Une étude précédente visant à mieux comprendre le rôle et le contexte cellulaire dans lequel la ribonucléase Dicer (Dcrl) évolue nous a permis d'identifier des protéines pouvant être régulées par un mécanisme post-transcriptionnel impliquant Dcrl et la voie de l'interférence à l'ARN (iARN) chez Schizosaccharomyces pombe. Parmi ces protéines se trouvaient trois enzymes impliquées dans la voie de la glycolyse. Nous avons tenté de caractériser le mécanisme et l'implication fonctionnelle de leur régulation en effectuant des expériences de FACS combinées à l'utilisation d'un système de gène rapporteur basé sur la « Green fluorescent protein » et en effectuant des tests de croissance, respectivement. La régulation de la voie de la glycolyse ne semble pas nécessaire à la croissance des levures, ce qui suggère la présence de mécanismes compensatoires. L'étude précédente nous avait également permis d'identifier la protéine ribosomale L12 comme interacteur potentiel de Dcrl pouvant être impliqué dans sa régulation. Nous avons tenté de comprendre le rôle de L12 dans cette régulation en confirmant son interaction avec Dcrl et en caractérisant l'aspect fonctionnel de cette interaction en produisant des lignées délétionnelles de L12. La localisation intracellulaire de la protéine L12 nous permet de croire qu'elle pourrait amener Dcrl dans des structures spécifiques du cytosol, où elle pourrait jouer un rôle dans la régulation génique post-transcriptionnelle. Ce rôle demande toutefois à être confirmé.

Lors d'études antérieures, l'analyse du transcriptome des cellules micro gliales à l'aide de micropuces à ADN nous a permis d'identifier le récepteur transmembranaire GPR84. Dans la présente étude, nous avons testé l 'hypothèse que la transcription du GPR84 est augmentée dans la microglie durant l'inflammation. Plus précisément, nous avons étudié la régulation du GPR84 dans le cerveau durant une endotoxinémie et une encéphalomyélite autoimmune expérimentale (EAB) . Nos résultats ont montré une augmentation de l'expression du GPR84 au cours de ces deux conditions inflammatoires, et ce uniquement dans la microglie. Nous avons ensuite tenté d'identifier le rôle du GPR84 en testant l 'hypothèse selon laquelle ce récepteur modulerait le développement des symptômes dûs à l'inflammation. À l'aide de souris déficientes en GPR84, nous avons évalué l'influence de ce récepteur durant une EAB, une endotoxinémie et une encéphalite induite par le virus de l 'herpès simplex de type 1. Nous n'avons observé aucune influence du GPR84 dans ces modèles. Nous concluons que le GPR84 est exprimé non spécifiquement dans plusieurs conditions neuroinflammatoires, mais qu'il n'y exerce pas toujours un effet significatif et que son rôle reste inconnu.

Le genre Leishmania regroupe des parasites protozoaires transmis par piqûre d’un insecte vecteur et qui sont responsables des leishmanioses. Le cycle de Leishmania alterne entre promastigotes dans l’appareil digestif de l’insecte et amastigotes dans les phagolysosomes des macrophages d’un hôte mammifère. Les delta-amastines sont une famille de protéines membranaires qui jouent potentiellement un rôle dans la virulence. L’expression exclusivement au stade intracellulaire de l’un de ces gènes est permise par une accumulation préférentielle de l’ARNm et la stimulation de la traduction, toutes deux chez les amastigotes. L’objectif de cette thèse est de caractériser les mécanismes permettant l’expression différentielle de l’ARNm de la delta-amastine. Ces organismes ont divergé rapidement des autres eucaryotes, ce qui engendre plusieurs différences fonctionnelles, dont notamment l’absence de régulation transcriptionnelle. Notre hypothèse est que la présence d’une région riche en uridines (URE) dans l’extrémité 3’ non traduite (3’UTR) du transcrit peut être impliquée dans la dégradation de l’ARNm. Nous démontrons que le URE est responsable d’une dégradation du transcrit