Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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Le complexe Histone Acétyltransféranse (HAT) NuA4 s'inscrit comme un élément clef dans le contrôle de plusieurs fonctions cellulaires essentielles chez les eucaryotes. L'implication maintenant connu de NuA4 dans la transcription et dans la réponse aux dommages à l'ADN nous ont poussé à approfondir la caractérisation fonctionnelle des diverses sous-unités de NuA4, notamment au niveau des rôles que peuvent occuper les différents domaines protéiques retrouvés au sein de ce complexe. Une première série d'analyses a démontré l'importance de plusieurs résidus du chromodomaine de Esa1, la sous-unité catalytique de NuA4. La mutation de ces résidus engendre des défauts majeurs d'acétylation de la chromatine, suggérant ainsi un rôle du chromodomaine dans l'activité catalytique de Esa1. Parallèlement, d'autres études ont permis d'approfondir la fonction du domaine SANT de la protéine Eaf2, du PHD finger de Yng2 et du domaine PI-3 kinase de Tra1. Ce dernier domaine intéragit avec le complexe MRX, un complexe de levure recruté directement au site de cassure de l'ADN. Des recherches menées autour de l'étude de l'activité kinase de cette protéine ont permis de suggérer l'implication de NuA4 dans les événements précoces survenant suite à un bris double brin, précisant ainsi le rôle de ce complexe dans la réparation de l'ADN.

L’herpèsvirus humain 6 (HHV-6) est un pathogène opportuniste dont l’infection et/ou la réactivation sont associées avec des maladies telles la roséole, des désordres du système nerveux central, et des complications suite à la transplantation d’organes. Le séquençage du génome viral a révélé l’existence de deux types de HHV-6 (A et B), se distinguant par des séquences dissemblables dans des régions spécifiques et des propriétés biologiques différentes. Nos travaux portent sur la caractérisation de la protéine précoce-immédiate (IE) 2 de HHV-6A. Son expression précoce suite à l’infection et sa capacité de transactivation suggèrent qu’elle représente une protéine clé dans l’établissement d’une infection productive, grâce à son contrôle de la cascade d’expression des gènes viraux. De plus, le transcrit codant pour IE2 se situe dans la région la plus variable entre HHV-6A et -6B, suggérant que la biologie de cette protéine pourrait contribuer à expliquer les différences cliniques entre les deux types viraux. Afin de déterminer les protéines cellulaires recrutées par IE2 durant l’établissement de l’infection, nous avons criblé une librairie de cellules T à la recherche de partenaires d’interaction. Nous avons isolé la protéine Ubc9, enzyme jouant un rôle dans la voie de conjugaison de SUMO. Cette interaction a une importance fonctionnelle pour IE2, puisqu’Ubc9 réprime significativement l’activation de promoteurs par la protéine virale. Les domaines essentiels à la fonctionnalité d’IE2 n’avaient jamais été caractérisés. Nous avons démontré que les domaines N- et C-terminaux sont tous deux requis pour une transactivation optimale, et que la délétion de la queue C-terminale d’IE2 modifie significativement la transactivation et la localisation intranucléaire de la protéine. Nous avons également établi que la région R3 du promoteur précoce-immédiat de HHV-6A est positivement régulée par IE2. Globalement, ces travaux nous procurent une vision plus précise du rôle de la protéine IE2 dans l’initiation de l’infection par HHV-6. / Human herpesvirus 6 (HHV-6) is an opportunistic pathogen whose infection or reactivation are associated with diseases such as roseola, central nervous system disorders and organ transplant anomalies. Sequencing of the viral genome has exposed the existence of two HHV-6 variants (A and B), with diverging sequences in specific regions, and different biological characteristics. Our work focused on the characterization of HHV-6A immediate-early IE2 protein. Its prompt expression following infection and its transactivating ability suggest that IE2 constitutes a key protein for the establishment of a productive infection, owing to its control over the viral gene expression cascade. Moreover, the IE2 coding transcript is located in the most variable region between HHV-6A and -6B, suggesting that the biology of this protein could help explain the clinical differences between the two viral variants. In order to identify cellular proteins recruited by IE2 during the establishment of infection, we have screened a T-cell library for interaction partners. We have isolated Ubiquitin conjugating enzyme 9 (Ubc9), a protein involved in the small ubiquitin-related modifier (SUMO) conjugation pathway. This interaction has a functional relevance for IE2, with Ubc9 significantly repressing promoter activation by the viral protein. Protein domains essential for IE2 function had never been characterized. We have determined that the N- and C-terminal domains are both required for optimal transactivation, and that the deletion of the C-terminal tail of IE2 significantly alters transactivation and the intranuclear localization of the protein. Moreover, we have determined that the R3 domain of the immediate-early HHV-6A promoter represents an IE2 responsive element. Overall, this work provides a more precise image of the role of IE2 during the initiation of HHV-6 infection and a better comprehension of the biology of this complex virus.

