Dans le noyau des cellules eucaryotes, l’ADN est associé aux histones pour former la chromatine. Les extrémités terminales des histones peuvent subir un grand nombre de modifications posttraductionnelles réversibles (méthylation, acétylation, phosphorylation, ubiquitinylation…). Certaines de ces marques épigénétiques définissent des domaines chromatiniens particuliers du noyau. Les triméthylations des lysines 9 et 27 de l’histone H3 (H3K9me3 et H3K27me3) correspondent respectivement à des domaines d’hétérochromatine constitutive et d’hétérochromatine facultative. Les proteines qui possèdent un chromo-domaine sont capables de se lier à des lysines méthylées, et permettent de recruter des complexes qui ont une activité enzymatique ou mécanique sur la chromatine. Les protéines de la famille CBX (ChromoBoX) possèdent toutes un chromodomaine, elles sont subdivisées en 2 groupes: les protéines du groupe HP1 (CBX1, CBX3 et CBX5) et celles du groupe Polycomb (CBX2, CBX4, CBX6, CBX7 et CBX8) qui se fixent respectivement sur H3K9me3 et H3K27me3, respectivement. Afin de mieux comprendre comment s’organise la chromatine au niveau des régions hétérochromatiques, nous avons purifié, en condition native, les complexes associés à ces 8 protéines dans des cellules humaines en culture. Pour ce faire, nous avons opté pour la purification d’affinité en tandem (TAP). Les protéines co-éluées ont été identifiées par spectrométrie de masse. Nos résultats confirment que, d’une part les protéines du groupe Polycomb sont associées au complexe PRC1 (Polycomb Repressive Complex 1). Toutefois, ces protéines sont mutuellement exclusives au sein du complexe PRC1, indiquant qu’il existe plusieurs complexes PRC1 de composition distincte dans la cellule. D’autre part, de nouveaux partenaires associés aux protéines du groupe HP1 ont été identifiés. La mise au point et le développement de la technologie TAP sur des cellules humaines en culture nous ont permis de purifier des complexes associés à la chromatine. Cette technique demeure un outil biochimique efficace pour la purification de complexes protéiques / In the nucleus of eukaryotic cells, DNA is wrapped around histones to form chromatin. The terminal ends of histones may undergo many reversible post-translational modifications (methylation, acetylation, phosphorylation, ubiquitinylation...). Some of these epigenetic marks define specific chromatic regions in the nucleus. The tri-methylation of lysines 9 and 27 of histone H3 (H3K9me3 and H3K27me3) correspond respectively to constitutive and facultative heterochromatin. Chromo-domain containing proteins can bind to methylated lysines, and can recruit complexes having enzymatic or mechanical activity on chromatin. All the members of the CBX (ChromoBoX) family contain a chromodomain, they are divided into 2 groups: the HP1 group (CBX1, CBX3 and CBX5) and the Polycomb group (CBX2, CBX4, CBX6, CBX7 and CBX8) able to bind to H3K9me3 and H3K27me3, respectively. To better understand how the chromatin is organized in heterochromatic regions we purified, in native condition, the complexes associated with these 8 proteins from human cells in culture. To this end, we opted for the tandem affinity purification (TAP). The co-eluted proteins were identified by mass spectrometry. Our results confirm that firstly, Polycomb group proteins are involved in PRC1 complex (Polycomb Repressive Complex 1). However, these proteins are mutually exclusive in the PRC1 complex, indicating that several PRC1 of distinct compositions co-exist in the cell. On the other hand, new partners associated with HP1 group were identified. The development of the TAP technology to cultured human cells allowed us to purify complexes associated with chromatin. This technique remains an effective tool for the biochemical purification of protein complexes.

