La leucémie lymphoïde représente environ 30% des cas de cancer chez l’enfant. Elle est souvent causée par des réarrangements chromosomiques impliquant des gènes encodant des facteurs de transcription, qui contrôlent des programmes génétiques complexes. Par exemple, LMO2 (LIM-only 2) est un facteur de transcription oncogénique fréquemment exprimé de façon aberrante dans les leucémies lymphoblastiques aigues des cellules T (T-ALL). Dans l’hématopoïèse normale, LMO2 est essentiel à la génération des cellules souches hématopoïétiques à l’origine de toutes les cellules sanguines. D’ailleurs, certaines cellules leucémiques possèdent des propriétés normalement réservées aux cellules souches hématopoïétiques. Ainsi, l’étude de la fonction de LMO2 dans les cellules souches hématopoïétiques peut être pertinente autant dans le contexte hématopoïétique normal que leucémique. Afin de mettre en évidence de nouvelles fonctions moléculaires pour LMO2, j’ai choisi d’identifier les protéines qui s’y associent. En plus de ses partenaires connus, j’ai identifié plusieurs protéines de transcription/remodelage de la chromatine, en accord avec son rôle transcriptionnel. Plusieurs nouvelles fonctions potentielles ont été révélées, indiquant que cette protéine adaptatrice pourrait faire partie de complexes non transcriptionnels, régulant d’autres processus cellulaires. Les oncogènes comme LMO2 pourraient être des régulateurs à large spectre. Particulièrement, j’ai identifié des interactions entre LMO2 et des protéines de réplication de l’ADN. J’ai montré que LMO2 contrôle la réplication de l’ADN dans les cellules hématopoïétiques, et possiblement durant la leucémogenèse, indépendamment de son rôle transcriptionnel. Ensemble, ces études ont donc permis de révéler de nouvelles fonctions pour LMO2, et pourraient servir de paradigme pour d’autres facteurs de transcription oncogéniques, particulièrement aux autres protéines de la famille LMO, qui sont aussi des oncogènes puissants. / Lymphoid leukemia represents about 30% of childhood cancer cases. It is often caused by chromosomal rearrangements involving genes coding for transcription factors, controlling complex genetic programs. As an example, the oncogenic transcription factor LMO2 (LIM-only 2) is often aberrantly expressed in T cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL). In normal hematopoiesis, LMO2 is essential for the generation of hematopoietic stem cells that give rise to all blood cells. Moreover, some leukemic cells possess properties normally reserved to hematopoietic stem cells. Thus, studying the role of LMO2 in hematopoietic stem cells could be relevant to the contexts of normal hematopoiesis and leukemogenesis. To reveal new molecular functions for LMO2, I chose to identify its associated proteins. In addition to its known protein partners, I identified many proteins involved in transcription/chromatin remodeling, in agreement with its transcriptional role. In addition, several new potential functions have been revealed, indicating that this scaffold protein could be part of non-transcriptional protein complexes, regulating different cell processes. Oncogenes like LMO2 could be master regulators in normal hematopoietic and leukemic cells. Particularly, I identified protein-protein interactions between LMO2 and DNA replication proteins. I demonstrated that LMO2 controls S phase progression in hematopoietic cells, independently of its association in transcriptional complexes. LMO2 overexpression in mice induces T-ALL and affects specifically the cell cycle status of thymocyte progenitors, which are targets of transformation by LMO2. Thus, LMO2 promotes DNA replication in hematopoietic cells, and possibly in leukemogenesis. Together, these studies allowed to reveal new functions for LMO2, and could serve as a paradigm for other oncogenic transcription factors, especially for other LMO proteins which are all potent oncogenes.

