Des études cliniques ont montré que l'hypoxie corrèle avec un mauvais pronostic dans plusieurs types de tumeurs solides. L'hypoxie active plusieurs gènes impliqués dans l'angiogenèse qui contribue à nourrir la tumeur et, dans certains cas, déclenche le processus métastasique. MTF-1 est un facteur de transcription qui est activé par plusieurs facteurs de stress dont fait partie l'hypoxie. MTF-1 a surtout été étudié pour son activation en réponse aux métaux parce qu' il a été découvert pour son rôle essentiel dans l'activation des gènes des Métallothionéines (MT) en réponse aux ions de métaux de transition. Le modèle d'activation de MTF-1 en réponse aux métaux est le suivant: MTF-1 est une protéine à doigts de zinc qui se lie à l'ADN. MTF-1 subit ensuite des événements de phosphorylation qui lui permettent d' activer la transcription des gènes des MT. Quant à l'activation de MTF-1 en réponse à l 'hypoxie, aucun mécanisme n'est connu. Il faut donc se référer à un mécanisme connu d'activation d'un autre facteur de transcription activé par l'hypoxie, RIF-1. L' activation de RIF -1 par l 'hypoxie passe par un mécanisme de dégradation/stabilisation impliquant les hydroxylases. Nous avons d'abord confirmé -que les MT sont induites en hypoxie et que cette induction passe par MTF-1 et les séquences MRE. Nous avons montré que MTF-1 n'est pas stabilisé en hypoxie, donc que les mécanismes d'activation de MTF-1 diffèrent de ceux activant RIF -1 u. Cependant, nous avons montré que les hydroxylases sont impliquées dans l'activation de MTF-1 en hypoxie, de même que le stress oxydant. En se référant au modèlè d'activation de MTF-1 en réponse aux métaux, nous avons aussi montré que des événements de phosphorylation impliquant les kinases JNK, PI3K et PKC sont cruciaux pour l'activation de MTF-1 par l'hypoxie. Finalement, nous avons montré que MTF-1 et RIF-1α entretiennent une relation de coopération pour l'induction de leur activité transcriptionnelle en réponse à l 'hypoxie. Compte tenu des nombreux rôles tenus par MTF-1, une meilleure compréhension des mécanismes gouvernant son activation permettra ultimement de développer des stratégies thérapeutiques pour lutter contre l'angiogenèse et la progression tumorale. / [MTF-1 : Facteur de transcription de la régulation par les métaux = Metal-regulatory transcription factor-1].

Les membres de la famille des GAT A sont des facteurs de transcription à doigt de zinc exprimés dans une grande variété de tissus. Les facteurs GAT A jouent des rôles essentiels dans l 'hématopoïèse, le développement cardiaque et la formation de l'endoderme et des gonades. La régulation de ces divers processus biologiques par les facteurs GA T A dans différents tissus, incluant le testicule, ne peut se faire sans l'aide d' autres partenaires. Mes travaux de thèse avaient donc pour but d' étudier l'expression et l' implication de partenaires transcriptionnels qui pourraient moduler l'activité des facteurs GA TA et conséquemment l'expression de gènes testiculaires. Des analyses de types hybridation in situ et d'immunohistochimie ont permis de mettre en évidence la présence du messager et de la protéine des cofacteurs Friend of GAT A (FOG) 1 et FOG2 tout au long du développement testiculaire .. Des transfections transitoires in vitro ont ensuite permis de constater que l'interaction physique entre les protéines FOG et les facteurs de transcription GA TA résulte en une inhibition de l'activité de promoteurs testiculaires régulés par les facteurs GA TA. Ainsi, les partenaires FOG seraient des répresseurs de l'activité des facteurs GA TA dans le testicule. Un nouveau partenaire pour les facteurs GATA, le récepteur nucléaire LRH-I/NR5A2, a aussi été identifié. J' ai montré qu'il interagit directement avec les facteurs GAT A4 et GAT A6 et que cette interaction se traduit par une synergie transcriptionnelle sur les gènes lnha et Cyp19al codant pour la sous-unité a de l'inhibine et l'enzyme stéroïdogénique aromatase respectivement. Les modifications posttraductionnelles sont d'autres moyens utilisés par la cellule pour moduler l'activité d'un facteur de transcription sur un gène. Notre laboratoire a montré que la phosphorylation du facteur GAT A4 par la protéine kinase A (PKA), en réponse à l' activation de la voie de signalisation de l' AMPc, augmente son activité transcriptionnelle sur le promoteur Star. Mes travaux ont révélé que la phosphorylation de GAT A4 et GATA6 par PKA permet aussi une stimulation accrue des promoteurs lnha et Cyp19al. 111 En somme, la présence des partenaires FOG 1, FOG2 et LRHl/NR5A2 dans le testicule de même que des modifications posttraductionnelles de type phosphorylation modulent le potentiel de transactivation des facteurs GA TA sur des promoteurs testiculaires. Ceci suggère que les facteurs de transcription GATA et leurs partenaires sont d'importants régulateurs du développement et de la fonction testiculaire.