au stade promastigote, par un phénomène indépendant de la déadénylation. Nous avons identifié une protéine à domaine Alba, LiAlba20, liant l’ARNm de la delta-amastine dans une région proche de l’URE. La suppression de cette protéine réduit l’accumulation du transcrit au stade amastigote. Ainsi, deux mécanismes complémentaires sont responsables de l’expression différentielle de ce transcrit. Le génome de Leishmania code pour une seconde protéine à domaine Alba, LiAlba13. Ces protéines interagissent ensemble, mais LiAlba13 n’affecte pas l’abondance de l’ARNm de la delta-amastine. Les protéines Alba ont une évolution exceptionnelle puisqu’elles stabilisent l’ADN chez les Archaea, et sont retrouvées dans les complexes RNase P/MRP chez les eucaryotes supérieurs. Nos résultats montrent qu’elles régulent l’expression de protéines spécifiques du stade amastigote, ce qui concorde avec les récents travaux chez d’autres parasites protozoaires. Ces protéines sont cytoplasmiques dans les deux stades de développement. Cependant, pendant la différenciation, elles s’accumulent dans le flagelle et le nucléole, respectivement décrits comme senseur et coordinateur de la réponse au stress. Nos travaux suggèrent donc l’implication du flagelle et du nucléole dans la coordination de la régulation de facteurs de virulence pendant la différenciation du parasite. / The Leishmania genus encompasses protozoan parasites which are transmitted through the bite of an insect vector and are responsible for leishmaniasis. The Leishmania life cycle alternates between promastigote forms within the gut of the insect vector and amastigotes which multiply in the phagolysosomal vacuoles of the mammalian host’s macrophages. Delta-amastins are part of a multigenic family of membrane proteins that potentially act in parasite virulence. One of the delta-amastin's exclusive expression in the intracellular stage is mediated by mRNA accumulation and translation stimulation, both taking place in the amastigote stage. The aim of this thesis is to characterize the mechanisms implicated in the differential expression of delta-amastin mRNA. Leishmania splits early in evolution from other eukaryotes and this split correlates with many functional differences, including the absence of transcriptional control of gene expression. Our hypothesis is that the presence of a uridine-rich element (URE) within the 3’ untranslated region (3’UTR) of the transcript might be implicated in an mRNA decay mechanism. We reveal that the URE is responsible for a fast mRNA decay only in the promastigote stage, performed by an unusual deadenylation-independent pathway. We next identified an Alba domain protein, LiAlba20, which binds to the delta-amastin mRNA in a region flanking the URE. Depletion of this protein leads to a reduced mRNA accumulation in the amastigote stage specifically. Therefore, we identified two complementary mechanisms taking part in the transcript’s differential expression. The Leishmania genome encodes a second Alba domain protein, LiAlba13. These proteins interact together, but LiAlba13 does not affect the delta-amastin mRNA level during the parasite life cycle. Alba domain proteins have a remarkable evolution, being involved in DNA stabilization in Archaea and subunits of the RNAses P/MRP complexes in higher eukaryotes. In addition, our data show that these proteins regulate stage-specific protein expression, which is in agreement with recent works in other protozoan parasites. Alba domain proteins are constitutively expressed in the cytoplasm of both parasite life cycle stages. Nevertheless, during the differentiation, those proteins accumulate in flagellar and nucleolus compartments, respectively described as sensor and stress response coordinators in higher eukaryotes. Our work suggests that the flagellum is implicated in the coordination of stage-specific transcript expression in response to stress in Leishmania.