La résistance bactérienne aux antibiotiques est de nos jours une préoccupation majeure aux acteurs du monde de la santé publique. L’identification de nouvelles cibles bactériennes en vue de développer de nouveaux antibiotiques est donc nécessaire. La paroi bactérienne est une bonne cible car l’inhibition de sa biosynthèse cause la mort des bactéries. De récents travaux de notre laboratoire ont identifié de nombreux nouveaux facteurs importants pour la biosynthèse de la paroi chez Escherichia coli. L’un de ces facteurs renommé ElyC a un domaine DUF218 extrêmement conservé à travers les espèces bactériennes. L’absence du gène elyC entraîne la lyse bactérienne à température pièce. Des études bioinformatiques indiquent qu’ElyC est une protéine membranaire avec deux domaines transmembranaires et un domaine conservé DUF218 de fonction inconnue. Étant donné que les protéines agissent souvent en complexes, nous avons émis l’hypothèse qu’ElyC interagit avec d’autres protéines afin d'exécuter sa fonction biologique. Le but de mon projet est de déterminer la topologie d’ElyC et d’identifier ses partenaires protéiques. L’étude de la topologie a été faite par l’essai de modification de cystéine sur des souches exprimant individuellement le facteur ElyC avec un résidu cystéine en position N-terminale, dans la boucle ou en position C-terminale. Les partenaires protéiques d’ElyC ont été isolés par immuno-précipitation et identifiés par spectrométrie de masse. Les résultats obtenus ont révélé qu’ElyC est une protéine membranaire chez E. coli et est impliquée dans l'assemblage de l'enveloppe bactérienne, dans la chaîne de transport d'électrons et la phosphorylation oxydative. Ils ont permis aussi de confirmer l’existence d’un lien entre ElyC et le stress oxydatif. Cependant les résultats pour la détermination de la topologie restent à être clarifiés. / Bacterial resistance to antibiotics is a major concern for public health. The identification of new bacterial targets for the development of new antibiotics is required. The bacterial cell wall is a good target because the inhibition of its biosynthesis causes the death of bacterial cells. Recent studies from our laboratory have identified many new important factors for cell wall biosynthesis in Escherichia coli. One of these factors renamed ElyC has a DUF218 domain highly conserved across bacterial species. The absence of elyC leads to bacterial lysis at room temperature. Bioinformatic studies indicate that ElyC is a membrane protein with two transmembrane domains and a conserved domain of unknown function DUF218. Given that proteins often act in complexes, we formulated the hypothesis that ElyC interacts with other proteins to play its biological role. The goal of my project is to determine the topology of ElyC and identify its protein partners. The study of the topology has been done by the cysteine modification assay with strains individually expressing ElyC with a cysteine residue at the N-terminal position, in the loop or at the C-terminal position. ElyC protein partners have been isolated by immuno-precipitation and identified by mass spectrometry. The results obtained revealed that ElyC is a membrane protein in E. coli and that it is involved in the bacterial envelope assembling, in the electron transport chain and in the oxidative phosphorylation. They also confirmed the existence of a link between ElyC and oxidative stress. However, the results for the determination of the topology remain to be clarified.