Les bases moléculaires de l’initiation et de la progression du cancer ovarien épithélial (COE) sont pauvrement comprises. Un élément pathogénique clé dans le cancer est l’inactivation de gènes suppresseurs de tumeurs, fréquemment due à l’hyperméthylation de leur région promotrice. Dans ce contexte, nous avons utilisé une approche épigénomique pour trouver des gènes hyperméthylés dans le COE. Nous avons employé un agent déméthylant, 5-aza-dC, pour réactiver les gènes hyperméthylés dans quatre lignées cellulaires du COE (SKOV3, OVCAR3, TOV112 et TOV21). Nous avons trouvé plusieurs cibles potentielles d’hyperméthylation qui pourraient jouer un rôle fonctionnel dans la suppression tumorale, l’apoptose ou la réparation de l’ADN. Nous avons évalué leur statut de méthylation par MSP (methylation-specific PCR) et BSP (bisulfite-sequencing PCR) avec des échantillons normaux et tumoraux et deux lignées cellulaires du COE. Parmi ces cibles, le gène DOK1 a démontré une évidence de méthylation de la région promotrice des échantillons tumoraux comparativement à celle de ceux qui sont normaux. Des clones surexprimant et d’autres sous-exprimant DOK1 ont été construits et validés. Son rôle potentiel dans la prolifération cellulaire, dans la sensibilité au taxol et au cisplatin, et dans le cycle cellulaire a été évalué par des études fonctionnelles et une légère implication a été détectée dans ces fonctions. Les changements d’expressions globales reliés à l’expression de ce gène ont également été analysés par la technologie de micropuces de l’ADN. Nos données montrent que DOK1 est touché par une hyperméthylation de sa région promotrice potentielle dans les tumeurs du COE. Par contre, cette hyperméthylation ne semble pas influencer son niveau d'expression. Au contraire, son expression augmente dans le cancer ovarien. Cette augmentation serait reliée à une diminution des risques de progression du COE. Cette observation confirme le rôle potentiel de suppresseur de tumeur de DOK1 dans le COE. / The molecular basis of the epithelial ovarian cancer (EOC) initiation and progression are still poorly understood. A key pathogenic element in cancer is the inactivation of tumours suppressor genes, frequently due to the hypermethylation of their promoter sequence. In this context, we used an epigenomic approach to identify hypermethylated genes in the EOC. We used the demethylating agent, 5-aza-dC, to reactivate hypermethylated genes in four cells lines of EOC (SKOV3, OVCAR3, TOV112 and TOV21). We identified several targets genes potentially hypermethylated that could play a functional role in ovarian tumorigenesis suppression, apoptosis or DNA repair. We evaluated their methylation status by MSP (methylation-specific PCR) and BSP (bisulfite-sequencing PCR) within normal and tumoral ovarian samples and in two EOC cells lines. Among these targets, the DOK1 gene showed an evidence of methylation of the promoter region in the tumour samples compared to the normal ones. Clones over-expressing and others under-expressing DOK1 were built and validated. The potential role of this gene in cellular proliferation, sensitivity to taxol and cisplatin, and in the cell cycle was evaluated by functional studies and a little implication of the DOK1 gene was detected in these functions. The global expression changes connected to the expression of the DOK1 gene were also analyzed by the microarray genomics technology. Our data show that DOK1 is affected by hypermethylation of its potential promoter region in EOC tumors. This hypermethylation do seems not to influence its expression levels. On the contrary, its expression level increases in ovarian cancer. This increase would be connected to a reduction in the risks of progression of the COE. Moreover, this observation confirms the potential role of DOK1 as tumor suppressor in EOC.

D'après notre stratégie de clonage, nous avons obtenu des protéines recombinantes dérivées de la PARP-1 correspondantes au premier doigt de Zn (Znl), au deuxième doigt de Zn (Zn2), au troisième doigt de Zn (Zn3), au domaine DB-WRG-CAT et au domaine WRG-CAT. Pour démontrer que Znl et Zn2 interagissent avec l'ADN simple brin nous avons utilisé des essais de retard sur gel (EMSA). Nos résultats suggèrent que Znl et Zn2 ont la capacité de se lier à l'ADN simple brin avec une haute préférence pour poly (dA), poly (T) et poly (dC). Parmi les sondes d'ADN simple brin, Zn3 a montré une affinité pour poly(T), poly(dG) et poly(dC). Remarquablement, Zn3 a montré une forte Uaison aux sondes d'ARN. Ce résultat nous pennet de suggérer un rôle de Zn3 dans le processus de transcription. L'enzyme pourrait être en contact avec des hybrides ARN-ADN lors de ce processus. Cependant le rôle précis de Zn3 reste encore à établir. Les doigts de Znl, Zn2 et Zn3 ainsi que le fragment WGR-CAT n'ont montré aucune affinité pour l'ADN double brin. Par ailleurs, nous avons clone une région de 60 acides aminés situés entre le domaine BRCT et le domaine WRG de la protéine PARP-1; nous l'avons baptisée région DB. Le fragment DB-WRG-CAT a montré une forte affinité par l'ADN double brin. Ce résultat suggère que la région DB est responsable de l'interaction de la protéine PARP-1 avec l'ADN double brin. Pour déterminer si la PARP-1 se lie à une structure de l'ADN simple brin et double brin, et pour démontrer si cette interaction est capable d'activer l'enzyme, nous avons construit différentes structures d'ADN qui comportent une boucle d'adénine ou de thymidine. Nos résultats suggèrent que l'ADN qui comporte une jonction entre simple et double brin agit comme un activateur potentiel de la PARP-1. Finalement, nous proposons un modèle qui pennet de comprendre l'interaction de la PARP-1 avec l'ADN qui est retrouvé dans plusieurs processus biologiques.