L’anémie de Fanconi (AF) est une maladie récessive rare associée à un défaut dans la voie de réparation des cassures double-brin de l’ADN causées par des agents pontants (voie de l’AF). Ces agents pontant l’ADN créent un lien covalent entre les deux brins et bloquent les polymérases lors de la réplication ou de la transcription. Mon projet s’intéresse à une protéine importante de la voie de l’AF : FANCI. Celle-ci est décrite comme agissant de pair avec la protéine FANCD2 pour recruter la machinerie de réparation de l’ADN. Nous posons l’hypothèse que FANCI a un rôle important lors du développement, lors de la méiose et est impliquée dans la résistance des cellules aux aldéhydes. Suite à la création d’un modèle murin déplété en FANCI, nous avons effectué des essais comportementaux de mémoire ou d’anxiété pour caractériser le modèle plus en profondeur. Ensuite, des résultats de coupes histologiques de gonades ont mené à la confirmation de la stérilité des souris KO. Plus spécifiquement, un étalage de chromosomes méiotiques et une immunofluorescence ont été effectués pour vérifier la localisation de FANCI sur ces derniers. De plus, le traitement à la mitomycine C (agent pontant) de cellules embryoniques conférant une instabilité génomique, nous avons voulu tester l’effet d’une source endogène, les aldéhydes, sur des cellules déplétées en FANCI. Nous avons observé les foyers des protéines 53BP1 et γ-H2AX pour vérifier l’accumulation de cassures double-brin. Les essais comportementaux montrent une tendance non significative. Une co-localisation de FANCI avec le marqueur de résection RPA est observée. De plus, la déplétion de FANCI rend les cellules résistantes aux aldéhydes. Les foyers 53BP1 et γ-H2AX montrent qu’une petite population de ces mêmes cellules a un nombre très élevé de dommages à l’ADN alors que d’autres ont un niveau de dommages similaire au contrôle. / Fanconi anemia (FA) is a rare recessive disease associated with a defect in the pathway of DNA double strand breaks repair (FA pathway). These double stranded breaks are caused by crosslinking agents by creating a covalent bond between the two opposite strands and blocking polymerases during DNA replication or transcription. My project’s principal interest is a major protein it this pathway : the FANCI protein. It is described as acting together with FANCD2 protein to recruit DNA repair machinery. We hypothesised that FANCI has an important role in development, in meiosis and that it is implicated in cells’ aldehydes resistance. After the creation of a mouse model depleted in FANCI, with did anxiety and memory behavior tests to deeply characterize our mouse model. Also, results of gonad histologic cuts confirmed mouse sterility. More specifically, we did a meiotic spread and immunofluorescence to see FANCI on meiotic chromosomes. We also treated embryonic fibroblasts with mitomycin C, an exogenous crosslinking agent, and then wanted to check with an endogenous source, like aldehydes, on FANCI depleted human cells. We also observed 53BP1 and γ-H2AX foci formation to check for double strand break accumulation. Behavior tests do not show any significative tendancy. We observe a colocalization between FANCI and the resection marker RPA. Moreover, FANCI depletion gives an aldehyde resistance to cells. 53BP1 and γ-H2AX foci show a population of cells with a very high level of foci and others that have the same amount of foci as the control cells.

Le syndrome de Werner est caractérisé par un vieillissement prématuré. Au niveau cellulaire, nous observons une instabilité chromosomique importante et une sénescence accélérée comparé à des cellules normales. Le gène muté (WRN) responsable de ce syndrome code pour une protéine possédant un domaine exonuclease et hélicase à ADN impliqués dans la replication de l'ADN, la réparation et la transcription. Toutefois, nous ne savons toujours pas laquelle de ses fonctions est responsable du vieillissement prématuré. Nous pensons que l'identification de nouvelles protéines interagissant directement avec la protéine WRN pourrait nous donner des réponses. Des analyses par spectrométrie de masse sur 1'immunoprecipitation de la protéine WRN ont permis d'identifier la protéine ribosomale RPS3 et plusieurs autres comme nouveaux partenaires potentiels. Plusieurs approches biochimiques furent utilisées afin de confirmer l'interaction directe entre WRN et RPS3. Nous avons démontré que RPS3 interagit directement avec la protéine WRN in vitro. Des études additionnelles sont requises pour comprendre la fonction de ce complexe in vivo.

La neurocalcine delta (NCd) fait partie d'une petite famille de protéines appelées ± neuroprotéines sensibles au calcium ¿. Dans la rétine, la NCd est exprimée dans les cellules ganglionnaires et amacrines. La NCd est composée de 4 motifs EF-hand dont 3 ont la capacité de lier le calcium. La liaison du calcium par la NCd mène à un changement de conformation et à l'extrusion du groupement myristoyle ainsi que certains acides aminés hydrophobes. Ce mécanisme, appelé calcium myristoyl switch, semble impliqué dans sa liaison membranaire. Le mécanisme de liaison membranaire de la NCd est seulement partiellement élucidé. Cette étude a donc pour objectif de déterminer les paramètres responsables de la liaison membranaire de la NCd. Pour ce faire, nous avons utilisé le modèle membranaire des monocouches. Ce système modèle pour les membranes a permis de déterminer la pression maximale d'insertion de la NCd lorsqu'elle est injectée dans la sous-phase de monocouches de différents phospholipides.

