Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2008-2009 / L'angiogenèse et la formation de métastases sont des évènements clés dans le développement du cancer, de sa prolifération et de sa dissémination. Ces évènements sont contrôlés principalement par différents facteurs de croissance et par l' adhésion cellulaire. Pour comprendre les bases moléculaires du cancer, il est impératif de comprendre les mécanismes moléculaires de réponse aux facteurs de croissance et les mécanismes d'adhésion. Les kinases de la famille PAK (p21 Activated Kinase) et de la famille MLK (Mixed Lineage Kinase) régulent l'adhésion, la migration, la morphologie et la division cellulaire. Les travaux du laboratoire du Dr Moss ont démontré la nécessité de xP AKI dans la migration des cellules de la crête neurale et dans l'adhésion des blastomères d'embryons précoces. D' autre part, xMLK2 fut montrée comme étant essentielle à la formation du pronéphros. Donc, pour déterminer les mécanismes moléculaires modulés par xP AKI et xMLK2 chez Xenopus, j'ai identifié et caractérisé de nouveaux partenaires de ces kinases. Pour les interacteurs de P AK, mes travaux se sont concentrés sur le clone N 126 codant pour une protéine apparentée aux synaptotagmines, nommé E-Syt2 (Extended Synaptotagmin 2). Mes travaux ont identifié E-Syt2 comme inhibant l' activation de PAKI par Cdc42 et Rac. Cette inhibition entraîne la dépolymérisation de l' actine corticale. Nos études ont également identifié E-Syt2 comme un adaptateur endocytique pour le récepteur activé du FGF (FGFRl) et un régulateur de la voie de signalisation FGF. En effet, E-Syt2 interagit avec le FGFRI activé et avec l' adaptateur endocytique de la voie clathrine AP-2. Par ces interactions, elle gouverne l' internalisation et la signalisation émanant du FGFRl. De ce fait, mes études ont identifié une nouvelle protéine contrôlant l'activité de P AK 1, la stabilité de l' actine et la signalisation induite par les facteurs de croissance; elle représente donc une cible intéressante pour des thérapies contre le cancer. Mes travaux sur xMLK2 ont identifié un régulateur négatif de cette protéine, appelé ube2d3.2. Cette protéine fait partie de la famille des enzymes de conjugaison à l' ubiquitine (E2) et est co-exprimée avec xMLK2 dans le pronéphros où elle régule le niveau protéique de xMLK2 par ubiquitinylation. Puisque xMLK2 est requise pour la formation d' épithéliums provenant de tissus mésenchymateux, sa régulation négative par une E2 est importante pour les mécanismes contrôlant la transition épithélium-mésenchyme.

La PARP-1 est une enzyme modulaire très conservée, dont la structure comprend: 1) un domaine amino-terminal de liaison à l'ADN (DBD), contenant un signal de localisation nucléaire et trois doigts de zinc Znl, Zn2 et le Zn3 récemment découverts, ces trois doigts agissent comme détecteur moléculaire de cassures dans l'ADN; 2) un domaine régulateur central contenant un motif BRCT et des sites accepteurs de poly (ADP-ribose) permettant d'inactiver la PARP-1 (réaction d'automodification) ; et 3) un domaine carboxy-terminal catalytique renfermant le site actif. Dans notre étude, après avoir clone différentes protéines recombinantes par PCR, nous avons fait des essais de poly (ADP) ribosylation sur des extraits crus des cellules. En outre, nous avons fait des essais de retardement sur gel (EMSA) avec des oligonucleotides pour évaluer les interactions des peptides, correspondants aux fragments du domaine DBD, avec ces oligonucleotides afin d'essayer d'expliquer le mode d'activation de l'enzyme.