L'hypertension pulmonaire (HP) est une pathologie létale caractérisée par des pressions pulmonaires anormalement élevées. Parmi les cinq groupes d'HP existants, classés selon leurs caractéristiques cliniques, je me suis centrée sur l'HP de groupe 1 : l'hypertension artérielle pulmonaire (HTAP). L'HTAP se définit hémodynamiquement par une pression artérielle pulmonaire moyenne (PAPm) supérieure à 20 mmHg, des résistances vasculaires pulmonaires (RVP) supérieures à 3 unités de Wood (UW), et une pression artérielle pulmonaire d'occlusion (PAPO) inférieure à 15 mmHg. Histologiquement, l'HTAP résulte d'une vasoconstriction excessive et d'un remodelage anormal des artères pulmonaires distales. Enfin, au niveau cellulaire, l'HTAP est associé à un comportement pro-prolifératif et à une résistance à l'apoptose des cellules musculaires lisses et des cellules endothéliales. L'étiologie de l'HTAP est complexe et encore imparfaitement connue. Nous pouvons distinguer les HTAP idiopathiques, héréditaires, ou bien celles associées à des connectivites. Des mutations peuvent également être à l'origine du développement d'une HTAP. La mutation la plus représentée en HTAP est la mutation BMPR2, observée chez 70-75 % des patients présentant une HTAP héréditaire et chez 20-25 % des patients ayant une HTAP idiopathique. La pénétrance de l'HTAP causée par une mutation *BMPR2* reste néanmoins faible (20 à 30 %), ce qui laisse penser que d'autres facteurs, génétiques et/ou environnementaux, sont nécessaires au développement de la maladie chez les individus porteurs d'une mutation BMPR2. Il existe plus de 300 à 400 mutations identifiées sur le gène *BMPR2* en HTAP et ces mutations peuvent se retrouver chez des individus atteints de cancer. Au cours de mon doctorat, je me suis intéressée à BMPR2 et aux facteurs environnementaux pouvant aboutir au développement d'une HTAP chez des individus porteurs de la mutation *BMPR2*. Cette thèse s'articule en quatre grandes sections. Une introduction globale initie le lecteur aux éléments nécessaires à la compréhension de l'HTAP tant au niveau clinique que préclinique et introduit des notions qui permettent une meilleure compréhension des parties suivantes. Le **chapitre 1** est une revue de la littérature centrée sur BMPR2, émanant d'une démarche personnelle visant à enrichir mes connaissances et celles du lecteur sur BMPR2. Cette revue exhaustive présente BMPR2, du gène à la protéine, dans les processus de développement vers les processus patho-physiologiques. Le **chapitre 2** présente mes travaux de doctorat, établissant les liens entre le cancer du sein et son microenvironnement pro- inflammatoire comme facteurs exacerbant le remodelage vasculaire pulmonaire ainsi que le développement de l'HP chez des individus portant une mutation *BMPR2*. En mettant en place le premier modèle de rat portant une mutation *Bmpr2* et développant chimiquement un cancer du sein, nous avons été en mesure d'établir un lien possible entre le cancer du sein et l'HTAP. Étudier l'impact du terrain inflammatoire pré-établi par l'HTAP puis exacerbé par le cancer nous permet de proposer le cancer du sein comme un élément additionnel (un second hit) dans le développement d'une HTAP avec mutation *Bmpr2*. Trois protocoles animaux ainsi que des collaborations avec des confrères ont permis de réaliser ce beau projet alliant cancer et HTAP, dans le but de mieux comprendre l'étiologie de l'HTAP. Suivant mes travaux de doctorat, une conclusion générale cloture ce mémoire en ouvrant le champ des possibles sur de nouvelles perspectives de recherche et qui pourraient amener à une poursuite d'étude sur les thématiques de l'HP, de l'HTAP due à une mutation *BMPR2*, du cancer et de l'inflammation. En conclusion, cette thèse tente de progresser dans la compréhension de la pathologie de l'HP en identifiant les facteurs pouvant favoriser le développement de l'HTAP chez des individus porteurs de la mutation *BMPR2* et en y associant d'autres pathologies, comme le cancer, dans le but de mieux comprendre le mode de développement de la maladie. Ces travaux translationnels ambitionnent d'apporter une explication à la faible pénétrance de la mutation *BMPR2* de proposer une vision de l'étiologie potentielle de la pathologie. / Pulmonary hypertension (PH) is a lethal pathology characterized by abnormally high pulmonary pressures. Among the five existing groups of PH, classified according to their clinical features, I focus my thesis on the first group of PH : pulmonary arterial hypertension (PAH). Hemodynamically, PAH is defined by a mean pulmonary arterial pressure (mPAP) greater than 20 mmHg, pulmonary vascular resistances (PVR) greater than 3 Wood units (WU), and pulmonary arterial occlusion pressure (PAOP) less than 15 mmHg. Histologically, PAH results from excessive vasoconstriction and abnormal remodeling of distal pulmonary arteries. Finally, at the cellular level, PAH is associated with pro-proliferative behavior and a resistance to apoptosis of smooth muscle cells and endothelial cells. The etiology of PAH is complex and imperfectly understood. We can distinguish idiopathic or hereditary PAH, or connective tissue diseases associated PAH. Mutations can also cause the development of PAH. The most common mutation in PAH is the BMPR2 mutation, observed in 70-75% of patients with hereditary PAH and in 20-25% of patients with idiopathic PAH. The penetrance of PAH caused by a BMPR2 mutation remains low (20 to 30%), which suggests that other factors, genetic and/or environmental, are necessary for the development of the disease in individuals with BMPR2 mutation. There are more than 300 to 400 mutations identified on the BMPR2 gene in PAH and we find these mutations in individuals with cancer. During my PhD, I focused my interest in BMPR2 and the environmental factors