La voie des microARNs est un mécanisme post-transcriptionnel de régulation génique qui contrôle divers aspects développementaux et physiologiques chez de nombreux eucaryotes supérieurs. Afin de mieux comprendre les rôles et modes d’actions des microARNs, nous avons entrepris l'exploration des interactions génétiques de cette voie chez le nématode \textit{Caenorhabditis elegans}. Nous nous sommes ainsi concentrés sur les gènes codant pour les protéines Argonautes ALG-1 et ALG-2, qui sont les principaux constituants effecteurs de cette voie. Premièrement, nous avons caractérisé la relation entre ces deux paralogues, en étudiant respectivement leur expression spatio-temporelle, leur association avec des microARNs, ainsi que les phénotypes associés à leur perte de fonction. Nous avons ainsi pu définir des caractéristiques communes et spécifiques pour chacune de ces deux protéines Argonautes et décrire de manière précise leurs rôles essentiels lors du développement embryonnaire. En effet, nous avons démontré que l'absence d'expression zygotique des protéines ALG-1/2 provoque un arrêt du processus morphogénétique lors de l'allongement des embryons et un défaut dans les structures de fixation épidermique-musculaires. Deuxièmement, nous avons realisé un criblage génétique dans le but d'identifier des nouveaux partenaires des protéines Argonautes ALG-1/2. Nous avons découvert le gène codant pour la protéine VPS-52, qui est un composant du complexe GARP (\textit{Golgi Associated Retrograde Protein}). La caractérisation de ce gène nous a permis de démontrer que VPS-52 interagit génétiquement avec le gène \textit{alg-1} et se comporte comme un modulateur positif de l'activité de certains miARNs impliqués dans le développement larvaire. Les mutants de \textit{vps-52} aggravent les défauts des cellules souches épidermales observés dans les mutants de \textit{alg-1} et du microRNA \textit{mir-48}. Ils augment également la létalité du mutant \textit{let-7(n2853)} et ce dépendement de sa cible. Ces augmentations phénotypiques sont liées à une baisse des niveaux des microARNs miR-48, miR-241 et des protéines GW182. Cette étude nous amène donc à proposer que l'activité des microARNs peut être contrôlée en partie par un mécanisme de transport rétrograde dépendant du complexe GARP. / The microRNA pathway is a post-transcriptional gene regulatory system that controls multiple developmental and physiological processes in many eukaryotes. We have undertaken the exploration of the genetic interactions of this pathway in the nematode \textit{Caenorhabditis elegans}, with the goal of unveiling processes controlled by microRNAs and the mechanisms of microRNA action. We focused on the genetic interactions of the \textit{alg-1} and \textit{alg-2} genes, that encode the microRNA-specific Argonaute proteins, key effector constituents of this pathway. In the first place, we characterized the relationship between these two argonaute paralogs, with respect to their spatio-temporal expression, association to microRNAs, and loss-of-function phenotypes. Thus, we defined shared and gene-specific features of these Argonautes and defined in detail their essential role during embryonic development. The absence of zygotic \textit{alg-1} and \textit{alg-2} expression causes arrest during the morphogenetic process of elongation with defects in the epidermal-muscle attachment structures. Addressing another aspect, we sought to elucidate novel genetic interactors of these argonautes using a forward genetics approach. We identified \textit{vps-52}, a component of the GARP (Golgi Associated Retrograde Protein) complex, as a genetic interactor of the \textit{alg-1} gene and established that, through its GARP complex function, it effects a positive modulatory role on miRNA activity. Mutants of \textit{vps-52} exacerbate the seam cell defects in the loss-of-function alleles of \textit{alg-1} and the \textit{let-7} miRNA family member \textit{mir-48} and enhance the lethality of the \textit{let-7(n2853)} hypomorph in a target dependent manner. These phenotypic enhancements related to decreased levels of the \textit{let-7} family microRNAs (miR-48 and miR-241) and the worm GW182 protein. Furthermore, the positive effect of \textit{vps-52} on microRNA activity seems to be conserved in mammalian cells, where VPS52 co-fractionates with miRISC components. Our analyses allow us to propose that VPS-52 as part of the GARP complex participates in membrane-related processes of the miRNA pathway, which facilitate miRNA activity and operate at the effector miRISC level.

L’anémie de Fanconi (AF) est une maladie infantile multigénique et complexe. Les enfants atteints d’AF souffrent d’une insuffisance médullaire progressive potentiellement mortelle. En plus du phénotype hématologique, les enfants souffrant d’AF présentent de nombreuses malformations congénitales incluant le système nerveux central et une prédisposition accrue aux cancers particulièrement de type leucémique. Plusieurs gènes associés à la maladie ont été identifiés mais leur fonction dans l’étiologie de la maladie demeure inconnue. La présence d’une mutation dans l’un des gènes Fanconi entraine une perte progressive des cellules souches hématopoïétiques (CSH) menant à un épuisement médullaire et favorisant l’apparition de leucémies. Les protéines Fanconi forment trois complexes protéiques distincts qui participent de manière séquentielle dans une voie de signalisation en réponse aux dommages à l’ADN. La protéine Fanconi Anemia de groupe C, ou FANCC, est une composante du complexe majeur de cette voie Fanconi. Outre son rôle dans la voie Fanconi et dans les mécanismes de signalisation en réponse aux dommages à l’ADN, FANCC est connue pour son implication dans la mort cellulaire programmée, la détoxification des radicaux oxygénés et la réponse aux cytokines. Afin d’identifier la fonction de la protéine FANCC dans les mécanismes de développement, nous avons procédé à un criblage d’une banque d’ADNc et identifié certains partenaires biochimiques de FANCC tel le récepteur de la Netrine-1, uncoordinated-5A (UNC5A). Puisque le récepteur UNC5A a une fonction de signal de survie cellulaire et est impliqué dans les mécanismes de croissance neuronale, nous avons étudié le rôle de l’interaction FANCC-UNC5A dans les mécanismes de différenciation neuronale. Nos résultats indiquent que FANCC régule la fonction pro-apoptotique de UNC5A. Lorsque FANCC est surexprimée, les cellules retardent leur entrée en apoptose tandis qu’en absence de FANCC, UNC5A favorise l’entrée en apoptose. De plus, nos résultats indiquent que FANCC conjointement à UNC5A promeut la neurogénèse; FANCC et UNC5A colocalisent dans les neurites cellulaires. Globalement, nos résultats suggèrent que FANCC par le biais de UNC5A joue un rôle important dans la mort cellulaire et la croissance axonale. Ainsi, une dérégulation de l’interaction FANCC-UNC5A chez les patients souffrent de FA pourrait expliquer certains aspects cliniques notamment les anomalies de développement. / Fanconi anemia (FA) is a recessive syndrome characterized by diverse clinical symptoms including progressive bone marrow