La vision traditionnelle de la synthèse protéique chez les eucaryotes comprend un ARN messager (ARNm) qui porte un seul cadre de lecture ouvert (ORF). Chaque gène codant eucaryote produit généralement une protéine canonique et éventuellement une ou plusieurs isoformes. Cependant, de nombreuses évidences expérimentales récentes démontrent que le protéome des eucaryotes a été sous-estimé, et que les cellules sont capables de synthétiser des protéines qui n’étaient jusqu’alors pas prédites. Ces nouvelles protéines « alternatives » (altProts) peuvent être issues de la traduction d’ORFs non annotés contenus sur des ARNms, ou des ARNs non codants. Ces découvertes ont été possibles grâce aux progrès techniques réalisés en biochimie analytique en protéomique par spectrométrie de masse. Dans le cadre de ces analyses, deux approches sont privilégiées. La première, ou bottom-up se base sur les produits peptidiques issus d’une digestion enzymatique des protéines quand la seconde ou top-down est basée sur la mesure des protéines entières. Les travaux réalisés dans cette thèse s’articulent autour du développement de stratégies pour la découverte et la caractérisation des altProts par approches protéomiques bottom-up et top-down. Ces aspects sont décrits dans plusieurs publications scientifiques qui seront présentées dans ce manuscrit. Elles comprennent une revue de bibliographie, deux publications relatives à l’application de l’approche top-down par micro-extractions de tissus de cerveau de rat et de biopsie tumorale ovarienne et une publication relative à la détermination de la stœchiométrie de deux protéines, l’une alternative et l’autre canonique toutes deux issues du même gène. / The traditional view of protein synthesis in eukaryotic species involves one messenger RNA (mRNA) bearing a single open reading frame (ORF). Thus, each eukaryotic coding gene may produce one canonical protein and possibly one or more of its isoforms. However, numerous experimental evidence report that eukaryotic proteomes may have been under-estimated and that cells are capable of synthetizing proteins which had not been predicted thus far. These novel proteins, termed “alternative proteins” (altProts) may be translated from non-canonical ORFs localized in mRNAs or from RNAs annotated as non-coding. These discoveries were made possible thanks to technical progresses in analytical chemistry in mass spectrometry-based proteomics. These analyses are based on two main strategies; the “bottom-up” approach is based on the peptidic products of enzymatic digestion of native proteins whereas the second and more recent approach, termed “top-down”, is based on the analysis of intact protein by mass spectrometry. The work described in this thesis is focused on the development of experimental strategies helping the discovery and characterization of altProts using bottom-up and top-down approaches. The findings are described in scientific publications which are included in the thesis. These publications include a review, two publications on the application of the top-down approach using micro-extractions on rat brain tissue and ovarian tumor biopsy and one publication related to the stoichiometry elucidation of a canonical and an alternative protein both encoded within the same gene.

Avec la constante augmentation des prix du pétrole et la diminution des ressources fossiles, des alternatives « vertes » doivent être trouvées. Ainsi, des premières recherches ont été menées sur la possibilité de mettre au point des colles pour panneaux à base de bois dans lesquelles une partie du phénol a été substituée par des protéines de blé. De même, les tanins sont des molécules polyphénoliques naturelles et peuvent être une alternative aux produits chimiques de synthèse issus du pétrole. Les tanins de châtaignier, tanins hydrolysables, ont été utilisés afin de substituer une partie du phénol lors de la synthèse de résines phénoliques. Ces résines ont été étudiées et utilisées pour la fabrication de mousses phénoliques rigides. Cette démarche constitue un pas de plus vers la mise au point et la future commercialisation de matériaux plus respectueux de l’environnement. En outre, les tanins ont également été utilisés lors du développement de mousses rigides biosourcées tanins-furaniques, cette fois-ci il s’agit de tanins condensés : tanins de quebracho, couplés à de l’alcool furfurylique (d’origine agricole). Ces mousses « vertes » présentent une bonne résistance mécanique, de bonnes performances thermiques et elles ne brûlent pas, ainsi, elles sont totalement adaptées à une utilisation pour l’isolation des bâtiments. Enfin, de nouveaux types de matériaux issus de produits naturels (tanins et alcool furfurylique) ont été mis au point lors de cette thèse : des matériaux abrasifs et de friction biosourcés. Des roues abrasives et des disques abrasifs ont été développés et testés. Et des plaquettes de frein automobile ont été fabriquées et testées en conditions réelles. Tous ces nouveaux matériaux présentent d'excellentes propriétés par rapport aux