that can lead to the development of PAH in individuals with BMPR2 mutation. This thesis is structured in four main sections. A global introduction introduces the reader to the elements necessary for understanding PAH at both the clinical and preclinical levels and introduces concepts that allow a better understanding for the following parts. **Chapter 1** is a literature review focused on BMPR2, emanating from a personal approach aimed at enriching my knowledge and that of the reader on BMPR2. This exhaustive review talks about BMPR2, from the gene to the protein, in the developmental processes towards pathophysiological processes. **Chapter 2** presents my doctoral work, establishing the links between breast cancer and its pro-inflammatory microenvironment as factors exacerbating pulmonary vascular remodeling as well as the development of PH in individuals carrying a BMPR2 mutation. By setting up the first rat model carrying a *Bmpr2* mutation and chemically developing breast cancer, we were able to establish a possible link between breast cancer and PAH. Studying the impact of the inflammatory terrain pre-established by PAH and then exacerbated by cancer allows us to propose breast cancer as a second hit in the PAH development with BMPR2 mutation. Three animal protocols and several collaborations with colleagues have made it possible to carry out this great project combining cancer and PAH, with the aim of better understanding the etiology of PAH. Following my doctoral work, a general conclusion closes this thesis by opening the field of possibilities on new research perspectives, which could lead to a continuation of study on the themes of PH, PAH due to the BMPR2 mutation, cancer and inflammation. In conclusion, this thesis attempts to improve the understanding on PH by identifying factors that can promote the PAH development PAH in individuals with the BMPR2 mutation and by associating it with other pathologies, such as cancer, in order to better understand the development mode of the disease. This translational work aims to provide an explanation for the low penetrance of BMPR2 mutation and to propose a vision of the potential etiology of the pathology.

Pour assurer leur survie, les plantes ont développé au cours du temps une gamme de mécanismes de défense leur offrant une protection contre plusieurs organismes herbivores. Un de ces moyens de défense consiste à produire des inhibiteurs de protéases de classes variées, incluant les cystatines, actives contre les protéases digestives de type cystéine utilisées par plusieurs herbivores (Haq et al, 2004). Chez les plantes, les cystatines sont impliquées dans plusieurs processus importants incluant l'organogenèse, la mort cellulaire programmée, le recyclage des protéines de réserve et la défense directe contre les insectes herbivores (Arai et al, 2002; Belenghi et al, 2003). Des travaux récents réalisés dans notre laboratoire ont permis de détecter au niveau moléculaire des événements de sélection positive documentant l'évolution des cystatines végétales (Kiggundu et al, 2006). Les données obtenues indiquaient que des mutations survenant à certains sites des gènes cystatine pourraient permettre de générer une grande variabilité fonctionnelle utile pour l'inhibition des protéases digestives des herbivores. D'un point de vue biologique, l'existence de ces régions hypervariables chez les cystatines serait vraisemblablement un processus clé expliquant l'évolution adaptative de ces protéines au cours du processus de coévolution entre la plante hôte et ses ennemis herbivores (Rausher, 2001). Dans le cadre de ce travail, nous avons formulé une première hypothèse selon laquelle l'existence de régions hypervariables chez les cystatines végétales, expliquée par un processus de sélection positive, favorise la génération de diversité fonctionnelle contre les protéases de type cystéine. En complément, nous avons aussi posé l'hypothèse selon laquelle cette diversité fonctionnelle pourrait permettre la génération d'inhibiteurs de protéases à la fois plus efficaces contre les protéases digestives des insectes et moins actifs contre les protéases endogènes de la plante. Des variants cystatine mutés à des sites hypervariables ont été développés en utilisant comme modèle la 8'^ unité de la multicystatine de tomate, S'/CYSS. La multicystatine de tomate, d'une masse moléculaire de 88 kDa, comprend huit unités fonctionnelles pouvant lier la papaïne, une protéase modèle de type cystéine (Wu and Haard, 2000). Pour nos travaux, trois codons identifiés statistiquement comme étant soumis à la sélection positive et deux codons soumis à la sélection neutre ont été soumis à la mutagenèse dirigée. Les variants correspondants ont été ensuite exprimés chez E. coli et purifiés à l'aide du système d'expression glutathione S-transférase (Michaud et al, 1994). Leur activité inhibitrice a été mesurée par fluorimétrie contre différentes protéases modèles de type cystéine d'intérêt médical, industriel ou agricole. Le potentiel d'inhibition des variants iS/CYS8 a aussi été testé par fluorimétrie contre les protéases endogènes de la pomme de terre et les protéases digestives de larves de doryphores de pomme de terre. Ce ravageur important en agriculture utilise une panoplie de protéases digestives, certaines sensibles, d'autres insensibles aux cystatines végétales. En bref, l'analyse des différents variants 5/CYS8 a permis de confirmer que l'existence de sites hypervariables chez les cystatines était corrélée à une diversification fonctionnelle de ces inhibiteurs contre les protéases modèles étudiées. Nos analyses ont aussi permis de mettre en évidence certaines contraintes pour la sélection positive, liées notamment aux altérations structurales et chimiques créées par certaines mutations. Suite aux résultats obtenus dans