failure, various congenital abnormalities, chromosomal instability and predisposition to malignancies. Studies of the canonical FA pathway have focused on the mechanism of repair of DNA cross-linking damage. However, some data suggest that FA proteins may have other functions besides DNA damage signaling events, and these functions may explain some of the disease phenotypes such as defects in hematopoiesis and congenital malformations. For instance, FANCC, which is predominantly located in the cytoplasm, has multifunctional roles and is an anti-apoptotic regulator. In addition to its function as a repulsive mediator in neural development, UNC5A, the receptor for the axon guidance molecule Netrin-1, has also been proposed to be a “dependence receptor” that triggers apoptosis in the absence of its ligand. Here, we identified a novel interaction of UNC5A with FANCC and showed that FANCC positively regulates UNC5A-mediated apoptosis. Under conditions of FANCC overexpression, apoptosis is decreased, whereas the absence of a functional FANCC protein increases UNC5A-mediated apoptosis. Furthermore, FANCC and UNC5A function as a complex in neurogenesis; they co-localize at synapses formed by neurites, and FANCC is required for the promotion of neuronal outgrowth by UNC5A. Based on these findings, we propose that FANCC plays a key role in tissue morphogenesis by either delaying UNC5A-mediated apoptosis or positively impacting the expression of UNC5A. Under FANCC-deficient conditions, dysregulation of the UNC5A signal pathway can lead to developmental defects such as those seen in FA patients.

La mort cellulaire programmée est un phénomène essentiel retrouvé chez pratiquement toutes les formes de vie. Chez les mammifères, l'apoptose est une forme de mort importante et très étudiée qui a beaucoup influencé l'étude de la mort cellulaire programmée chez les végétaux. Si la plupart des régulateurs et des effecteurs de l'apoptose animale ne sont pas retrouvés chez les plantes, la similarité de certaines caractéristiques morphologiques et biochimiques laisse croire que certains sentiers de régulation sont évolutivement conservés entre ces deux règnes. Dans ce travail, nous démontrons que les homologues végétaux de BI-1, l'un des rares régulateurs de l'apoptose retrouvé chez les plantes, sont très bien conservés structurellement; certaines caractéristiques déduites des BI-1 végétaux permettent de supposer un mode d'action dans la régulation de la mort. Aussi, nous montrons que les homologues végétaux de BI-1 inhibent l'apoptose induite par la surexpression de Bax chez les cellules humaines 293. Le développement et la caractérisation d'un modèle de mort cellulaire induite par Bax chez les végétaux ont aussi été entrepris. Dans un premier temps, l'expression transitoire de Bax murin par infiltration d'Agrobacterium dans des feuilles de tabac n'a pas causé de phénotype de mort. Par contre, des lignées stables de cellules de tabac BY-2 exprimant constitutivement Bax, seul ou en fusion avec les rapporteurs GFP ou GUS, présentent une mort cellulaire prématurée. La mort de ces cellules est accompagnée d'un changement de l'aspect des cultures, de la fragmentation de l'ADN génomique et de modifications morphologiques caractéristiques des cellules végétales en PCD. Ces lignées ont aussi une sensibilité accrue à la mort causée par un milieu de culture sans sucrose. L'ensemble de ces données, remis dans un contexte plus large, renforce l'idée de l'existence une forme de mort évolutivement ancienne à l'origine de toutes les formes de PCD retrouvées aujourd'hui.