matériaux commerciaux / With the constant increase of oil prices and with the dwindling of fossil resources, "green" alternatives must be found. Thus, first research was conducted on the possibility to develop synthetic phenolic adhesives for wood-based panels where a part of phenol was substituted by wheat proteins. Similarly, tannins which are natural polyphenolic molecules can be used as an alternative to synthetic chemical products. Chestnut tannin, a hydrolysable tannin was used to substitute part of phenol during the synthesis of phenolic resins. The characteristics of these resins were studied and the resins used for the manufacture of rigid phenolic foams. This is a new step towards the development and future commercialization of more environmentally friendly materials. Furthermore, condensed flavonoid tannins were also used in the development of tannins-furanic biobased rigid foams. Quebracho wood tannin extract was coupled with furfuryl alcohol another material of natural, agricultural origin. These "green" foams show good mechanical strength, good thermal performance and do not burn, thus they are entirely suitable for use in building insulation. Finally, new types of materials made from the same natural products (tannins and furfuryl alcohol) were developed during the research described in this thesis: biobased abrasive and friction materials. Abrasive wheels and abrasive discs for steel molding and steel cutting using a biobased matrix were thus developed and tested. Moreover, automotive brake pads were prepared and were tested under real vehicle application conditions. All these new materials showed excellent properties compared to commercial materials and yielded excellent results comparable and sometime superior to their synthetic commercial equivalents

Les domaines thymosineβ/WH2 sont une famille de protéines intrinsèquement désordonnées impliqués dans le remodelage du cytosquelette d’actine. Ces domaines de 20 à 50 acides aminés existent seuls ou au sein de protéines modulaires, isolés ou répétés. Ils exercent de nombreuses fonctions : ils séquestrent des monomères d’actine, promeuvent l’assemblage du filament, nucléent, fragmentent et coiffent les filaments. Tous les domaines WH2 interagissent de manière similaire avec l’actine via une hélice amphipathique N-terminale suivie d’un brin central et d’une région C-terminal plus ou moins longue et dynamique. Une étude antérieure a montré que la fonction des domaines βT/WH2 isolés était liée à la dynamique du complexe avec l’actine déterminée par une combinaison d’interactions intermoleculaires le long de l’ensemble de la séquence. Les mécanismes expliquant la multifonctionnalité des domaines WH2 répétés restent vagues. Ce travail de thèse présente tout d’abord la production d’actine recombinante, sauvage et mutée dans le système baculovirus/Sf9 pour la biologie structurale ainsi que le développement de stratégies de marquage isotopique en cellules d’insectes. La deuxième partie s’intéresse à la caractérisation structurale et dynamique de domaines WH2 seules en solution : deux domaines isolés et deux protéines contenant deux domaines WH2. Les hélices amphipathiques N-terminales sont partiellement repliées avec des populations variant selon les protéines. La préstructuration des régions C-terminales est plus variable, complètement désordonnée ou partiellement hélicoïdale selon les protéines. La dernière partie présente l’étude de l’interaction de ces protéines avec l’actine. / WH2 domains are a family of intrinsically disordered proteins involved in actin cytoskeleton remodeling. These short domains, isolated or repeated in various actin binding proteins display a low sequence identity and a large panel of functions such as sequestration of actin monomers, promotion of unidirectional assembly, nucleation, fragmentation, filament capping. All WH2 domains fold similarly upon actin binding. They form an extended interface along actin, with an amphipathic N-terminal helix followed by an extended central strand and a more dynamic C-terminal region. Previous work on single βT/WH2 domains showed that function was linked to the dynamics of the complex with actin which is determined by a combination of intermolecular interactions throughout the sequence. The multifunctionality of WH2 tandem repeats is still elusive. The present work first describes production of recombinant wild-type and mutant actin in insect cells and isotopic 15N-labeling for NMR spectroscopy. As a first step to gain insight into the folding upon binding mechanism of functionally different WH2 repeats, we investigated the conformational behavior of two single domains and two tandem repeats free in solution by NMR. The N-terminal amphipatic helix is partially formed but with various propensities depending on the proteins while the C-terminal region that may form an helix in the complex may be either completely disordered or partially formed in absence of actin. Investigation of WH2:actin interaction for the same four proteins is described in the last chapter.