la première partie du projet, nous avons voulu vérifier si cette variabilité fonctionnelle pouvait s'appliquer à un système biologique d'intérêt agronomique, en l'occurrence, l'interaction doryphore/pomme de terre. En combinant les résultats des différents tests effectués, nous avons pu confirmer que certains inhibiteurs montraient effectivement une activité accrue contre les protéases de l'insecte tout en montrant une activité diminuée contre les protéases endogènes de la plante. Cette nouvelle stratégie d'amélioration moléculaire, combinée à d'autres stratégies comme la confection d'inhibiteurs de protéases hybrides, pourrait s'avérer très prometteuse dans les années à venir pour le développement d'outils utiles en phytoprotection. D'une manière plus générale, la variabilité fonctionnelle générée par mutagenèse des cystatines à des sites soumis à la sélection positive confirme l'utilité possible de modèles évolutifs statistiques pour l'amélioration dirigée des protéines de défense.

La fertilité mâle se définit comme étant la capacité de l'individu à produire des spermatozoïdes fonctionnels et à les livrer au tractus génital femelle. Les variations de fertilité interindividuelles sont tributaires de la proportion de spermatozoïdes fonctionnels d'un éjaculat. La fonctionnalité des spermatozoïdes étant modulée par leur composition biochimique, nous avons émis l'hypothèse que les spermatozoïdes issus d'individus fertiles présentaient un contenu protéique différent des spermatozoïdes issus d'individus sous-fertiles. Utilisant le modèle bovin, nous avons comparé la fraction «Triton soluble» du protéome de spermatozoïdes cryopréservés issus de taureaux de haute et de basse fertilité. Huit protéines montrant une différence entre les deux groupes de fertilité ont été identifiées par spectrométrie de masse. Parmi celles-ci, BSP1 et ELS PBP 1 étaient davantage présentes chez les spermatozoïdes issus de taureaux de basse fertilité. En centrifugeant de la semence cryopréservée sur un gradient discontinu de percoll, il est possible de séparer la population de spermatozoïdes motiles de la population de spermatozoïdes immotiles. BSP1 et ELS PBP 1 étaient toutes deux retrouvées en plus grande quantité dans la population de spermatozoïdes immotiles, laquelle est principalement composée de spermatozoïdes morts au cours du processus de cryopréservation. L'association de BSP1 et d'ELSPBPl avec la viabilité des spermatozoïdes a alors été investiguée. BSP1 est la protéine majeure du plasma séminal bovin et est acquise par le spermatozoïde lors de l'éjaculation. Dans la semence fraîchement éjaculée, la population de spermatozoïdes vivants était composée de deux sous-populations distinctes, distinguées par la présence ou l'absence de BSP1 sur la région acrosomale. Dans la semence cryopréservée, tous les spermatozoïdes présentant BSP1 sur la région acrosomale étaient morts. L'affinité de BSP1 pour la phosphatidylcholine et sa propension à modifier le contenu lipidique des membranes pourraient expliquer le lien de BSP1 avec la sensibilité des spermatozoïdes à la cryopréservation. ELS PBP 1 est acquise par le spermatozoïde au cours du transit épididymaire. Nos résultats ont montré qu'ELSPBPl était une sécrétion apocrine de l'épithélium épididymaire transférée spécifiquement aux spermatozoïdes morts. Le zinc s'est montré un cofacteur important de ce mécanisme de transfert. Ces résultats suggèrent qu'un mécanisme de contrôle de la qualité des spermatozoïdes est présent dans l'épididyme. tributaires de la proportion de spermatozoïdes fonctionnels d'un éjaculat. La fonctionnalité des spermatozoïdes étant modulée par leur composition biochimique, nous avons émis l'hypothèse que les spermatozoïdes issus d'individus fertiles présentaient un contenu protéique différent des spermatozoïdes issus d'individus sous-fertiles. Utilisant le modèle bovin, nous avons comparé la fraction «Triton soluble» du protéome de spermatozoïdes cryopréservés issus de taureaux de haute et de basse fertilité. Huit protéines montrant une différence entre les deux groupes de fertilité ont été identifiées par spectrométrie de masse. Parmi celles-ci, BSP1 et ELS PBP 1 étaient davantage présentes chez les spermatozoïdes issus de taureaux de basse fertilité. En centrifugeant de la semence cryopréservée sur un gradient discontinu de percoll, il est possible de séparer la population de spermatozoïdes motiles de la population de spermatozoïdes immotiles. BSP1 et ELS PBP 1 étaient toutes deux retrouvées en plus grande quantité dans la population de spermatozoïdes immotiles, laquelle est principalement composée de spermatozoïdes morts au cours du processus de cryopréservation. L'association de BSP1 et d'ELSPBPl avec la viabilité des spermatozoïdes a alors été investiguée. BSP1 est la protéine majeure du plasma séminal bovin et est acquise par le spermatozoïde lors de l'éjaculation. Dans la semence fraîchement éjaculée, la population de spermatozoïdes vivants était composée de deux sous-populations distinctes, distinguées par la présence ou l'absence de BSP1 sur la région acrosomale. Dans la semence cryopréservée, tous les spermatozoïdes présentant BSP1 sur la région acrosomale étaient morts. L'affinité de BSP1 pour la phosphatidylcholine et sa propension à modifier le contenu lipidique des membranes pourraient expliquer le lien de BSP1 avec la sensibilité des spermatozoïdes à la cryopréservation. ELS PBP 1 est acquise par le spermatozoïde au cours du transit épididymaire. Nos résultats ont montré qu'ELSPBPl était une sécrétion apocrine de l'épithélium épididymaire transférée spécifiquement aux spermatozoïdes morts. Le zinc s'est montré un cofacteur important de ce mécanisme de transfert. Ces résultats suggèrent qu'un mécanisme de contrôle de la qualité des spermatozoïdes est présent dans l'épididyme.