Afin de mieux comprendre la fonction et l'importance de l'interférence à l'ARN (iARN) chez les eucaryotes, l'identification des protéines cellulaires pouvant moduler ou être requises pour le fonctionnement de l'iARN, en particulier pour la fonction de la ribonucléase Dicer, et des protéines régulées par l'iARN est essentielle. Dans le premier volet de cette étude, nous avons réalisé des coimmunoprécipitations pour identifier les protéines cellulaires pouvant interagir avec Dicer chez la levure Schizosaccharomyces pombe (S. pombe). Deux protéines ont ainsi été identifiées par analyse protéomique, soit la protéine ribosomale L12 et la protéine Byr3. Le deuxième volet de cette étude a consisté à identifier les protéines régulées par la voie de l'iARN chez S. pombe. Nous avons donc procédé à des analyses par gel 2D du protéome des lignées Hu303 (type sauvage) et Hu679 (Dcr1?). Ces analyses suggèrent un rôle possible de la voie de l'iARN dans le contrôle de la glycolyse.

Chez Saccharomyces cerevisiae, le cytosquelette d'actine est formé de câbles d'actine et de granules corticaux. La surexpression d'ARF3 dans trois souches présentant un défaut soit dans la formation des câbles soit dans l'organisation des granules corticaux a entraîné une correction de leurs phénotypes. Ces résultats suggèrent un rôle pour Arf3p dans la formation et/ou l'organisation de ces deux structures. La mutagenèse dirigée a permis de démontrer que la myristoylation d'Arf3p est nécessaire à son activité. La localisation spécifique d'Arf3p est dépendante des protéines Bni1p, Drs2p, Gea1p et Gea2p qui ont un rôle dans l'organisation du cytosquelette d'actine. De plus, ARF3 démontre une interaction génétique avec GEA2 et la surexpression de GEA2 et de la région fonctionnelle de BNI1 corrigent le bourgeonnement aléatoire d'arf3?. Ces résultats indiquent un rôle important pour Arf3p dans l'organisation du cytosquelette d'actine ainsi qu'un lien entre cette protéine et plusieurs autres impliquées dans cette structure.

La maladie de Huntington (MH) est une maladie neurodégénérative autosomique dominante qui affecte environ 3 à 8 personnes sur 100 000 dans le monde. La MH est causée par une mutation du gène HTT, lequel code pour la protéine huntingtine (HTT). Cette mutation consiste en une expansion de 35 répétitions CAG à même l'exon 1 du gène et aboutit à une répétition de la séquence polyglutamine (polyQ) au sein du segment N-terminal de la protéine HTT. Les personnes atteintes de MH développent des troubles moteurs, cognitifs et psychiatriques sévères, principalement à l'âge adulte. L'âge d’apparition des symptômes est généralement inversement proportionnel au nombre de répétitions CAG bien que la symptomatologie varie considérablement d'un patient à l'autre. L'origine de la MH est associée à l'expression de la protéine HTT mutée (mHTT) qui, en raison de son expansion polyQ, adopte une conformation pathogène et s'accumule en petits et/ou gros agrégats cytotoxiques. Bien que l'on suppose que ces événements soient responsables de la neurodégénérescence, le mécanisme sous-jacent aux voies physiopathologiques menant à l'apparition de la maladie et à la mort neuronale est toujours à l'étude. Un nombre croissant d'observations suggère que la mHTT possède des capacités de type prion, c’est-à-dire une aptitude à recruter des protéines endogènes normales et les corrompre afin de créer des agrégats toxiques; capacités qui sont également connues pour d'autres protéines, notamment l'amyloïde, la tau et la a-synucléine, associées à diverses maladies neurodégénératives. Nous avons émis l'hypothèse que le mHTT se propage de cellule en cellule et qu'elle se comporter tel un prion, contribuant à influencer le développement de la MH. Afin de tester cette hypothèse, des fibrilles synthétiques de mHTT ont été administrées à plusieurs lignées cellulaires ainsi qu'à des souris de différentes souches génétiques. Suite à une période d'incubation, les effets des fibrilles de mHTT sur la viabilité