L’érythropoïèse est un processus complexe qui aboutit à la formation de 100 milliards de globules rouges/jour. Elle est finement régulée pour permettre d’adapter la production de globules rouges aux besoins en oxygène des tissus périphériques. La compréhension des processus complexes mis en jeu lors de la régulation de l’érythropoïèse requière l’étude de nouveaux acteurs moléculaires tel que la protéine NACA (chaîne alpha du complexe associé aux polypeptides naissants), mise en évidence comme un régulateur positif de la différenciation érythroïde humaine. Nous avons identifié ERGIC-53 comme nouvel interacteur de NACA. ERGIC-53 est une lectine mannose spécifique membranaire impliquée dans le transport des glycoprotéines du Réticulum Endoplasmique (RE) vers le compartiment ERGIC (Endoplasmic Reticulum Golgi Intermediate Compartment). Nous avons démontré que ERGIC-53 et NACA participent à la régulation du trafficking de l’EPO-R. NACA est aussi un régulateur négatif de l’apoptose médié par FADD. Nous avons initié l’étude de NACA dans les Syndromes Myélodysplasiques de bas risque (ES-MDS) présentant une déficiente de l’érythropoïèse due à l’apoptose des progéniteurs érythroïdes. Nous avons démontré que la transduction de NACA des progéniteurs CD34+ de ES-MDS restore la différenciation érythroïde et augmente la survie des progéniteurs érythroïdes. De plus, cette étude suggère que la quantification du mRNA NACA pourrait être un nouveau marqueur prédictif de réponse au traitement par rhEPO. En conclusion, notre travail a souligné qu’une simple molécule de la machinerie cellulaire est impliquée dans la différenciation érythroïde normale et des ES-MDS. / The erythropoiesis is a complex process that leads to the formation of 100 billion red cells per day. It is finely regulated to adjust the production of red blood cells according to oxygen needs of peripheral tissues. To understand the complex processes involve in the regulation of erythropoiesis, it requires the study of molecular actors such as the NACA protein (the alpha chain of the nascent polypeptide-associated complex), highlighted as a positive regulator of erythroid human differentiation. We have identified ERGIC-53 as a novel interactor of NACA. ERGIC-53 is a lectin mannose-specific membrane involved in the transport of glycoproteins from the Endoplasmic Reticulum (ER) to the ERGIC compartment (Golgi Endoplasmic Reticulum Compartment Intermediate). We have shown that ERGIC-53 and NACA are involved in the regulation of trafficking of EPO-R. NACA may be also a negative regulator of apoptosis mediated by FADD. We investigated the role of NACA in early stages of myelodysplastic syndromes (ES-MDS) which have ineffective erythropoiesis due to apoptosis of erythroid progenitors. We have demonstrated that transduction of NACA in CD34 + progenitor cells from ES-MDS restores erythroid differentiation and increased survival of erythroid progenitors. Moreover, this study suggests that the level of mRNA NACA may be a new predictive marker of response to rhEPO treatment. In conclusion, our work highlighted that a molecule of the cellular machinery is involved in erythroid differentiation of both normal and ES-MDS CD34+ cells.

Le système sécrétion de type V à deux partenaires ou système TPS est un système dédié à la sécrétion de protéines de grandes tailles souvent impliquées dans la virulence. La protéine sécrétée ou protéine TpsA traverse la membrane externe via son partenaire membranaire spécifique, la protéine TpsB. Ces systèmes TPS sont répartis en deux sous-familles, la sous-famille FHA/FhaC et la sous-famille HMW1A/HMW1B, peu caractérisée structuralement, à laquelle appartient le système HxuA/HxuB dédié à l’acquisition de l’hème extracellulaire chez Haemophilus influenzae. Ma thèse est consacrée à l’étude structurale et fonctionnelle du système HxuA/HxuB. A cette fin, le système de sécrétion HxuA/HxuB a été recréé chez E. coli. Le domaine N-terminal de HxuA, HxuA301, et son partenaire HxuB entier ont été produits respectivement en surnageant de culture et en membrane externe. Après purification de ces protéines, des essais de cristallogenèse ont été réalisés. Des cristaux ont été obtenus pour HxuA301 et HxuB. Seule la structure de HxuA301 a pu être déterminée avec une résolution de 1,5 Å. HxuA301 présente une structure en hélice-β main droite avec un motif extra-hélice constitué de quatre brins-β antiparallèles. Des croisements entre les systèmes HxuA/HxuB et HMW1A/HMW1B ont été réalisées et ont mis en évidence le fait que HxuB n’est pas indispensable au repliement de HxuA301. On a en effet pu résoudre la structure de HxuA301 produite dans E. coli sans HxuB (HxuA301-noB) qui est en tout point identique à celle de HxuA301. Cette observation