cellulaires. Récemment, il a été montré que Girdin interagit directement avec Par-3. Cette interaction est essentielle à la polarisation des cellules en migration. Par-3 et son orthologue chez la drosophile Bazooka sont également impliquées dans l’établissement et le maintien de la polarité épithéliale et des jonctions d’adhérence (JA). La polarité épithéliale, caractérisée par la distribution asymétrique des composantes cellulaires, est nécessaire au maintien de l’intégrité des épithéliums. En effet, la perte de plusieurs régulateurs de la polarité épithéliale mène à la transition épithélio-mésenchymateuse. Nous avons donc émis l’hypothèse que Girdin est impliquée dans la polarité épithéliale et/ou l’adhésion cellule-cellule tout comme son partenaire d’interaction Par-3. Afin de vérifier notre hypothèse in vivo, nous avons généré des allèles mutants nuls de Girdin (orthologue de Girdin chez la drosophile) et établit un anticorps anti-Girdin spécifique. Tout d’abord, nous avons démontré que Girdin est essentiellement exprimée durant l’embryogenèse. Dans les épithéliums embryonnaires elle est enrichie aux JA. Ensuite, les embryons Girdin mutants présentent divers défauts morphogénétiques dont la formation de kystes ectopiques de cellules épithéliales et parfois l’ouverture de la ligne médiane ventrale, ce qui pourrait être attribuable à des défauts de cohésion cellulaire. De plus, l’association entre les composantes des JA, incluant Armadillo (β-Caténine) et DE-Cadhérine (DE-Cad), et le cytosquelette diminue dans les embryons Girdin mutants. Ces résultats suggèrent donc que Girdin est impliquée dans le maintien de la stabilité des JA. Nous nous sommes ensuite intéressés à l’implication de Girdin dans la polarité épithéliale. Bien que les mutants Girdin ne présentent aucun défaut de polarité épithéliale, nous avons pu mettre en évidence des interactions génétiques fortes entre Girdin et trois gènes codant pour des régulateurs de la polarité épithéliale : crb, yrt et lgl. Dans l’ensemble, nos résultats identifient Girdin comme un nouveau régulateur de la polarité épithéliale et de l’adhésion cellule-cellule. À l’avenir il sera essentiel de prendre en considération ces fonctions de Girdin pour évaluer s’il s’agit d’une cible thérapeutique appropriée contre le cancer. / The human Girdin protein is overexpressed in various cancers, and promotes cell migration and invasion. This suggests that Girdin contributes to tumor progression. Recently, it was shown that Girdin directly interacts with Par-3. This interaction is essential for cell polarization associated with directed cell migration. Par-3 and its Drosophila ortholog Bazooka are also known for their role in the establishment and maintenance of epithelial cell polarity and adherens junction (AJ) formation. Epithelial polarity, which is characterized by the asymmetric distribution of many cellular constituents, is necessary for epithelial tissue function and homeostasis. Indeed, loss of several epithelial polarity regulators leads to epithelial to mesenchymal transition. We thus hypothesized that Girdin plays a role in epithelial polarity and/or cell-cell adhesion, as reported for its binding partner Par-3. In order to test this premise in vivo, we generated null alleles of Girdin, which encodes the Drosophila ortholog of Girdin, and established specific anti-Girdin antibodies. First, we demonstrated that Girdin is mainly expressed during embryogenesis. In embryonic epithelial cells, it is predominantly associated with the plasma membrane and enriched at AJ. Girdin mutant embryos present several morphogenetic defects including the formation of ectopic epithelial cell cysts and opening of the ventral midline, suggesting that loss of Girdin weakens cell-cell adhesion. Consistent with this phenotype, the association between AJ components, including Armadillo (β-catenin) and DE-Cadherin (DE-Cad), and the cytoskeleton decreases in Girdin mutant animals. These results suggest that Girdin participates in AJ stability. We then investigated the implication of Girdin in epithelial polarity. Although we could not observe any epithlelial polarity defects in Girdin mutants, we found strong genetic interactions between Girdin and three genes encoding polarity regulators : crb, yrt and lgl. Together, our data identifies Girdin as a novel regulator of epithelial cell polarity and cell-cell adhesion. These results thus reveal unsuspected roles for Girdin related proteins. Comprehensive analysis of Girdin function is essential to evaluate whether it is an appropriate target to treat cancer.