cellulaire, le comportement animal et les caractéristiques neuropathologiques ont été examiné. Nous avons ainsi observé que les fibrilles de mHTT provoquaient la mort cellulaire et des changements morphologiques des cellules cultivées, tandis qu’elles induisaient un phénotype comportemental transitoire de la maladie chez des souris saines. Les fibrilles de mHTT pouvaient également exacerber les déficits moteurs, anxieux et cognitifs de type MH dans un modèle de souris huntingtonien. Ainsi, notre étude suggère que la mHTT extracellulaire peut se propager de cellule à cellule et, une fois recrutée au sein de la cellule, provoquer des changements pathologiques. À la lumière de ces observations, nous croyons que la mHTT extracellulaire pourrait représenter une cible attrayante pour le développement de futures stratégies thérapeutiques. De surcroît, la plupart des traitements en études cliniques sont conçus pour cibler le gène HTT dans le but de diminuer l'expression de la protéine, ignorant la quantité importante de mHTT déjà présente dans le système à l'âge adulte. Par conséquent, une thérapie combinatoire ciblant, à la fois l'expression de mHTT et la mHTT extracellulaire préexistante, pourrait se révéler une voie prometteuse pour le traitement de la MH. / Huntington’s disease (HD) is an autosomal dominant neurodegenerative disease that affects approximately 3 - 8 people in 100,000 individuals worldwide. HD is caused by a mutation in the HTT gene, which codes for the protein huntingtin (HTT), consisting of an expansion of 35 CAG repeats in the exon 1 of the gene and resulting in the elongated polyglutamine (polyQ) stretch at the N-terminal fragment of the protein HTT. Individuals who suffer from HD develop severe motor, cognitive and psychiatric impairments, which primarily manifest in adulthood. The onset of the disease is usually inversely proportional to the CAG repeat expansion, however, HD comes with a high variability of symptoms. HD is also associated with the expression of the mutated HTT (mHTT) protein. The mHTT protein adopts a pathogenic conformation, which accumulates in small and/or large cytotoxic aggregates. Although these events are suspected to contribute to neurodegeneration, the exact mechanisms underlying the pathophysiological pathways leading to disease onset and neuronal death are still under investigation. A growing body of evidence suggests that mHTT possesses prion-like capacities – the capacity to spread between cells and seed disease – a phenomenon associated with other proteins such as amyloid, tau and a-synuclein, all involved in various neurodegenerative diseases. We hypothesized that mHTT propagates in a non-autonomous manner and behaves in a prion-like fashion to influence the onset and severity of HD. To address this, exogenous synthetic mHTT fibrils were administered to several cell lines and to mice of different genetic backgrounds. Following an incubation period, the effects of mHTT fibrils on cellular viability, animal behavior and neuropathological features were examined. We observed that mHTT fibrils provoked cell death and morphological changes in cultured cells, induced transient HD-related behavioral phenotypes in healthy mice and exacerbated motor, anxiety-like and cognitive deficits in an HD mouse model. Our study suggests that extracellular mHTT can propagate between cellular elements and once uptaken, trigger pathological changes. In light of these observations, we believe that extracellular mHTT could represent an appealing target for future therapeutic strategies. Current disease-modifying treatments tested in the clinic are designed to target the HTT gene to decrease the expression of the protein, overlooking the mHTT load outside of the cell boundaries and/or which has accumulated in the system prior to the application of gene silencing/editing. Hence, a combinational therapy addressing both the intracellular and extracellular expression of mHTT could serve as a more global treatment of HD.