appuie l’hypothèse selon laquelle le domaine N-terminal des protéines TpsA serve à initier le repliement progressif de la protéine TpsA une fois la surface bactérienne atteinte. / The type V two-partner secretion system or TPS system is a system dedicated to the secretion of large proteins mostly implied in virulence. The secreted protein or TpsA protein crosses the outer membrane thanks to its membrane partner, the TpsB protein. The TPS systems are subdivided into two subfamilies, the FHA/FhaC and HMW1A/HMW1B subfamily, with few structural characterized, in which belongs the system HxuA/HxuB dedicated to the acquisition of extracellular haem in Haemophilus influenzae. My thesis focuses on the structural and functional study of HxuA/HxuB system. In that aim, HxuA/HxuB secretion system has been recreated in E. coli. HxuA N-terminal domain, HxuA301, and full length HxuB membrane partner have been produced respectively in the supernatant and in the outer membrane. After purification of these proteins, crystallogenesis assays have been realized. Crystals have been obtained for HxuA301 and HxuB. Only the HxuA301 structure has been determined with a resolution of 1,5 Å. HxuA301 presents a structure in right-handed β-helix with one extra-helix motif constituted a four antiparallel β-strands. Crossing between HxuA/HxuB and HMW1A/HMW1B systems has been realized and highlighted that HxuB is not necessary for the folding of HxuA301. Indeed, we succeed to solve the structure of HxuA301 produced in E. coli without HxuB (HxuA301-noB) which is strictly identical to the one of HxuA301. This observation supports the hypothesis that N-terminal domain of TpsA could act as a scaffold pour the progressive folding of TpsA protein once the cell surface reached.

La tumeur maligne primitive du foie la plus fréquente est le carcinome hépatocellulaire. Le développement des cellules tumorales hépatiques dépend d'un influx calcique dont la base moléculaire, dans le foie, est constituée de TRPC6, des STIM1 et 2, et de Orai1. Nous avons recherché si le développement de ces tumeurs était accompagné d'un changement du profil d'expression de ces protéines. Nous avons montré que le canal TRPC6 est absent des hépatocytes humains sains mais fortement exprimé dans les tumeurs hépatiques, les foyers d'expression de TRPC6 étant visibles uniquement dans les zones tumorales du foie. Le niveau d'expression de TRPC6 dépend de certains facteurs de croissance et cette expression est directement corrélée à l'amplitude de l'entrée de calcium et à la prolifération cellulaire des hépatomes humains. STIM1 et Orai1 sont aussi impliqués dans cette relation, l'inhibition de l'expression de TRPC6, STIM1 ou Orai1 entraînant une baisse de l'expression des cyclines D1 dans ces cellules. Inversement, le blocage du cycle cellulaire va entraîner, de manière réversible (<4heures), une importante réduction de l'entrée de calcium. Les cultures primaires d'hépatocytes humains nous ont permis de confirmer ces résultats, démontrant ainsi la relation étroite entre entrée calcique et prolifération cellulaire. Nos derniers résultats ont montré que la base moléculaire de cette entrée dépend du type cellulaire utilisé mais que Orai1 en est la pièce centrale. Ce travail de thèse a permis d'élargir les connaissances sur la composition du complexe moléculaire formant l'entrée calcique directement impliquée dans la prolifération cellulaire et le développement de tumeurs hépatiques. / Hepatocellular carcinoma is the most frequent primary liver tumor. Tumoral cell proliferation depends on calcium influx which molecular basis in human liver is formed of TRPC6, STIM1 and 2, and Orai1. We have investigated whether tumors' development in human livers was accompanied by a change in the pattern of expression of these proteins. We have shown that TRPC6 channel is absent in healthy human hepatocytes but strongly expressed in human liver tumors, and TRPC6 expression is only detectable in the tumor zones. TRPC6 expression level depends on growth factors, and this expression is directly correlated with the amplitude of the calcium entry and cell proliferation of human hepatoma cell line. STIM1 and Orai1 also play a major role in this process and inhibition of the expression of TRPC6, STIM1 or Orai1 causes a decrease in cyclin D1 expression in human hepatoma cell line. Conversely, cell cycle block results in a large decrease in calcium influx that quickly reversed in less than 4 hours after cell cycle release. Primary cultures of human hepatocytes allowed us to confirm these results, emphasizing the tight relation between calcium influx and cell proliferation. Our recent data strongly suggested that the molecular basis of this calcium entry varies from one cell type to another, with Orai1 as the core of this plasma membrane complex. In conclusion, this thesis has expanded the knowledge about the actors of calcium entry and their role in the proliferation of both liver cells and liver cancer development