Même si le docking protéine-protéine devient un outil incontournable pour répondre aux problématiques biologiques actuelles, il reste cependant deux difficultés inhérentes aux methodes actuelles: 1) la majorité de ces méthodes ne considère pas les possibles déformations internes des protéines durant leur association. 2) Il n'est pas toujours simple de traduire les informations issues de la littérature ou d'expérimentations en contraintes intégrables aux programmes de docking. Nous avons donc tenté de développer une approche permettant d'améliorer les programmes de docking existants. Pour cela nous nous sommes inspirés des méthodologies mises en place sur des cas concrets traités durant cette thèse. D'abord, à travers la création du complexe ERBIN PDZ/Smad3 MH2, nous avons pu tester l'utilité de la Dynamique Moléculaire en Solvant Explicite (DMSE) pour mettre en évidence des résidus importants pour l'interaction. Puis, nous avons étendu cette recherche en utilisant divers serveurs de docking puis la DMSE pour cibler un résultat consensus. Enfin, nous avons essayé le raffinage par DMSE sur une cible du challenge CAPRI et comparé les résultats avec des simulations courtes de Monte-Carlo. La dernière partie de cette thèse portait sur le développement d'un nouvel outil de visualisation de la surface moléculaire. Ce programme, nommé MetaMol, permet de visualiser un nouveau type de surface moléculaire: la Skin Surface Moléculaire. La distribution des calculs à la fois sur le processeur de l'ordinateur (CPU) et sur ceux de la carte graphique (GPU) entraine une diminution des temps de calcul autorisant la visualisation, en temps réel, des déformations de la surface moléculaire. / Protein-protein docking has become an extremely important challenge in biology, however, there remain two inherent difficulties: 1) most docking methods do not consider possible internal deformations of the proteins during their association; 2) it is not always easy to translate information from the literature or from experiments into constraints suitable for use in protein docking algorithms. Following these conclusions, we have developed an approach to improve existing docking programs. Firstly, through modelling the ERBIN PDZ / Smad3 MH2 complex, we have tested the utility of Molecular Dynamics with Explicit Solvent (MDSE) for elucidating the key residues in an interaction. We then extended this research by using several docking servers and the DMSE simulations to obtain a consensus result. Finally, we have explored the use of DMSE refinement on one of the targets from the CAPRI experiment and we have compared those results with those from short Monte-Carlo simulations. Another aspect of this thesis concerns the development of a novel molecular surface visualisation tool. This program, named MetaMol, allows the visualisation of a new type of molecular surface: the Molecular Skin Surface. Distributing the surface calculation between a computer's central processing unit (CPU) and its graphics card (GPU) allows deformations of the molecular surface to be calculated and visualised in real time.

Le suivi des interactions entre protéines, localisées à la membrane plasmique ou à l’intérieur de cellules, a été réalisé au cours de cette thèse par imagerie de fluorescence et par l’analyse de processus dits de FRET (Forster Resonance Energy Transfer). Pour quantifier le FRET entre nos protéines d’intérêt, nous avons choisi le contraste de durée de vie de fluorescence car cette méthode est indépendante de la concentration et de l’intensité de fluorescence. Afin d’obtenir une résolution suffisante pour des problématiques neurobiologiques, un microscope TIRFLIM (Total Internal Reflection Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) avait préalablement été développé. Celui-ci nous permet de faire de l’imagerie en plein champ avec une résolution axiale sub-longueur d’onde. Ce dispositif a été calibré et optimisé au cours de cette thèse pour répondre au mieux à des problématiques biologiques. Différentes approches ont ainsi été testées dans le but de calibrer la profondeur de pénétration de l’onde évanescente. Des surfaces plasmoniques ont entre autres été utilisées pour augmenter la sélectivité axiale du montage. Notre microscope a été dédié à l’étude de l’effet du cholestérol sur l’interaction entre la protéine précurseur de l’amyloïde APP, protéine transmembranaire impliquée dans la maladie d’Alzheimer et une de ses enzymes de clivage BACE1. Nous avons ainsi effectué un suivi dynamique de l’effet du cholestérol sur l’interaction entre APP et BACE1 dans des cellules HEK-293 et dans des cultures primaires de neurones d’hippocampe d’embryons de rat, de la membrane plasmique à l’intérieur des cellules grâce à notre dispositif TIRFLIM. La mesure d’anisotropie de fluorescence résolue en temps a également été implémentée sur notre montage. Ces mesures résolues en temps et en polarisation ont permis de mesurer le temps de corrélation rotationnelle de fluorophores et de mettre en évidence de manière qualitative différents niveaux d’homodimérisation de protéines impliquées dans la maladie d’Alzheimer. / In the framework of this thesis, we have used FRET (Forster Resonance Energy Transfer) as a mechanism to follow the interaction of proteins from the plasma membrane to the cytoplasm of cells. To quantify FRET, we have chosen Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) since this method is independent of the concentration and intensity of the fluorophores. To have a good axial resolution, a TIRFLIM set-up (Total Internal Reflection Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) was developed and this allowed us to perform wide-field imaging with sub-wavelength axial resolution. This set-up was calibrated and optimized in order to answer biological questions. Different approaches were tested in order to measure the penetration depth of the evanescent field and especially plasmonic surfaces were used to further enhance the axial resolution. Our set-up was dedicated to the study of the effect of cholesterol on the interaction between the Amyloid Precursor Protein (APP), a transmembrane protein involved in Alzheimer Disease, and one of its cleaving enzyme (BACE1). We performed a dynamic tracking of APP and BACE1 proximity under the effect of cholesterol, in HEK-293 cells and primary cultures of embryonic rat hippocampal neurons, thanks to our TIRFLIM set-up.Time-resolved fluorescence anisotropy has been implemented on our set-up. This has enabled us to measure the rotational correlation time of fluorophores and to investigate quantitatively different states of homodimerization of proteins involved in Alzheimer’s disease.