La voie de signalisation insuline/IGF-1 est l'un des déterminants du vieillissement et des maladies liées au vieillissement. IGF binding protéine 2 (IGFBP2) est sécrétée par les adipocytes blancs. De plus, la surexpression d'IGFBP2 chez la souris améliore la sensibilité à l'insuline, et une étude récente a montré que IGFBP2 contribue fortement à l'effet bénéfique de la leptine sur le métabolisme du glucose. Cependant, les niveaux d'expression d'IGFBP2 dans les conditions de résistance à l'insuline, et les facteurs physiologiques et moléculaires qui contrôlent les niveaux de IGFBP2 dans ce contexte ne sont pas bien établis. Le travail présenté dans cette thèse montre que dans le tissu adipeux blanc viscéral (vWAT), mais non le sous-cutané, les niveaux d'ARNm d'IGFBP2 étaient significativement plus faible chez les souris âgées ainsi que dans des modèles génétique (ob/ob, db/db) nutritionnels d'obésité comparés à ceux de leurs témoins jeunes et maigres. Chez la souris, l'expression d'IGFBP2 dans le vWAT était significativement associée au taux d'IGFBP2 circulants, ce qui suggère une contribution importante de ce tissu. L'effet négatif du vieillissement sur le taux d'ARNm d'IGFBP2 dans le vWAT a été confirmé chez les hommes obèses. Ces résultats démontrent que la transcription du gène IGFBP2 est modulée de façon dépôt spécifique chez les souris et les hommes. Nous avons également démontré que l'insuline augmente significativement l'expression d' IGFBP2 dans les adipocytes 3T3L1. Cet effet a été fortement réduit dans les adipocytes insulino-résistants. Le co-traitement avec la wortmannine et la rapamycine diminue les effets de l'insuline, ce qui suggère la contribution de la PI3K et de mTOR dans la stimulation d'IGFBP2 par l'insuline. En outre, les niveaux d'ARNm d'IGFBP2 étaient considérablement augmentés lorsque les adipocytes étaient invalidés pour les gènes TORC2 ou 4EBP1, qui sont les régulateurs en aval de la voie de signalisation de l'insuline. L'incubation des adipocytes avec de l'insuline a déclenché le recrutement de C/EBPa à la région proximale du promoteur IGFBP2, malgré l'absence d'impact notable sur les niveaux de C/EBPa per se. Ces résultats indiquent que la voie de signalisation de l'insuline régule la transcription d'IGFBP2. Puisque les niveaux d'IGFBP2 sont positivement corrélés avec la sensibilité à l'insuline, les méthodes pour accroître la production d'IGFBP2 par cette voie pourraient améliorer les caractéristiques associées au syndrome métabolique. Nous avons exploré cette possibilité dans un contexte clinique, dans lequel nous avons quantifié les taux d'IGFBP2 circulants par ELISA chez les patients obèses ayant perdu du poids et de la graisse corporelle, soit par une chirurgie de diversion biliopancréatique (DBP), ou par les changements de mode de vie (régime alimentaire et exercice physique modéré). Dans les deux cas, les niveaux circulants d'IGFBP2 ont été fortement augmenté par ces interventions. Par ailleurs, les niveaux d'IGFBP-2 étaient corrélés positivement avec la sensibilité à l'insuline et de cholestérol HDL. Ces résultats suggèrent l'implication d'IGFBP2 dans l'amélioration de la sensibilité à l'insuline et dans le métabolisme lipidique. Nous suggérons qu'IGFBP2 est un facteur critique qui est entre autre produit par le tissu adipeux en fonction de la résistance à l'insuline, et que la stimulation de son expression est associée à des effets favorables sur la sensibilité à l'insuline, le métabolisme du glucose et l'accumulation de masse grasse.

Les os constituent une part importante du corps humain. Ils sont sollicités tout au long de la vie : ceci expose les différents os à une multitude de traumatismes. La correction des traumatismes osseux est un problème de tous les jours pour les chirurgiens orthopédiques et maxillo-faciaux. Malgré toutes les connaissances actuelles en chirurgie osseuse, il existe encore plusieurs limitations en rapport avec la guérison post-chirurgicale des greffes autogènes. La régénération osseuse à partir des facteurs de croissance pourrait venir en aide à la médecine moderne. L'objectif du présent travail est d'étudier l'effet des protéines de la morphogenèse de l'os (Bone Morphogenetic Proteins : BMPs) sur la régénération osseuse par de multiples expériences in vitro. Un modèle in vitro d'ingénierie osseuse a servi à comparer l'activité ostéogénique des BMPs, soit des homodimères de BMP-2 et de BMP-7 et de l'hétérodimère de BMP-2/BMP-7, pour étudier la croissance et la différenciation des ostéoblastes sur l'expression de l'ostéocalcine (OC), de l'interleukine-6 (IL-6), de la métalloprotéinase-2 (MMP-2) et de leurs inhibiteurs tissulaires TIMP-1 et TIMP-2. Notre approche expérimentale démontre que les homodimères de BMP-2 et BMP-7 ainsi que l'hétérodimère de BMP-2/BMP-7 favorisent la croissance des ostéoblastes et la production d'OC via l'lL-6. Aussi, comme les homodimères et l'hétérodimère, les deux protéines BMP-2 et BMP-7 stimulent la production de la matrice extracellulaire par l'inhibition de la production des MMPs via les TIMPs.