Les microorganismes pathogènes qui infectent l’être humain ont besoin de fer pour croître et se multiplier. Chez l’humain, la majorité du fer est séquestré dans l’hème et dans des protéines à cause de sa faible solubilité au pH physiologique en présence d’oxygène. Les bactéries pathogènes ont dû développer divers systèmes d’acquisition afin d’utiliser l’hème comme source de fer. Les protéines ChuX, ChuY et ChuW sont codées par des gènes faisant partie du regroupement de gènes chu codant pour une voie d’acquisition directe de l’hème chez la bactérie E. coli O157:H7. Peu d’attention a été portée à ces trois protéines et les fonctions prédites selon leur séquence primaire ont été investiguées. Dans ce mémoire, nos résultats révèlent que la protéine ChuY, faisant partie de la famille des réductases à courtes chaînes atypiques, réduit le tripyrrole issu de la réaction de dégradation de l’hème catalysée par ChuS en utilisant le NADPH comme cofacteur. Cette réductase accélère aussi de neuf fois la vitesse de l’étape limitante de la réaction de ChuS, soit l’ouverture du porphyrine du verdohème. Les études spectroscopiques et la détermination des constantes cinétiques pré-stationnaires ont permis de confirmer que ChuY agit de façon catalytique. Les résultats permettent aussi de proposer un modèle de dégradation de l’hème impliquant les protéines ChuS et ChuY. La protéine ChuX aurait un rôle dans le transport et le stockage de l’hème. Nos résultats ont montré que la protéine holo-ChuX transfère l’hème à la protéine apo-ChuS rapidement, et que celle-ci assure ensuite sa dégradation. Finalement, aucun essai enzymatique n’a été effectué avec la protéine ChuW à cause de son insolubilité. Dans l’ensemble, cette étude a permis d’obtenir une meilleure compréhension du rôle respectif des protéines ChuY et ChuX dans le système d’acquisition de l’hème par E. coli O157:H7. / Pathogenic microorganisms that infect a mammalian host need iron to survive and grow. However, because of its low solubility at physiologic pH in aerobic environment, the majority of iron is sequestered in heme and proteins. Pathogenic bacteria have developed ways to acquire heme from the host as a source of iron. ChuX, ChuY and ChuW are proteins encoded by a gene cluster involved in direct heme acquisition in Escherichia coli O157:H7. So far, these three proteins have received little attention. In this study, the functions of these proteins have been investigated based on predictions from the primary sequence analyses. Our results reveal that the ChuY protein, belonging to the short chain dehydrogenase/reductase family, reduces the tripyrrole derived from the heme degradation reaction catalyzed by the ChuS protein using NADPH as cofactor. ChuY also accelerates nine times the rate-limiting step of the ChuS reaction, which is the opening of the porphyrin ring of verdoheme. Spectroscopic studies and the determination of the pre-stationary kinetic constants have confirmed the catalytic reductase activity of ChuY. From our results, a model of heme degradation involving both the ChuY and ChuS proteins is proposed. The ChuX protein is predicted to have a role in the transport and storage of heme. Our results show that holo-ChuX can transfer heme to the apo-ChuS protein quickly, after which heme degradation can start. Enzymatic testing of the ChuW protein could not be carried out because of the insolubility of this protein. Overall, this study has resulted in a better understanding of the respective role of the ChuY and ChuX proteins in the direct heme acquisition system of E. coli O157:H7.