L'expression génique régule essentiellement la fonction d'une cellule. La régulation précise de l'expression génique par différents régulateurs, tels que les miARN, est importante pour les processus biologiques dans différents organismes, notamment le modèle de nématode *Caenorhabditis elegans*. Les miARN sont des courts ARN non-codants d'environ 21 nucléotides impliqués dans la régulation post-transcriptionnelles des gènes en se liant à la région 3'UTR des ARN. Le pri-miARN, transcrit par l'ARN polymérase II, est traité par le complexe microprocesseur (Drosha-DGCR8) dans le noyau, puis le pré-miARN est transporté vers le cytoplasme. Le pré-miARN, clivé par Dicer, produit un petit duplex d'ARN, composé d'une paire de miARN matures (brin guide), qui forme le miRISC lorsque chargé à l'Argonaute avec GW-182/TNRC6, et de miARN passagers (brin étoile), qui est éliminé. Le facteur clé fonctionnel dans la régulation post-transcriptionnelle des gènes est l'Argonaute, composé de quatre domaines majeurs : N-terminal, PAZ, MID et PIWI. En fonction de certains acides aminés du domaine PIWI, ressemblant à RNase H, l'Argonaute peut agir comme une endonucléase en coupant les liens phosphodiesters des ARN, ce qu'on appelle activité de découpe, activité activée par la tétrade catalytique DEDH en présence de cations divalents (Mg+2, Mn+2) et d'une complémentarité presque parfaite ou parfaite entre le court ARN et la cible. Bien que l'activité de découpe de l'Argonaute se soit révélée particulièrement essentielle dans d'autres voies de courts ARN non codants (piARN, siARN) chez différents organismes ainsi que dans la voie des miARN chez les plantes, la contribution de l'Argonaute-slicer dans la voie des miARN chez les systèmes animaux reste peu étudiée puisque, notamment, il n'y a pas de complémentarité parfaite entre les miARN et les cibles chez les animaux, et donc, les Argonautes slicers chez les animaux ne participent pas au clivage de la cible. Néanmoins, les Argonautes chez les animaux portent toujours la tétrade catalytique, responsable de l'activité de découpe. Des chercheurs ont montré que les Argonautes sont essentielles dans la production de miARN spécifiques (miR-451, miR-486) chez les vertébrés et certains groupes ont également montré le rôle de l'Argonaute dans la voie des miARN dans les cellules. Malgré ces études, à ce jour, aucune publication n'a montré la contribution plus large et la pertinence des Argonautes endogènes possédant une activité de découpe spécifiques des miARN chez les animaux. Dans ce travail de thèse, nous abordons l'objectif de « l'Argonaute-slicer » dans la voie des miARN. En prolongement du travail publié, réalisé en utilisant le système transgénique dans notre laboratoire par Bouasker et Simard, il était impératif pour nous de comprendre la contribution des Argonautes portant le motif DEDH endogènes. L'objectif de ma thèse était d'investiguer la contribution globale des Argonautes qui possède la tétrade catalytique dans la voie des miARN. En utilisant le système CRSPR-Cas9, nous avons généré des mutants d'Argonautes, en modifiant leur résidus catalytiques. Ensuite, nous avons utilisé des techniques de génétique et de biologie moléculaire pour aborder notre objectif dans le système modèle de *C. elegans*, portant des Argonautes exclusivement impliqués dans la voie des miARN. Au cours de l'étude, nous avons découvert que la contribution physiologique et moléculaire de l'activité de découpe des Argonautes endogènes dans la voie des miARN n'est pas essentielle pour la viabilité, contrairement à l'étude transgénique. Bien que dans des contextes spécifiques et des conditions stressantes, les mutants aient montré des changements significatifs dans les phénotypes physiologiques et moléculaires, notre analyse confirme un rôle modéré de l'Argonaute slicer dans les voies canoniques des miARN en conditions de laboratoire. De plus, ce travail montre également de façon évidente l'importance de l'analyse de la fonction moléculaire d'un gène endogène dans un organisme modèle par rapport à l'utilisation d'un système de surexpression transgénique *in cellulo* ainsi que dans un organisme modèle. Dans l'ensemble, cette étude systémique délimite la pertinence des résidus catalytiques des Argonautes endogènes dans la voie des miARN dans un système modèle de nématode