La transcription est le processus biologique qui permet l'expression des gènes et donc est essentielle à la vie cellulaire. Ce phénomène nécessite une régulation très fine via de nombreux signaux cellulaires menant à un contrôle de la dynamique chromatinienne. Chez Saccharomyces cerevisiae, le complexe histone acétyltransférase NuA4 participe à cette régulation en acétylant les queues N-terminales des histones H4 et H2A. La chromatine est alors plus relâchée, ce qui facilite l'accès de toute la machinerie transcriptionnelle. Lors de cette étude, nous avons abordé deux aspects distincts de la fonction de NuA4. D'une part, la sous-unité Yng2, homologue de suppresseur de tumeur humain impliqué entre autres dans la régulation de p53, est connue pour interférer dans plusieurs processus cellulaires. In vivo, le mutant Ayng2 entraîne une diminution de l'acétylation de H4 et de la transcription dépendante de NuA4. La création de mutations ponctuelles dans le domaine ± Plant HomeoDomain ¿ (PHD) et la région polybasique de la protéine provoque la perte d'interactions spécifiques avec la modification post-traductionnelle H3K4me3 et les phosphatidylinositol phosphates. L'étude fonctionnelle de ces mutants révèle une répercussion sur l'activité de NuA4 et la transcription. D'autre part, les sous-unités EaO, 5 et 7 existent majoritairement hors de NuA4 sous la forme d'un trimère. Des tests de sensibilité mettent en évidence une corrélation entre ce trimère et la transcription. De plus, le trimère serait présent à la région codante de gènes transcrits suggérant un rôle dans l'élongation transcriptionnelle.

Les protéines appartenant à la famille S100 et les annexines interviennent lors de différents mécanismes membranaires vitaux. En effet, le complexe protéique S100A10-annexine A2 permettrait le recrutement d'une partie du C-terminal de la protéine AHNAK à la membrane en présence de calcium, avant de former une plateforme qui initierait la réparation membranaire. Cependant, aucune donnée moléculaire n'est à ce jour disponible sur la liaison membranaire de la S100A10 et du segment C-terminal d'AHNAK de ce complexe. Leur liaison membranaire doit donc être étudiée afin de mieux comprendre leurs rôles lors du processus de réparation membranaire. Afin de combler le manque de données sur le rendement et la quantité de S100A10 solubilisée et purifiée parmi la littérature existante, le protocole de surexpression et purification de la S100A10 a été optimisé dans un premier temps. La protéine a été identifiée par spectrométrie de masse et la stabilité de sa structure secondaire a été analysée par dichroïsme circulaire à différentes températures au cours du temps. La S100A10 obtenue est stable pendant au moins 60 jours à plusieurs températures, dont 20 °C, permettant d'effectuer des expériences biophysiques à température ambiante avec la protéine non-dénaturée. En parallèle, le segment peptidique C-terminal d'AHNAK (pAHNAK) a été synthétisé commercialement. L'étude par spectroscopie infrarouge de réflexion totale atténuée (ATR) montre que sa structure secondaire ne subit pas de changement majeur en présence et en absence de lipides. Deux modèles membranaires ont été choisis dans nos études. D'abord, celui des monocouches de Langmuir a été utilisé pour mimer les membranes cellulaires afin de caractériser l'interaction des protéines avec différents phospholipides composant les membranes. Les études de la liaison membranaire de ces protéines ont été effectuées avec ce modèle en le couplant avec la tensiométrie de surface. Ces travaux ont démontré que le pAHNAK interagissait plus fortement avec les lipides insaturés, en particulier les lipides monoinsaturés, qu'avec les lipides saturés. De plus, le pAHNAK interagit préférentiellement avec la tête polaire des phospholipides de type phosphatidylsérine (PS), qui sont chargées négativement, puis avec ceux de type phosphatidyléthanolamine (PE) et enfin avec ceux de type phosphatidylcholine (PC). Avec le même modèle, la profondeur d'insertion des protéines dans des monocouches lipidiques a été déterminée par ellipsométrie. Les expériences avec des phospholipides monoinsaturés démontrent que la profondeur d'insertion du pAHNAK suit la même tendance (PS˃PE˃PC). Le deuxième modèle employé est celui des bicouches lipidiques avec lequel l'affinité de ces protéines pour les têtes polaires des phospholipides a spécifiquement été évaluée par résonance magnétique nucléaire (RMN) du ³¹P à l'état solide. Ces études de RMN confirment la tendance de préférence du pAHNAK pour les différents types de phospholipide à 37 °C observée précédemment. La liaison membranaire de la S100A10 a ensuite été étudiée selon la même stratégie que pour le pAHNAK. Les résultats de la tensiométrie montrent que la S100A10 préfère interagir avec les phospholipides insaturés avec des têtes polaires PE ou PS, et surtout les phospholipides polyinsaturés contenant de longues chaînes acyles. Les expériences d'ellipsométrie suggèrent que la S100A10 suit l'ordre d'insertion PC > PE > PS, ce qui pourrait être expliqué par un changement d'orientation de la protéine. De plus, les résultats de RMN suggèrent qu'à 20 °C et à 37 °C, la S100A10 pourrait s'insérer partiellement dans la membrane près des têtes polaires PS. L'ensemble de nos travaux de recherche démontrent que, dans