Les ribosomes sont les molécules présentes dans toutes les cellules du règne vivant. Ils résultent de l'assemblage d'ARN ribosomiques (ARNr) et de protéines ribosomiques, constituant des particules ribonucléoprotéiques (RNP). Ils jouent un rôle majeur en décodant l'information génétique contenue dans les ARN messagers (ARNm) afin de les traduire en protéines lors du processus de traduction. La production des ribosomes chez les eucaryotes est initiée par la transcription par l'ARN pol I d'un pré-ARNr ribosomique (pré-ARNr) précurseur des ARNr matures 18S, 5.8S et 25S/28S, qui sera modifié chimiquement et digéré par des endo- et exoribonucléases pour aboutir aux ARNr matures. Le pré-ARNr en cours de synthèse s'associe avec des protéines ribosomiques, des petites particules ribonucléoprotéiques (snoRNP) et des protéines dites " non ribosomiques " conduisant à l'assemblage de la particule 90S initiale. Cette particule est ensuite scindée en particules pré-ribosomiques pré-40S et pré-60S, qui vont suivre des voies de maturation indépendantes pour aboutir aux sous unités ribosomiques 40S et 60S mature. La production des ribosomes eucaryotes requiert l'intervention de plus de 200 protéines dites " non ribosomiques ", qui s'associent avec les particules pré-ribosomiques et sont absentes des ribosomes cytoplasmiques matures. Des données obtenues en collaboration suggèrent que cinq protéines non-ribosomiques impliquées dans les étapes précoces de la formation de la grande sous-unité ribosomique, Npa1p, Npa2p, Nop8p, Dbp6p et Rsa3p forment un complexe en l'absence d'ARN ribosomique. Il s'agirait du plus gros complexe connu composé uniquement de protéines, requis pour la formation des sous unités ribosomiques. Nop8p contient un domaine de liaison à l'ARN et pourrait permettre de fixer le complexe au pré-ARNr, et Dbp6p est une potentielle ARN hélicase. Les composants du complexe pourraient constituer des régulateurs et/ou des cibles de Dbp6p. Les objectifs de ma thèse étaient de déterminer si les protéines Npa1p, Npa2p, Nop8p, Dbp6p et Rsa3p forment effectivement un complexe en dehors des pré-ribosomes, de caractériser les interactions protéine/protéine au sein du complexe et sa structure et d'étudier les fonctions de ses composants. Au cours de ma thèse, j'ai mis en évidence que Nop8p, Dbp6p et Rsa3p sont associées aux pré-ARNr 35S, 32S et 27SA2 et font donc partie des mêmes particules pré-ribosomiques que Npa1p et Npa2p. Les protéines Npa1p, Npa2p, Nop8p et Rsa3p forment un complexe stable, qui persiste une fois dissocié des particules pré-ribosomiques. L'observation au microscope électronique à transmission des complexes purifiés révèle la présence de deux types de complexes de tailles différentes. Par ailleurs, l'hélicase Dbp6p interagit avec ce complexe, mais de manière plus labile car elle en est dissociée en présence d'une forte concentration en magnésium. Les analyses de déplétion de chaque membre du complexe montrent que l'absence de Nop8p n'empêche pas les interactions entre Npa1p, Npa2p et Rsa3p, et que l'absence de Npa2p n'empêche pas les interactions entre Npa1p, Nop8p et Rsa3p. En revanche, l'absence de Npa1p déstabilise totalement le complexe. La perte d'expression de Dbp6p affecte également l'efficacité de co-précipitation de ces pré-ARNr, mais dans une moindre mesure. En parallèle, nous avons débuté une étude des interactions protéine/protéine qui s'établissent entre les membres du complexe. Des données préliminaires suggèrent des interactions directes entre Npa1p, Npa2p et Dbp6p et entre Npa1p et Rsa3p. Nous avons également commencé à effectuer des tests d'activité