Plus de 25 millions de personnes à travers le monde sont atteintes de différentes formes de démences, la plus répandue étant la maladie d’Alzheimer (MA). Cette maladie neurodégénérative est caractérisée par la présence de plaques de peptides amyloïde-β et d’enchevêtrements neurofibrillaires formés d’agrégats toxiques de la protéine Tau. Ces agrégats sont dus à l’hyperphosphorylation de cette protéine associée aux microtubules, déstabilisant son interaction avec ceux-ci et participant à la dégénérescence neuronale. Pour étudier la protéine Tau, certains laboratoires utilisent des modèles animaux, et les méthodes de préparation des échantillons biologiques prélevés varient d’un laboratoire à l’autre, affectant potentiellement son observation. La MA est la plus connue des Tauopathies, qui est un groupe de maladies exprimant une forme pathologique de la protéine Tau. Il existe aussi des Tauopathies dites secondaires, où la pathologie Tau apparaît dans les stades tardifs de la maladie, comme la maladie de Huntington (MH) où il existe une pathologie Tau qui est cependant mal caractérisée chez l’humain. Dans ce contexte, nos hypothèses sont qu’une meilleure caractérisation immunohistochimique et biochimique de la protéine Tau est nécessaire puisque les méthodes présentement utilisées pour sa caractérisation ne sont pas optimales et que la MH est effectivement une Tauopathie secondaire chez l’humain due à l’hyperphosphorylation de Tau et une déficience de l’épissage alternatif aux stades avancés de la maladie. Nos objectifs étaient d’optimiser les méthodes de préparation pour l’étude de Tau par immunohistochimie dans des modèles murins et d’analyser les niveaux de phosphorylation et l’épissage alternatif de Tau dans les cerveaux post-mortem d’individus atteints de la MH. Les résultats obtenus suggèrent qu’une fixation au Bouin, sans perfusion et à 4°C semble être la meilleure méthode pour l’observation de Tau par immunohistochimie. L’hyperphosphorylation et les défauts d’épissage de Tau observés dans la MH permettent de définir cette pathologie comme une Tauopathie secondaire. / More than 25 million people worldwide are affected by different forms of dementia, the most known being Alzheimer’s disease (AD). This neurodegenerative disorder is characterized by the presence of β-amyloid plaques and neurofibrillary tangles formed by toxic aggregates of Tau protein. These aggregates are due to the hyperphosphorylation of this microtubule-associated protein, which destabilize its interaction with them and could participate to neuronal deterioration. To study Tau protein, many laboratories use animal models, and preparation methods of biological samples vary between each laboratory, which could potentially have effects on its observation. AD is the most common Tauopathy, a group of diseases expressing a pathological form of Tau protein. There are also secondary Tauopathies, where Tau pathology appears in late stages of the disease, such as Huntington’s disease (HD), with a Tau pathology that is not well characterized in humans. In this context, our hypotheses are that a better immunohistochemical and biochemical characterization of Tau protein is needed since methods currently used for its characterization are not optimal and that HD is indeed a secondary Tauopathy in human due to hyperphosphorylation of Tau and deficiency of splicing in advanced stage of the disease. Our objectives were to compare different preparation and fixation methods for the study of Tau protein by immunohistochemistry in mice models, and also to analyze phosphorylation and splicing levels of Tau protein in post-mortem brains of individuals with HD. Our results suggest that a fixation with Bouin, without perfusion and at 4°C would be the best method for the observation of Tau protein by immunohistochemistry, and that hyperphosphorylation and splicing impairments observed in individuals with HD allow to define this pathology as a secondary Tauopathy in humans.