un environnement physiologique à 37 °C, le pAHNAK et la S100A10 peuvent probablement interagir avec des phospholipides monoinsaturés ayant une tête polaire chargée négativement. Cependant, le pAHNAK aura tendance à s'insérer dans les chaînes acyles alors que la S100A10 s'insérerait partiellement près des têtes polaires. Ce projet a ainsi permis de développer les connaissances sur la liaison membranaire de la protéine S100A10 et du pAHNAK et d'émettre de nouvelles hypothèses quant au rôle des PS dans la réparation membranaire. De plus, la poursuite de ces travaux mènera à l'identification potentielle des conditions conduisant à une modification de leur liaison membranaire, et éventuellement à une perte de fonction. Ainsi, les connaissances développées dans cette thèse permettent de mieux comprendre la liaison membranaire de la S100A10 et du C-terminal d'AHNAK afin de mieux déterminer leurs rôles dans la réparation membranaire, ainsi que dans les autres mécanismes physiologiques auxquels ces protéines participent. / Proteins belonging to S100 family proteins and annexins are involved in various vital membrane mechanisms. The S100A10-annexin A2 protein complex was postulated to recruit part of the C-terminal segment of the AHNAK protein to the membrane in the presence of calcium, before forming a platform which can initiate membrane repair. However, no molecular data is currently available on the membrane binding of S100A10 and of the C-terminal segment of AHNAK of this complex. Their membrane binding should therefore be studied in order to better understand their roles during the membrane repair process. In order to fill the lack of data on the yield and the quantity of purified and solubilized S100A10 in the existing literature, the protocol for the overexpression and purification of S100A10 was first optimized. The protein was identified by mass spectrometry and its secondary structure stability was analyzed by circular dichroism at different temperatures over time. The S100A10 obtained is stable for at least 60 days at several temperatures, including 20 °C, allowing to perform biophysical experiments at room temperature with a non-denatured protein. In parallel, the C-terminal peptide segment of AHNAK (pAHNAK) was commercially synthesized. Attenuated total reflection infrared spectroscopy (ATR) study shows that its secondary structure does not undergo major changes in the presence and absence of lipids. Two membrane models were chosen in our studies. First, the Langmuir monolayers model was used to mimic cell membranes in order to characterize the interaction of proteins with the different phospholipids found in membranes. Membrane binding studies of these proteins were carried out with this model by coupling it with surface tensiometry. This work demonstrated that pAHNAK interact more strongly with unsaturated lipids, in particular monounsaturated lipids, than with saturated lipids. In addition, pAHNAK preferentially interacts with the phosphatidylserine (PS) polar head group which is negatively charged, then with phosphatidylethanolamine (PE) and finally with phosphatidylcholine (PC). With the same model, the insertion depth of pAHNAK into lipid monolayers was determined by ellipsometry. Experiments with monounsaturated phospholipids demonstrate that the insertion depth of pAHNAK follows the same trend (PS˃PE˃PC). The second model membrane used is lipid bilayers with which the affinity of pAHNAK for phospholipid polar head groups has specifically been evaluated by solid state ³¹P nuclear magnetic resonance (NMR). These NMR studies confirm the previously observed preference trend of pAHNAK at 37 °C for the different polar head groups. The membrane binding of S100A10 was then studied according to the same strategy as pAHNAK. The results of the tensiometry show that S100A10 prefers to interact with unsaturated phospholipids bearing PE or PS polar head groups, and especially polyunsaturated ones containing long fatty acyl chains. Ellipsometric experiments suggest that S100A10 follows the order of insertion PC> PE> PS, which could be explained by a change in orientation of the protein. Moreover, NMR results suggest that, at 20 and 37 °C, S100A10 could partially insert into the membrane near the PS polar head group. All of our research demonstrates that, in a physiological environment of 37 °C, pAHNAK and S100A10 can probably interact with monounsaturated phospholipids containing a negatively charged polar head group. However, pAHNAK will tend to insert into the acyl chains while S100A10 would insert partially near the polar head group of phospholipids. This project has thus made it possible to develop knowledge on the membrane binding of the S100A10 protein and of pAHNAK as well as to provide new hypotheses regarding the role of PS in membrane repair. In addition, the continuation of this work will lead to potentially identify the conditions leading to a modification of the membrane binding of these proteins, and possibly to a loss of function. Thus, the knowledge developed in this thesis allows to improve our understanding of the membrane binding of S100A10 as well as of the C-terminal segment of AHNAK in order to better determine their roles in membrane repair, as well as in other physiological mechanisms in which these proteins are involved.