En pathologie tumorale, l’étude du micro-environnement tumoral doit prendre en compte différents modes de communication cellulaire : contacts directs entre membranes plasmiques, émission et réception de cytokines et enfin émission et internalisation d’objets biologiques plus complexes comme les microvésicules et les exosomes qui peuvent être assimilés à de véritables organites extra-cellulaires. Le virus d’Epstein-Barr (EBV) participe à l’oncogenèse de plusieurs affections malignes humaines d’origine épithéliale (carcinomes nasopharyngés ou NPC) ou lymphocytaire (lymphomes post-transplantation). Dans ces tumeurs, les cellules malignes qui sont infectées de façon latente par EBV libèrent des exosomes et des microvésicules qui contiennent des protéines et des acides nucléiques d’origine virale. L’étude de ces éléments doit permettre de mieux comprendre les interactions hôte-tumeur et de mettre en évidence de nouveaux biomarqueurs utiles pour le diagnostic précoce et la surveillance de la maladie sous traitement. Le premier objectif de ma thèse consistait à étudier la sécrétion par les cellules malignes d’une famille de microARN viraux appelés miR-BART et leur diffusion dans le sang périphérique chez les sujets porteurs de tumeurs associées à EBV. Pour la première fois j’ai mis en évidence une sécrétion d’exosomes porteurs de miR-BART par les cellules de NPC en culture in vitro. J’ai également montré que les miR-BART, particulièrement miR-BART7, sont détectables dans le plasma de sujets porteurs de NPC. Contrairement à ce qui se passe in vitro les miR-BART plasmatiques ne sont pas transportés par des exosomes. Des données obtenues chez la souris montrent qu’ils peuvent être transportés par des complexes extra-cellulaires que l’on peut précipiter au moyen d’anticorps anti-ago2. Nous cherchons à confirmer ces données sur des échantillons de plasma provenant de patients porteurs de NPC. Ces données pourront guider à l’avenir l’utilisation des miR-BART circulants comme source de biomarqueurs.Le deuxième volet de ma thèse avait pour but d’étudier les modifications du protéome des exosomes induites par une oncoprotéine du virus d’Epstein-Barr appelée LMP1 (latent membrane protein 1). J’ai montré que la LMP1, lorsqu’elle est exprimée dans les cellules lymphocytaires ou épithéliales, infectées ou non par EBV, induit la libération de la protéine PARP1 dans le milieu extra-cellulaire. Cette PARP1 extra-cellulaire n’est pas associée aux exosomes ni aux microvésicules mais à des nano-objets non-vésiculaires contenant notamment des histones et de l’ADN. Nous avons désignés ces objets sous le terme de complexes ADN-protéines extra-cellulaires. Nous ne savons presque rien de la biogenèse de ces complexes ; nous pensons qu’ils ne proviennent pas uniquement de cellules en apoptose. En revanche, des expériences préliminaires suggèrent que la présence de PARP1 dans ces complexes coïncide avec une activation permanente de la PARP1 induite dans les cellules productrices par l’expression de l’oncoprotéine LMP1. Cette hypothèse est en cours de vérification grâce à des expériences menées sur des lignées cellulaires exprimant différentes formes sauvages ou mutées de la LMP1. Ces données sur l’activation de la PARP1 et sur sa sécrétion induite par la LMP1 auront des retombées intéressantes pour notre compréhension des mécanismes d’oncogenèse et d’auto-immunité liés à l’infection par le virus d’Epstein-Barr. / The study of tumoral microenvironment should take into account different modes of intercellular communications: direct contacts between extracellular membranes, secretion and uptake of cytokines and finally