La leishmaniose est une maladie causée par des parasites appartenant au genre Leishmania. Elle est transmise à l'homme par la piqûre d'un insecte vecteur et est endémique dans plus de 88 pays où approximativement 350 millions de personnes vivent dans les zones à risque. À ce jour, aucun vaccin efficace n'est encore disponible pour prévenir la leishmaniose et le traitement repose actuellement sur la chimiothérapie. Les composés utilisés pour traiter la maladie sont limités et la plupart d'entre eux sont associés à des problèmes comme le coût élevé du traitement, les effets secondaires et l'émergence de souches de parasites résistantes aux médicaments. L'identification de nouvelles cibles thérapeutiques pour le développement de molécules anti-Leishmania s'avère donc urgente. La voie métabolique de l'acide folique constitue un champ thérapeutique potentiel d'autant plus que la découverte chez Leishmania de 13 protéines appartenant à la famille de transporteurs de folate et de la bioptérine (FBT) permet d'envisager la possibilité de les exploiter dans un but thérapeutique. Mis à part trois (FT1, FT5 et BT1), les fonctions des autres protéines de la famille FBT sont inconnues et mon projet de doctorat avait comme objectif principal de caractériser cette famille et de tenter de trouver des fonctions à ces transporteurs. Les objectifs spécifiques de cette thèse étaient 1) de déterminer le profil d'expression des gènes de la famille FBT aux différentes phases de croissance chez les deux stades de vie du parasite et chez des mutants résistants au methotrexate (MTX); 2) de caractériser la fonction d'un nouveau membre de la famille FBT qui était réarrangé chez des mutants résistants à la sinéfungine (SNF); et 3) d'étudier la localisation subcellulaire des différents membres de la famille FBT et de quelques protéines de la famille des transporteurs mitochondriaux (MCF) dans le but d'identifier et de caractériser les transporteurs de donneurs d'unités monocarbonées, localisés au niveau de la membrane de la mitochondrie. L'analyse du profil d'expression de la famille FBT a permis de montrer que plusieurs gènes FBT sont exprimés préférentiellement en phase stationnaire de croissance, tandis que seul FT1, le principal transporteur de folate, est exprimé préférentiellement en Ill phase logarithmique de croissance ce qui est en accord avec la forte accumulation de folate durant cette phase de croissance. Aussi, il semblerait que les niveaux d'expression de FT1 dépendent aussi des niveaux de folate dans le milieu de culture. De plus, cette analyse a permis d'identifier les mécanismes de recombinaison génique impliqués dans l'inactivation de FT1 chez les souches hautement résistantes au MTX. Par ailleurs, la sélection des mutants résistants au MTX et à la SNF a permis de caractériser un nouveau membre (AdoMetTl) de la famille FBT. L'AdoMetTl correspond au transporteur de haute affinité pour la S-adénosylméthionine. Finalement, les études de localisation protéique ont permis de déterminer la localisation intracellulaire de trois protéines FBT ainsi que la localisation mitochondriale des protéines de la MCF. transmise à l'homme par la piqûre d'un insecte vecteur et est endémique dans plus de 88 pays où approximativement 350 millions de personnes vivent dans les zones à risque. À ce jour, aucun vaccin efficace n'est encore disponible pour prévenir la leishmaniose et le traitement repose actuellement sur la chimiothérapie. Les composés utilisés pour traiter la maladie sont limités et la plupart d'entre eux sont associés à des problèmes comme le coût élevé du traitement, les effets secondaires et l'émergence de souches de parasites résistantes aux médicaments. L'identification de nouvelles cibles thérapeutiques pour le développement de molécules anti-Leishmania s'avère donc urgente. La voie métabolique de l'acide folique constitue un champ thérapeutique potentiel d'autant plus que la découverte chez Leishmania de 13 protéines appartenant à la famille de transporteurs de folate et de la bioptérine (FBT) permet d'envisager la possibilité de les exploiter dans un but thérapeutique. Mis à part trois (FT1, FT5 et BT1), les fonctions des autres protéines de la famille FBT sont inconnues et mon projet de doctorat avait comme objectif principal de caractériser cette famille et de tenter de trouver des fonctions à ces transporteurs. Les objectifs spécifiques de cette thèse étaient 1) de déterminer le profil d'expression des gènes de la