Les lentilles produites au Canada sont peu transformées et peu valorisées, bien qu’elles constituent une importante source de protéines dont les effets santé sont de plus en plus reconnus. Certains bénéfices potentiels ayant été répertoriés incluent la séquestration des acides biliaires, l'inhibition de l'enzyme convertissant l'angiotensine-1, l'abaissement du cholestérol, l'équilibre de la glycémie, et des effets préventifs contre la maladie artérielle périphérique, le diabète et le cancer. Cependant, leur faible digestibilité et biodisponibilité liées aux facteurs antinutritionnels limitent l’utilisation des lentilles. Ce projet vise à étudier l’impact du traitement à la chaleur sur la structure et la digestibilité des protéines de lentilles. Dans un premier temps, l’impact des traitements thermiques sur la dénaturation et la gélification des protéines de lentilles a été étudié en faisant varier les conditions du milieu, notamment le pH et la force ionique. Le mécanisme de formation des gels a été étudié par calorimétrie DSC, FTIR et par rhéologie à petites déformations à différents pH 3, 7 et 9 en absence et en présence de CaCl2. Les résultats de DSC ont montré qu’aux pH 3, 7 et 9, il n’y a pas de différence significative (0,05) de la température de dénaturation (Td) enregistrée. Par contre Td augmente en présence de CaCl2 mais reste significative (p ˂ 0,05) à 50 mM de CaCl2. Avec le FTIR, nos résultats ont montré une intensité plus importante des bandes d’agrégation dans les conditions en présence de CaCl2. Cependant, la rhéologie dynamique à petite déformation a montré qu’à pH 9 en présence et en absence de CaCl2, le module d’élasticité (G’) reste plus élevé que les autres pH dans les mêmes conditions. Dans un deuxième temps, l’impact du traitement à la chaleur sur la digestibilité des protéines de lentilles a été étudié in vitro. La sensibilité aux enzymes digestives des protéines natives et dénaturées à la chaleur a été étudiée et comparée à celle des protéines gélifiées. Les résultats de la deuxième partie ont montré que les protéines dénaturées avaient une sensibilité plus élevée à l’hydrolyse par les enzymes protéolytiques que les protéines natives. Les protéines gélifiées à pH 9 ont générées des peptides avec un poids moléculaires environ 3 kDa et moins, plus petits par rapport aux gels à pH 3 et 7. De même, la présence de CaCl2 (50 mM) dans les différentes conditions de pH n’a pas ii modifié la sensibilité à la dégradation des gels formés. Bien que le CaCl2 favorise l’agrégation des protéines de lentilles, la chaleur semble nécessaire à l’exposition des sites d’attaques des enzymes protéolytiques, comparé à l’hydrolyse protéique des échantillons sans traitement thermique. / Most lentils produced in Canada are not processed and valorized, although they constitute an important source of proteins, the health benefits of which are now well recognized. These health benefits include the sequestration of bile acids, inhibition of angiotensin-converting-enzyme-1, lowering of cholesterol, maintaining blood sugar levels, and preventive effects against peripheral arterial disease, diabetes and cancer. However, the low digestibility and bioavailability deriving from anti-nutritional factors limit the use of lentils. This project aims to study the impact of heat treatment on the structure and digestibility of lentils’ proteins. Initially, the impact of heat treatment on the denaturation and gelation of the proteins of lentils was studied by varying environmental conditions such as the pH and ionic strength. The mechanism of formation of gels was studied by DSC, FTIR and small deformation rheology at pH 3, 7 and 9, in absence and presence of CaCl2. The results obtained from DSC indicate that at pH 3, 7 and 9, there is no significant difference (p ˂ 0.05) between the denaturation temperatures (Td). However, the Td increases in the presence of CaCl2 and is significantly higher (p ˂ 0.05) when the concentration of CaCl2 reaches 50 mM. Furthermore, FTIR results show a higher intensity of the aggregation bands in the presence of CaCl2. On the other hand, small deformation rheology indicates that at pH 9, in the presence or absence of CaCl2, the elastic modulus (G’) is the highest. The impact of heat treatment on the digestibility of lentils’ proteins was then studied in vitro. The effects of digestive enzymes on native, heat denatured and gelled proteins were evaluated. The data indicate that the denatured proteins are more sensitive to proteolytic hydrolysis than the native proteins. At pH 9, the gelled proteins generate peptides with a molecular weight around 3 kDa or less, which are much smaller compared to that obtained at pH 3 and pH 7. Similarly, the presence of CaCl2 (50 mM) in different pH conditions does not affect the degradation of the gels. Although CaCl2 promotes the aggregation of lentil proteins, heat treatment is necessary to reveal the target sites of proteolytic enzymes.