emission and uptake of complex biological objects like exosomes and microvesicles.Epstein-Barr virus (EBV) is associated with several human malignancies of epithelial origin (Nasopharyngeal carcinoma or NPC) or of lymphoïd origin (post-transplant lymphoproliferative disorder or PTLD). In these tumors, malignant cells are latently infected by EBV and release exosomes and microvesicles containing viral nucleic acids and proteins. Studying them will enable a better understanding of tumor-host interactions and the discovery of new markers which could be useful for early diagnostic and the follow-up of the disease under treatment.The first aim of this thesis was to study the release by malignant cells of EBV microRNAs belonging to the BART family and their blood diffusion in patients bearing NPC tumors. For the first time, I’ve shown that exosomes released by NPC cells in vitro contain EBV miR-BART microRNAs. Moreover, ebv-miR-BART7 can be detected in the plasma of NPC patients. Unlike what is observed in vitro, circulating BART microRNAs are not carried by exosomes. Recent data from studies in xenografted mice show that they are carried by extra-cellular complexes which can be immunoprecipitated by anti-Ago2 antibodies. We are currently trying to confirm these data in plasma from NPC patients. This work will ease the use of miR-BARTs as potential biomarkers.The second aim was to study the proteome modifications induced by the EBV Latent Membrane Protein 1 protein (LMP1). I’ve shown that LMP1 expression in lymphoid or epithelial cells infected or not by EBV induces the release of PARP1 in the extra-cellular space. This extra-cellular PARP1 is not carried by exosomes or microvesicles but is embedded in non-vesicular nano-objects containing histones and DNA. We have called these objects “DNA-proteins complexes”. We don’t know how they are produced and released by cells. We think that they are not only secreted by apoptotic cells. Recent data show that this release of extra-cellular PARP1 is associated with PARP1 activation by LMP1 oncoprotein expression. We are trying to prove this hypothesis using cell lines expressing wild type or mutated LMP1. The release and the activation of PARP1 induced by LMP1 expression will help to understand the mechanisms of EBV-associated oncogenesis and auto-immunity.

Les dégénérescences lobaires frontotemporales (DLFT) représentent la deuxième étiologie neurodégénérative chez l’adulte de moins de 65 ans. Les DLFT sont constituées d’un ensemble hétérogène de phénotypes cliniques et sont fréquemment héréditaires. Leurs particularités neuropathologiques communes reposent sur une atrophie des lobes frontaux et/ou temporaux associée à la présence d’inclusions de protéines agrégées parmi lesquelles la protéine TAR DNA binding protein 43 (TDP43). Actuellement, aucun marqueur protéique n’est validé pour diagnostiquer les DLFT du vivant du patient.Une cohorte de cas certains DLFT-TDP43 a été constituée grâce au développement d’outils spécifiques de diagnostic moléculaire. Une analyse des concentrations pondérales de protéine TDP43 dans le liquide cérébrospinal (LCS) a été réalisée dans cette cohorte, puis comparée à des cohortes bien caractérisées sur le plan clinique et neuropathologique. Finalement, les profils qualitatifs de la protéine TDP43 ont été étudiés dans différents compartiments accessibles du vivant du patient : les profils des formes solubles (LCS et plasma) et des formes intracellulaires (éléments figurés du sang) de la protéine TDP43 ont été comparés aux profils protéiques obtenus sur des tissus cérébraux présentant des inclusions de protéine TDP43. Les profils