in vitro de l'hélicase Dbp6p qui suggèrent qu'elle présente une activité ATPase. Enfin, nous avons également localisé le site de fixation sur le pré-ARNr de Npa1p situé à proximité de la protéine ribosomique Rpl3, suggérant qu'ils pourraient collaborer dans la compaction du pré-ARNr. / Ribosomes are huge molecular complexes present in all cells of living things. They result from the assembly of ribosomal RNA (rRNA) and ribosomal proteins, constituting ribonucleoproteins (RNP). They play a major role in decoding the genetic information contained in messenger RNA (mRNA) to translate them into proteins during translation. Production of eukaryotic ribosomes is initiated by transcription of a pre-ribosomal rRNA (pre-rRNA) precursor of mature 18S rRNA, 5.8S and 25S / 28S by RNA polymerase I, which is chemically modified and trimmed with endo- and exoribonucleases, in order to form mature rRNAs. The nascent pre-rRNA associates with ribosomal proteins, small ribonucleoprotein particles (snoRNP) and proteins called "non-ribosomal", leading to the assembly of an initial pre-90S particle. This particle is then split into pre-ribosomal pre-40S and pre-60S particles that follow independent maturation pathways leading to mature ribosomal 40S and 60S subunits. Synthesis of eukaryotic ribosomes requires the intervention of more than 200 non-ribosomal proteins that associate with pre-ribosomal particles and are absent from mature cytoplasmic ribosomes. Data obtained in collaboration suggest that five non-ribosomal proteins involved in the early maturation steps of the large ribosomal subunit Npa1p, Npa2p, Nop8p, Dbp6p and Rsa3p form a complex in the absence of ribosomal RNA. It would be the biggest and only known protein module required for the formation of ribosomal subunits. Nop8p contains a RNA binding domain and could tether the complex with pre-rRNA, and Dbp6p is a putative RNA helicase. Components of the complex may constitute regulators and / or Dbp6p targets. The objectives of my thesis were to determine whether Npa1p, Npa2p, Nop8p, Dbp6p and Rsa3p can form a complex outside the context of pre-ribosomes, characterize protein / protein interactions within the complex, and also to study its structure and function. During my thesis, I demonstrated that Nop8p, Dbp6p and Rsa3p are associated with 35S, 32S and 27SA2 pre-rRNAs, and are therefore constitutive of the same pre-ribosomal particles than Npa1p and Npa2p. Npa1p, Npa2p, Nop8p and Rsa3p can form a stable complex that exists once dissociated pre-ribosomal particles. Electron microscopic observation reveal two types of complexes. Furthermore, Dbp6p helicase can interact with this complex, but in a more labile fashion, since it is dissociated in presence of a high concentration of magnesium. Depletion experiments show that the absence of Nop8p does not prevent interactions with Npa1p, Npa2p and Rsa3p, and that the absence of Npa2p does not prevent interactions with Npa1p, Nop8p and Rsa3p. However, the absence of Npa1p strongly destabilizes the complex. Loss of expression of Dbp6p also affects the efficiency of co-precipitation of 35S, 32S and 27SA2 pre-rRNAs, but to a lesser extent. In parallel, we began a study of protein / protein interactions between members of the complex. Preliminary data suggest a direct interaction between Npa1p or Npa2p and Dbp6p, and Npa1p and Rsa3p. We also began conducting an in vitro study of Dbp6p that suggest it has a helicase activity. Finally, by CRAC analysis we show that Npa1p binds adjacent to large ribosomal protein Rpl3 on 25S rRNA, and could collaborate with it in local rRNA folding.