Problématiques : 1) Mes travaux de maitrise ont démontré qu’il était possible de fusionner des hormones peptidiques avec la protéine fluorescente verte (EGFP) pour obtenir des ligands de haute affinité avec un haut poids moléculaire supportant des expériences d’imagerie. Cela a permis de détecter les deux récepteurs de la bradykinine (BK; B1R et B2R) ainsi que le récepteur PTH1 de la parathormone (PTH, PTH1R), trois récepteurs couplés aux protéines G (GPCR). Malgré la haute affinité de ces sondes, les applications restent limitées à des systèmes surexprimant le récepteur cible recombinant. Cela s’explique par les deux raisons suivantes : a) la faible abondance des récepteurs endogènes et b) le faible rendement de la fluorescence. 2) La génération de ligands de haut poids moléculaire et la démonstration que ceux-ci avaient toujours une activité pharmacologique pourrait permettre de résoudre une problématique majeure reliée à l’administration thérapeutique de BK. Malgré l’accumulation de preuves du rôle protecteur de la BK sur le système vasculaire, les récepteurs de la BK sont des cibles pharmacologiques quasi inexploitées, car les effets délétères causés par les agonistes de la BK, notamment au niveau de l’inflammation et de la génération de douleur, semblent limiter leur développement. Objectifs : 1) Étudier la pharmacologie de la maximakinine (MK), un analogue de la BK, et le potentiel de ce peptide comme module conférant l’affinité au récepteur B2 dans la conception de ligands biotechnologiques. 2) Générer des protéines de fusion ligands des deux principales familles de GPCRs (A : B2R; B : PTH1R). 3) Utiliser ces protéines de fusion pour permettre la détection de faibles niveaux de récepteurs difficilement détectables par les stratégies conventionnelles. 4) Évaluer l’activité pharmacologique de ces protéines de fusion. Résultats : Deux des trois protéines de fusion PTH générées (PTH-myc et PTHHRP) sont capables de détecter de manière spécifique les niveaux endogènes de PTH1R exprimés par les cellules HOS (ostéosarcome humain) grâce à leur domaine peroxydase intrinsèque ou assemblé. La protéine de fusion PTH-HRP est la plus prometteuse, et peut aussi être utilisée comme ligand non-isotopique dans un essai de compétition de liaison pour identifier de nouveaux ligands du PTH1R humain. La MK est un agoniste direct du récepteur B2 de rat, mais n’a qu’une affinité marginale pour le récepteur B2 humain. L’essai de contractilité de la veine ombilicale humaine a démontré que la MK était une pro-drogue pour le B2R humain, activée par des peptidases présentes dans ce tissu. La MK ne stimule pas la dégranulation des mastocytes via le récepteur MRGPRX2, malgré sa forte charge positive. Chez le rat, la MK est un agoniste persistant, résistant à la dégradation et de haute affinité pour le B2R. La protéine de fusion fluorescente EGFP-MK est un agoniste spécifique du B2R de rat, mais pas du B2R humain. Des études in vitro ont démontré qu’elle était aussi un agoniste persistant de haute affinité pour le B2R de rat. La protéine de fusion avec domaine peroxydase APEX2-(NG)15-MK permet la détection du récepteur B2 de rat recombinant de manière spécifique et efficace. De plus cette protéine de fusion peut être utilisée comme ligand non-isotopique dans des essais de compétition de liaison pour identifier de nouveaux ligands du B2R de rat. Il est possible de générer des protéines de fusion contenant la MK agoniste du B2R de rat de très haut poids moléculaire (>66 kDa), mais ceux-ci peuvent avoir une activité pharmacologique limitée par l’encombrement stérique entre la protéine de fusion et le récepteur. Conclusions et perspectives : Il est possible de générer des protéines de fusion avec des domaines enzymatiques agonistes des récepteurs B2 et PTH1. Cela permet une amplification significative du signal émis par les iv protéines de fusion comparativement aux protéines de fusion fluorescentes. La détection des niveaux endogènes de GPCRs par des protéines de fusion pourrait permettre de les utiliser dans des tests diagnostiques. Ces travaux, qui ont démontré qu’il était possible de générer des ligands biotechnologiques de haut poids moléculaire agonistes des principales classes de GPCRs (A et B), pourraient être appliqués aux autres ligands membres de ces familles en accord avec les modèles de liaisons de chaque ligand.