Les protéines 14-3-3 sont des protéines adaptatrices qui exercent leurs fonctions biologiques en modulant l’activité de centaines d’autres protéines. De part leur impressionnant interactome, les protéines 14-3-3 sont des acteurs qui influencent de nombreux événements cellulaires et, par conséquent, de maladies associées. La stabilisation ou l’inhibition sélective d’interactions protéine-protéine (IPP) de 14-3-3 sont considérées comme des approches prometteuses pour trouver des thérapies innovantes contre des maladies comme la maladie d’Alzheimer, certains cancers ou la maladie de Parkinson.Notre premier but afin de trouver des petites molécules capables de moduler ces cibles a été d’étudier au niveau moléculaire des IPP de 14-3-3. Dans ce but, nous avons utilisé la Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) pour attribuer les déplacements chimiques des atomes du squelette de 14-3-3σ. Nous avons ensuite étudié l’interaction entre 14-3-3 et la protéine Tau phosphorylée. Nous avons découvert que Tau se lie strictement dans la cavité amphipathique de 14-3-3 et peut s’ancrer aux deux monomères du dimère de 14-3-3. Nous avons aussi étudié l’interaction 14-3-3/p53 et avons découvert, en utilisant la RMN, que l’affinité du peptide p53 envers 14-3-3 est liée à des interactions intramoléculaires au niveau du peptide. Nous nous sommes enfin focalisés sur l’optimisation d’expériences RMN visant le criblage et la caractérisation de l’activité des petites molécules qui se lient à 14-3-3 ou à des complexes de 14-3-3 avec des peptides phosphorylés. Nous avons aussi utilisé des peptides phospho-mimétiques pour inhiber l’interaction 14-3-3/Tau. D’autre part, nous avons criblé une bibliothèque de fragments contre 14-3-3σ et trouvé trois hits qui se lient à des régions différentes de la protéine. Des expériences RMN ont ensuite permis de caractériser l’activité de certaines petites molécules actives sur des complexes de 14-3-3 avec, par exemple des peptides de p53 ou p65, et nous avons aussi démontré la capacité de certains de ces composés à stabiliser les complexes. / 14-3-3 proteins are adapter proteins that exert their biological functions by modulating the activity of hundreds of proteins. This remarkable interactome makes 14-3-3 proteins influent actors in many cellular events and, by consequence, in several pathologies. The selective stabilization or inhibition of 14-3-3 protein-protein interactions (PPIs) are therefore seen as promising approaches for finding innovative therapies for a number of conditions like Alzheimer’s, cancer or Parkinson. Our first objective towards finding small molecule modulators of these targets was to obtain the molecular detail of 14-3-3 PPIs. To this end, using Nuclear Magnetic Resonance (NMR), we assigned the backbone chemical shifts of 14-3-3σ. We then studied the 14-3-3/phosphorylated Tau interaction and found that Tau binds strictly within the amphipathic binding grove of 14-3-3 and can anchor in both monomers of the 14-3-3 dimer. We also studied the 14-3-3/p53 interaction and showed by NMR, that intramolecular interactions within the peptide define a conformation that drives the affinity towards 14-3-3. 2019We then focused on the optimization of NMR assays for screening and characterization of the effect of small-molecules binding to 14-3-3 or 14-3-3 complexes with target’s phosphopeptides. We used, for example, phospho-mimetic peptides to inhibit the Tau/14-3-3 interaction. In a different strategy, we screened a fragment library against 14-3-3σ and found three hits binding to different regions of the protein. Using our NMR assays we further characterized small molecules binding 14-3-3 complexes with, for example, p53 and p65 peptides and demonstrated the stabilization capacity of some compounds.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Le transporteur MRP2 est connu comme étant la seule pompe qui occupe une position apicale au sein des cellules polarisées, elle est responsable du transport des anions organiques et des drogues, le mécanisme de transport de ces substrats était le sujet de recherche de plusieurs études, et dans ce travail nous étions capable de dévoiler l'importance des acides aminés chargés négativement (D333, D427, D433, D496, E532, D575) situés dans ou prés des hélices transmembranaires TM6, TM8, TM9, TM10 et TM11 de la protéine, ces derniers jouent des rôles cruciales dans l'activité de transport et dans le maintien de la structure fonctionnelle de MRP2.

Montréal Trigonix inc. 2018