famille FBT aux différentes phases de croissance chez les deux stades de vie du parasite et chez des mutants résistants au methotrexate (MTX); 2) de caractériser la fonction d'un nouveau membre de la famille FBT qui était réarrangé chez des mutants résistants à la sinéfungine (SNF); et 3) d'étudier la localisation subcellulaire des différents membres de la famille FBT et de quelques protéines de la famille des transporteurs mitochondriaux (MCF) dans le but d'identifier et de caractériser les transporteurs de donneurs d'unités monocarbonées, localisés au niveau de la membrane de la mitochondrie. L'analyse du profil d'expression de la famille FBT a permis de montrer que plusieurs gènes FBT sont exprimés préférentiellement en phase stationnaire de croissance, tandis que seul FT1, le principal transporteur de folate, est exprimé préférentiellement en phase logarithmique de croissance ce qui est en accord avec la forte accumulation de folate durant cette phase de croissance. Aussi, il semblerait que les niveaux d'expression de FT1 dépendent aussi des niveaux de folate dans le milieu de culture. De plus, cette analyse a permis d'identifier les mécanismes de recombinaison génique impliqués dans l'inactivation de FT1 chez les souches hautement résistantes au MTX. Par ailleurs, la sélection des mutants résistants au MTX et à la SNF a permis de caractériser un nouveau membre (AdoMetTl) de la famille FBT. L'AdoMetTl correspond au transporteur de haute affinité pour la S-adénosylméthionine. Finalement, les études de localisation protéique ont permis de déterminer la localisation intracellulaire de trois protéines FBT ainsi que la localisation mitochondriale des protéines de la MCF.

Streptococcus thermophilus est la seconde bactérie lactique la plus utilisée en transformation laitière. Comme toutes les bactéries, elle peut être infectée par des virus appelés bactériophages ou phages. Les phages représentent un risque significatif en transformation laitière puisqu'ils sont ubiquitaires et peuvent mener à des produits fermentés de qualité inférieure. L'étude de la biologie des phages lactiques et de leurs mécanismes de réplication est nécessaire à la prévention et au contrôle de leur prolifération dans les procédés industriels. En général, les gènes viraux qui sont exprimés dès le début de l'infection sont les plus susceptibles d'encoder des protéines qui interagissent avec des composantes de la bactérie. Chez le phage 2972, plus de la moitié de ces gènes dits précoces n'ont pas de fonction connue. Le principal objectif de cette maîtrise était donc de débuter la caractérisation des protéines virales encodées par certains de ces gènes. Puisque la nature du ou des partenaires d'interaction d'une protéine est souvent directement liée à la fonction de cette dernière, nous avons travaillé au développement de méthodes servant à investiguer les interactions protéine-protéine entre le phage 2972 et sa souche hôte S. thermophilus DGCC7710. Les méthodes adaptées sont basées sur la purification d'affinité avec les étiquettes de type Strep-III® ou s'inspirent de la méthode du BioID. Pour la réalisation de certaines approches, le phage 2972 a dû être modifié génétiquement à l'aide du système CRISPR-Cas de type II-A naturellement présent chez sa bactérie hôte. La caractérisation de quelques-uns de ces phages modifiés génétiquement nous a permis de vérifier ou de formuler des hypothèses qui concernent les relations phage-hôte et la résistance aux phages chez S. thermophilus. L'extraction du protéome bactérien est une étape importante dans l'étude des interactions protéine-protéine. La lyse de notre bactérie modèle, soit DGCC7710, a représenté un défi inattendu dans le développement de notre méthode. En effet, cette bactérie à Gram positif s'est avérée résistante à plusieurs techniques standard de lyse. Toutefois, nous avons démontré que les endolysines, des enzymes utilisées par les phages pour lyser la bactérie en fin d'infection, peuvent être purifiées et utilisées pour la lyse de la souche DGCC7710. Finalement, nous avons travaillé à résoudre la structure de différentes protéines de fonction inconnue du phage 2972 par cristallographie à rayons X. Bien que la structure d'aucune des protéines à l'étude n'ait encore été résolue, nos essais laissent croire qu'une protéine précoce de 2972 interagit avec des acides nucléiques. / Streptococcus thermophilus is one of the most widely used bacterium in the dairy transformation industry. This