protéiques des culots plaquettaires présentent des similitudes avec le tissu cérébral et pourraient devenir un marqueur candidat pour le diagnostic probabiliste des DLFT / Frontotemporal lobar degeneration (FTLD) syndrome is the second most common of presenile dementia. FTLD is a clinically heterogeneous syndrome and comprises many hereditary cases. Common neuropathological features rely on a degeneration of the frontal and/or anterior temporal lobes, associated to specific inclusions of aggregated proteins including TAR DNA binding protein 43 (TDP43). Unfortunately, no practical protein marker is currently validated to improve FTLD diagnosis in living patients.A cohort of FTLD patients with definite TDP43 pathology was defined with the development of specific genetic testing. An analysis of TDP43 concentrations in cerebrospinal fluid (CSF) was performed in this cohort and then compared to other cohorts well-characterized on clinical and neuropathological features. Finally, qualitative patterns of TDP43 were studied in compartments accessible from the patient’s living: profiles of soluble TDP43 protein (in CSF or in plasma) and intracellular TDP43 protein (in the formed elements of blood) were compared to protein patterns observed in brain tissues with TDP43 protein inclusions. Platelet samples exhibit similar characteristics to brain tissue and could become a candidate biomarker for FTLD probabilistic diagnosis

Les travaux réalisés portent sur la conception de ligands protéiques capables de cibler le site catalytique des métalloprotéases matricielles (MMPs) grâce à une méthode d'ingénierie développée au laboratoire qui repose sur le greffage de motifs fonctionnels. Le motif fonctionnel choisi correspond aux 4 résidus N-terminaux du TIMP-2, un inhibiteur naturel des MMPs. Des plates-formes protéiques possédant des motifs d'acides aminés dans une topologie similaire à celle du motif de référence dans le complexe TIMP-2/MMP-14 ont été identifiées par criblage systématique de la PDB à l'aide du logiciel STAMPS (Search for Three-dimensional Atom Motif in Protein Structure). Dix candidats ligands satisfaisant les contraintes topologiques, stériques et de similarité électrostatique avec le ligand naturel TIMP-2 ont été sélectionnés. Ces ligands ont été produits par synthèse chimique ou par voie recombinante puis leur capacité à inhiber une série de 6 MMPs a été évaluée. Les résultats indiquent que tous les ligands protéiques conçus in silico sont capables de lier les sites catalytiques des MMPs avec des constantes d'association allant de 450 nM à 590 mM, sans optimisation supplémentaire. La caractérisation structurale par diffraction X de 2 variants d'un de ces ligands protéiques a permis de montrer que les interactions établies par le motif 1-4 dans ces ligands étaient similaires à celles observées dans le complexe TIMP-2/MMP-14, avec cependant des différences dans la géométrie de certaines d'entre elles. Des études de simulation par dynamique moléculaire ont également permis de mettre en évidence de possibles différences dans la géométrie et la stabilité de certaines des interactions reproduites dans les 10 plates-formes, pouvant contribuer aux affinités modestes observées pour ces ligands. Cependant, les résultats obtenus montrent que la méthode de conception in silico utilisée est capable de fournir une série de ligands protéiques de 1ère génération ciblant de manière spécifique un site catalytique d'intérêt avec un bon rendement. Cette méthode pourrait constituer la 1ère étape d'une approche hybride de conception in silico de ligands combinée à des techniques de sélection expérimentales.