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Les études de protéomique fonctionnelle nous indiquent que probablement aucune protéine n'accomplit une activité biologique ou acquiert sa conformation active de façon complètement autonome. La fonctionnalité des protéines est donc acquise via les interactions protéine-protéine. Pensons par exemples aux interactions protéine-protéine impliquées dans les cascades de signalisation cellulaire, aux complexes de transcription, de traduction etc. Vu la réelle importance des interactions protéine-protéine, la recherche en biologie est présentement en mouvance vers un nouveau courant, soit l'étude des interactions protéiniques ou l'interactomique. Les interactions inter protéine impliquant des super-hélices ont été étudiées chez la levure et il a été avancé qu'une protéine sur 11 interagirait avec d'autres protéines en utilisant un domaine structuré en super-hélice. Plus de 5% des cadres de lecture ouvert (ORFs) du génome de la levure détiendrait l'information modulant des motifs en super-hélice. La connaissance des structures en super-hélice est importante pour le développement, selon le cas, de diverses molécules d'importance pharmacologique pouvant moduler la dynamique d'assemblage, la protection ou le maintien de ces super-hélices. Pour étudier comment les protéines interagissent entre elles via les super-hélices, nous devons étudier les caractéristiques inhérentes de ces structures. Considérant la quantité impressionnante de super-hélices dans l'interactome et la quantité non négligeable de temps nécessaire pour élucider ces structures par une approche expérimentale il est évident que nous avons besoin de méthodes efficaces, rapides, faciles d'utilisation et facilement implémentables pour obtenir les modèles structuraux de toutes les catégories de super-hélices impliquées dans l'interactome en son entier. En se basant sur des postulats analogues à ceux que H.F.C. Crick avait émis en 1953, nous avons posé comme hypothèse que de maintenir chaque brin formant la super-hélice à une distance respectant celle retrouvée dans la structure de super-hélices préalablement déterminées expérimentalement serait suffisant pour générer ces mêmes super-hélices. Afin d'évaluer notre hypothèse, nous avons créé un protocole informatique utilisant un minimum de paramètres et nous l'avons testé en générant les domaines en super-hélices de huit protéines dont les structures furent déterminées par des méthodes expérimentales. Nos modèles générés sont très similaires aux structures expérimentales correspondantes (RMSD majoritairement<1) et nous avons trouvé une excellente similitude des conformations des chaînes latérales composant l'interface. De plus, nos modèles nous permettent d'identifier une certaine dynamique spécifique aux multimères et même à des résidus précis ayant une activité biologique démontrée crucial dans l'interactomique de ces super-hélices.

Les alphabets structuraux sont des collections de motifs structuraux répétés dans les structures de protéines. Durant ma thèse, j'ai utilisé l'un d'eux, les blocs protéiques (BPs), pour diverses applications comme la prédiction, la comparaison et l'analyse de structures de protéines. J'ai d'abord étudié les variations structurales observées au sein de structures ayant des séquences protéiques identiques et au cours de simulations de dynamique moléculaire. Les résultats de ces analyses ont été synthétisés sous la forme de matrices de substitution et ont montré des similitudes surprenantes avec les précédentes matrices établies pour les protéines homologues ou les ensembles RMN. La méthode kPRED qui permet de prédire le squelette des protéines sous forme de BPs a été amélioré en prenant en compte les structures locales voisines. La nouvelle version privilégie aussi les informations provenant des protéines homologues lorsqu'elles sont disponibles, atteignant une précision moyenne de 66,3% sur un jeu de données test. J'ai aussi étendu la portée de la base de données PENTAdb pour couvrir l'ensemble des structures de la PDB. Je montre que l'effet de cette augmentation de 950% dans le contenu de PENTAdb améliore notre compréhension de la relation séquence-structure au niveau d'un pentapeptide. J'ai également utilisé PB-ALIGN, un outil de comparaison rapide et efficace de structures des protéines, pour comparer toutes les structures protéiques dans la PDB entre elles et pour étudier les similitudes structurales. J'ai généré une grande collection de données d'alignement et j'explore son usage pour l'annotation fonctionnelle et l'identification de possibles relations évolutives. / Structural motifs found in protein structures. They help in approximating protein structure as a 1D string with minimal loss of structural information. Here I have employed a widely used structural alphabet called Protein Blocks (PB) for various applications like predicting, comparing and analyzing protein structures. PBs were used to study the structural variations in proteins with identical primary structure and also during the course of molecular dynamics (MD) simulations. The results from these analyses were summarized in the form of substitution matrices and showed striking similarities to previously established matrices for homologous proteins and NMR ensembles. I improved kPRED, a knowledge-based prediction of protein backbone in terms of PBs, by taking into consideration the neighboring local structures. The new version of the algorithm also privileges structural information from homologous proteins when available reaching an average accuracy of 66.3% on a benchmark dataset. The scope of the PENTAdb database has been expanded to cover the entire protein structure space in an automated manner. I show that the effect of this 950% increase in the contents of PENTAdb improves our understanding of the sequence-structure relationship at the pentapeptide level. I also used PB-ALIGN, a fast and efficient protein structure comparison tool, to compare all protein structures in PDB in an all-vs-all manner and to investigate PB-based structural similarities. This generated a huge collection of alignment data and I discuss its use for functional annotation and identification of possible evolutionary relationships.