bacterium is primarily used in the production of yogurt and speciality cheeses such as mozzarella. Like all bacteria, strains of S. thermophilus can be infected by bacterial viruses commonly known as bacteriophages or phages. Phages are ubiquitous and represent a significant risk for the dairy industry as they can greatly impact the quality of fermented dairy products. The study of phage biology is crucial for the development of efficient phage control methods in dairy factories. In general, early expressed phage genes encode viral proteins that are the most likely to interact with host molecules. More than half of such early expressed genes encode proteins of unknown function in lactic phage 2972. The main objective of this thesis was to investigate the function of some of these viral proteins. Because the nature of the binding partner of a given protein often reflects its function, we are developing methods based on affinity purification for the study of protein-protein interactions between the phage 2972 and its host S. thermophilus DGCC7710. Our methods are based on affinity purification with Strep-III® tags or inspired from BioID. In order to achieve some of our objectives, we genetically modified the genome of phage 2972 using the endogenous type II-A CRISPR-Cas system of DGCC7710. The characterization of some of these genetically modified phages gave us insights on phage-host relationships and phage resistance in S. thermophilus. In developing our methods, the proteome extraction of S. thermophilus cells were surprisingly challenging. Indeed, this Gram-positive bacterium was resistant to many standard lysis techniques. Here, we show that purified phage endolysins are very efficient in lysing the strain DGCC7710. Endolysins are phage enzymes that lyse their bacterial host at the end of the phage lytic cycle. Finally, we worked on solving the structure of different proteins of unknown function encoded in the genome of phage 2972 by X-ray crystallography. While we have yet to solve any structure, we observed that one of the early-expressed protein of phage 2972 interacts with nucleic acids.

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Le parasite protozoaire Leishmania possède un cycle de vie dimorphique; le stade promastigote présent chez l'insecte vecteur et le stade amastigote présent dans les phagolysosomes des macrophages de l'hôte vertébré. L'étude des gènes exprimés préférentiellement ou spécifiquement au stade intracellulaire pourrait nous en apprendre d'avantage sur les mécanismes de survie du parasite à l'intérieur des macrophages. Parmi les gènes exprimés préférentiellement au stade amastigote nous avons identifié la famille des amastines qui codent pour des protéines de surface. Cette famille est présente chez plusieurs espèces de Leishmania où on retrouve en moyenne 50 membres. Toutes les amastines possèdent une séquence signature de 11 acides aminés qui leur est unique. La majorité des amastines sont plus abondantes au stade amastigote et cette régulation implique des séquences situées en 3'UTR. La comparaison des génomes de deux espèces de Leishmania causant des pathologies distinctes, soit L. major et L. infantum a révélé une grande conservation au niveau de la synténie du génome. Cela suggère que ce qui est responsable de chaque pathologie se situe au niveau des quelques gènes uniques à chaque espèce ou encore au niveau de l'expression différentielle des gènes communs. Pour identifier de nouveaux gènes exprimés au stade intracellulaire et également identifier des gènes impliqués dans le tropisme, une analyse du transcriptome entier a été effectuée à l'aide de la technologie de puces à ADN. Lors de cette étude, où des parasites intracellulaires ont été utilisés, les résultats ont montré que chez L. infantum, 7.1 % des gènes étaient différemment exprimés entre les deux stades tandis que 9.3% l'étaient chez L. major. Parmi ces gènes modulés très peu (=10%) sont communs aux deux espèces. Une expérience indépendante avec les puces a été réalisée avec des parasites axéniques de L. infantum, pour comparer les deux stades de développement mais aussi pour évaluer la pertinence du système de culture axénique pour les amastigotes par rapport aux amastigotes obtenus de macrophages ou d'animaux infectés. Cette expérience a révélé que 12.8% des gènes étaient modulés entre les deux stades et que parmi ces gènes très peu étaient en commun avec ceux identifiés chez les amastigotes intracellulaires.