Thèse ou mémoire avec insertion d'articles. / La pancréatite aiguë (PA) constitue la principale cause d'admissions en centre hospitalier liée à des troubles gastrointestinaux dans le monde, et sa prévalence est en augmentation. La PA est associée à plusieurs comorbidités dont la prévalence mondiale est également en augmentation, comme le syndrome métabolique et le diabète de type 2. L'architecture génétique de la PA demeure toutefois peu caractérisée et peu ou pas d'options thérapeutiques existent présentement pour sa prévention ou son traitement. Notre hypothèse était qu'il est possible d'identifier de nouveaux gènes associés à la PA à l'aide d'études d'association pangénomiques et d'identifier des protéines circulantes associées à la PA à l'aide de la randomisation mendélienne à l'échelle du proteome sanguine humain, et que les résultats de ces analyses pouvaient permettre d'identifier des cibles thérapeutiques potentielles pour la PA. Nos résultats ont non seulement confirmé des associations connues entre certains genes et la PA, mais également mis en évidence de nouveaux gènes potentiellement impliqués dans la maladie. Nous avons également pu identifier plusieurs protéines sanguines causalement impliquées dans la pathophysiologie de la PA dont plusieurs sont des cibles thérapeutiques potentielles pour la PA. En outre, nous avons identifié des médicaments ciblant ces protéines, dont l'effet est cohérent avec celui obtenu grâce aux analyses de randomisation mendélienne et qui pourraient être réutilisés dans le cadre de la prevention ou du traitement de la PA. / Acute pancreatitis (AP) is the leading cause of hospital admissions related to gastrointestinal disorders worldwide, and its prevalence is increasing. AP is associated with several comorbidities whose global prevalence is also increasing, such as metabolic syndrome and type 2 diabetes. Despite this, its genetic architecture remains poorly characterized and few or no therapeutic options currently exist for its prevention or his treatment. Our hypothesis was that it is possible to identify novel genes associated with AP using genome-wide association studies and to identify circulating proteins associated with AP using blood proteome-wide Mendelian randomization, and that the results of these analyzes could help identify potential therapeutic targets for AP. Our results not only confirmed known associations between known genes and AP, but also highlighted new genes potentially involved in the disease. We were also able to identify several blood proteins causally involved in the pathophysiology of AP, several of which are potential therapeutic targets for AP. In addition, we identified drugs target those proteins, whose effect is consistent with that obtained through Mendelian randomization analyzes and which could be reused in the context of the prevention or treatment of AP.

La protéine MDM2 lie la protéine suppresseur de tumeur p53 avec une grande affinité et module négativement son activité. Les Nutlins peuvent lier MDM2 en bloquant le compartiment de liaison pour p53 et ainsi activer la voie de p53 dans les cellules cancéreuses, menant à l'arrêt du cycle cellulaire et à l'apoptose. L'effet cytotoxique de la Nutlin a été confirmé dans différentes lignées tumorales du colon (HCT-116) portant un gène p53 sauvage, tandis qu'aucun effet n'est observé dans les cellules p53-/-. La Nutlin révèle un effet d'inhibiteur intermédiaire dans le clone HCT-116 p21-/-. Des analyses par FACS indiquent que la surexpression de p21 médiée par p53 active les voies pro-apoptotiques, tandis que l'action p21-indépendante du suppresseur de tumeur p53 détermine la mort cellulaire via la nécrose. La plupart des lignées cancéreuses traitées avec la Nutlin subissent un arrêt du cycle cellulaire en phases G1+G2. Cependant, un des clones HCT-116 montre un arrêt en phase G1. Des analyses par microarray ont été exécutées afin d'élucider les mécanismes moléculaires de l'action antiproliférative et cytotoxique de la Nutlin. Différents gènes impliqués dans le contrôle du cycle cellulaire et la prolifération cellulaire sont sous-exprimés, alors que certains gènes de la voie pro-apoptotique p53 sont sur-exprimés. La comparaison de l'expression génique des cellules HCT-116 bloquant en G1+G2 avec celles bloquant en G1 a indiqué une implication possible de plusieurs gènes régulateurs du cycle cellulaire. Nos résultats confirment le fort potentiel thérapeutique de la Nutlin pour les tumeurs préservant une p53 de type sauvage.