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Ce travail de thèse est une étude in silico des structures tridimensionnelles des protéines, qui a fait l’objet de 5 publications scientifiques.D’une manière plus précise, les travaux s’articulent autour de trois thématiques originales et complémentaires dans le domaine de la bioinformatique structurale : la caractérisation d’un nouvel échelon de description de la structure des protéines (les unités protéiques), intermédiaire entre les structures secondaires et les domaines.Le deuxième axe de cette thèse porte sur le développement d’une nouvelle méthode de prédiction des structures protéiques, appelée ORION.Cette méthode permet une détection accrue d’homologues lointains grâce à la prise en compte de l’information structurale sous forme d’un alphabet structural (les blocs protéiques).Une seconde version améliorée a été rendue accessible à la communauté scientifique par le biais d’une interface web : http://www.dsimb.inserm.fr/ORION/.Le dernier axe de cette thèse, s’oriente autour du développement d’outils, pour la prédiction de l’orientation et l’évaluation de la membrane dans les structures de protéines membranaires effectué dans le cadre de plusieurs collaborations.Les outils développés (ANVIL et MAIDEN) ont été mise à la disposition de la communauté scientifique par le biais d’une interface web appelée OREMPRO et accessible à l’adresse suivante : http://www.dsimb.inserm.fr/OREMPRO/. / This thesis deals with three complementary themes in the field of structural bioinformatics : the characterization of a new level of description of the protein structure (Protein Units) which is an intermediate level between the secondary structures and protein domains. The second part focus on the development of a new method for predicting protein structures,called ORION. It boosts the detection of remote protein homologs by taking into account thestructural information in the form of a structural alphabet (Protein Blocks). A second improved version was made available to the scientific community through a web interface : http://www.dsimb.inserm.fr/ORION/. The last part of this thesis describes the collaborative development of new tools for predicting and assessing the orientation of proteins in the membrane. The two methods developed (ANVIL and MAIDEN) were made available to the scientific community through a webinterface called OREMPRO: http: / /www.dsimb.inserm.fr/OREMPRO.

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Les qualités analytiques de la spectrométrie de masse à résonance cyclotronique ionique et à transformée de Fourier, combinée à une source d'électronébulisation (ESI-FT-ICR) ont été mises à profit pour l'étude d'interactions non-covalentes dans des assemblages protéiques. Dans une première partie, l'utilisation de cette technique pour la détection de complexes protéiques intacts a été développée sur le système constitué de la créatine kinase (CK) et de ses ligands ADP et ATP, conduisant à l'observation de ces complexes en phase gazeuse. Les parts spécifiques et non spécifiques de ces interactions ont été séparées par un modèle statistique, conduisant à la détermination des constantes de dissociation (K1,ADP=11.8 ± 1,5 μM, K2,ADP=48 ± 6 μM, K1,ATP=27 ± 7 μM, K2,ATP=114 ± 27 μM ) qui sont en accord avec la littérature. Dans une seconde partie, des techniques pour l'étude de l'accessibilité de surface de complexes de protéines par modification chimique en solution, aussi bien réversibles (échanges H/D) qu'irréversibles (modification spécifique d'histidine et de lysine par le DEPC) ont été mises au point et appliquées. Les sites de modification ont été localisés soit par une approche « bottom-up » (digestion enzymatique suivie d'une mesure de masse des peptides résultants) soit par une approche « top-down » (fragmentation en phase gazeuse de la protéine intacte par dissociation par capture d'électrons [ECD]). Dans le cadre de l'instrumentation actuelle, cette dernière approche a conduit à des résultats pour des protéines allant jusqu'à 17 kDa et pourrait être étendue jusqu'à des protéines de 25 kDa. Ces différentes stratégies analytiques ont été appliquées à des oligomères de la protéine du prion (PrP) obtenus par dénaturation thermique partielle in vitro de l'espèce monomérique. L'accroissement de l'incorporation de deutérium dans certaines régions de la forme oligomèrique (par rapport au monomère) reflète un dépliement partiel de la protéine, en particulier au niveau d'une hélice .

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