établi et largement reconnu. / The gene expression essentially regulates the function of a cell. The precise regulation of gene expression using different regulators, such as miRNA, is essential for the biological processes in different organisms, including the nematode model organism *Caenorhabditis elegans*. The miRNAs are about 21 nt long short non-coding RNAs involved in PTGS. The production of miRNAs involves multiple sequential steps in the nucleus and cytoplasm, and then the mature miRNA binds to the complementary 3'UTR to regulate gene expression. The pri-miRNA, transcribed by RNA polymerase II, is processed by the microprocessor complex (Drosha-DGCR8) in the nucleus, and thereafter pre-miRNA is transported to the cytoplasm. Pre-miRNA, cleaved by Dicer in the cytoplasm, produces a small RNA duplex, which consists of a pair of mature miRNA (guide strand) and passenger miRNA (star strand). The passenger strand is discarded, and mature miRNA-loaded Argonaute, along with GW-182/ TNRC6, forms miRISC, binds to the target, and brings upon various factors to trigger PTGS. The functional key factor in PTGS is Argonaute, which is made up of four major domains: N-terminal, PAZ, MID, and PIWI. Depending on the amino acids at particular positions in the PIWI domain, resembling RNase H, Agoanute can act as an endonuclease to cleave phosphodiester bonds in the RNA backbone. This catalytic function of Argonaute is called slicer activity. In the presence of divalent cations (Mg+2, Mn+2), a specific catalytic tetrad (DEDH) carrying Argonaute can cleave target mRNA due to near-perfect or perfect complementarity between small RNA and target. Even though the slicing activity of Argonaute has been found particularly essential in other small RNA pathways (pi-RNA, si-RNA) in different organisms as well as in miRNA pathway in plants, the contribution of slicer-Argonaute in miRNA pathway in animal systems remains understudied due to varying limiting factors. Notably, there is the absence of perfect complementarity between miRNAs and targets in animals, compared to plants, and therefore, the slicer Argonautes in animals do not take part in target cleavage during PTGS. Nonetheless, Argonautes, involved in the miRNA pathway in animals, still carry the catalytic tetrad, which is responsible for the slicer activity. Researchers have shown that slicer Argonaute is essential in the production of specific miRNAs (miR-451, miR-486) in vertebrates, and some groups also showed the role of slicer Argonaute in miRNA pathway *in cellulo*. Despite these studies, to date no reports showed the broader contribution and relevance of the function of miRNA-specific endogenous slicer-Argoanutes in animals. In this doctoral work, we set out to address the purpose of the slicer-Argoanutes in the miRNA pathway. In continuation of the published work done previously using the transgenic system in our lab by Bouasker and Simard, it was imperative for us to understand the contribution of endogenous slicer Argonautes. The aim of my Ph.D was to investigate the comprehensive contribution of endogenous Argonautes, carrying catalytic tetrad, in the miRNA pathway. Using current gene editing technology, CRSPR-Cas9 system, we generated Argonaute mutants by altering catalytic residue. Then, we employed genetics and molecular biology techniques to address our aim in the C. elegans model system, carrying Argonautes exclusively implicated in the miRNA pathway. During this study, we found out that the physiological and molecular contribution of endogenous slicer-Argonautes in the miRNA pathway is not essential for viability, contradictory to the transgenic research. Even though in specific backgrounds and stressful conditions, mutants showed significant changes in physiological and molecular phenotypes, our analysis confirms a moderate role of slicer-Argonaute in canonical miRNA pathways in laboratory condition. Moreover, this work also glaringly shows the importance of analysis of the molecular function of an endogenous gene in a model organism compared to the usage of a transgenic overexpression system *in cellulo* as well as in a model organism. Overall, this systemic study delineates the relevance of slicing residues of endogenous Argonautes in the miRNA pathway in an established and widely recognized nematode model system.