La leucémie lymphoïde représente environ 30% des cas de cancer chez l’enfant. Elle est souvent causée par des réarrangements chromosomiques impliquant des gènes encodant des facteurs de transcription, qui contrôlent des programmes génétiques complexes. Par exemple, LMO2 (LIM-only 2) est un facteur de transcription oncogénique fréquemment exprimé de façon aberrante dans les leucémies lymphoblastiques aigues des cellules T (T-ALL). Dans l’hématopoïèse normale, LMO2 est essentiel à la génération des cellules souches hématopoïétiques à l’origine de toutes les cellules sanguines. D’ailleurs, certaines cellules leucémiques possèdent des propriétés normalement réservées aux cellules souches hématopoïétiques. Ainsi, l’étude de la fonction de LMO2 dans les cellules souches hématopoïétiques peut être pertinente autant dans le contexte hématopoïétique normal que leucémique. Afin de mettre en évidence de nouvelles fonctions moléculaires pour LMO2, j’ai choisi d’identifier les protéines qui s’y associent. En plus de ses partenaires connus, j’ai identifié plusieurs protéines de transcription/remodelage de la chromatine, en accord avec son rôle transcriptionnel. Plusieurs nouvelles fonctions potentielles ont été révélées, indiquant que cette protéine adaptatrice pourrait faire partie de complexes non transcriptionnels, régulant d’autres processus cellulaires. Les oncogènes comme LMO2 pourraient être des régulateurs à large spectre. Particulièrement, j’ai identifié des interactions entre LMO2 et des protéines de réplication de l’ADN. J’ai montré que LMO2 contrôle la réplication de l’ADN dans les cellules hématopoïétiques, et possiblement durant la leucémogenèse, indépendamment de son rôle transcriptionnel. Ensemble, ces études ont donc permis de révéler de nouvelles fonctions pour LMO2, et pourraient servir de paradigme pour d’autres facteurs de transcription oncogéniques, particulièrement aux autres protéines de la famille LMO, qui sont aussi des oncogènes puissants. / Lymphoid leukemia represents about 30% of childhood cancer cases. It is often caused by chromosomal rearrangements involving genes coding for transcription factors, controlling complex genetic programs. As an example, the oncogenic transcription factor LMO2 (LIM-only 2) is often aberrantly expressed in T cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL). In normal hematopoiesis, LMO2 is essential for the generation of hematopoietic stem cells that give rise to all blood cells. Moreover, some leukemic cells possess properties normally reserved to hematopoietic stem cells. Thus, studying the role of LMO2 in hematopoietic stem cells could be relevant to the contexts of normal hematopoiesis and leukemogenesis. To reveal new molecular functions for LMO2, I chose to identify its associated proteins. In addition to its known protein partners, I identified many proteins involved in transcription/chromatin remodeling, in agreement with its transcriptional role. In addition, several new potential functions have been revealed, indicating that this scaffold protein could be part of non-transcriptional protein complexes, regulating different cell processes. Oncogenes like LMO2 could be master regulators in normal hematopoietic and leukemic cells. Particularly, I identified protein-protein interactions between LMO2 and DNA replication proteins. I demonstrated that LMO2 controls S phase progression in hematopoietic cells, independently of its association in transcriptional complexes. LMO2 overexpression in mice induces T-ALL and affects specifically the cell cycle status of thymocyte progenitors, which are targets of transformation by LMO2. Thus, LMO2 promotes DNA replication in hematopoietic cells, and possibly in leukemogenesis. Together, these studies allowed to reveal new functions for LMO2, and could serve as a paradigm for other oncogenic transcription factors, especially for other LMO proteins which are all potent oncogenes.

Le suivi des interactions entre protéines, localisées à la membrane plasmique ou à l'intérieur de cellules, a été réalisé au cours de cette thèse par imagerie de fluorescence et par l'analyse de processus dits de FRET (Forster Resonance Energy Transfer). Pour quantifier le FRET entre nos protéines d'intérêt, nous avons choisi le contraste de durée de vie de fluorescence car cette méthode est indépendante de la concentration et de l'intensité de fluorescence. Afin d'obtenir une résolution suffisante pour des problématiques neurobiologiques, un microscope TIRFLIM (Total Internal Reflection Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) avait préalablement été développé. Celui-ci nous permet de faire de l'imagerie en plein champ avec une résolution axiale sub-longueur d'onde. Ce dispositif a été calibré et optimisé au cours de cette thèse pour répondre au mieux à des problématiques biologiques. Différentes approches ont ainsi été testées dans le but de calibrer la profondeur de pénétration de l'onde évanescente. Des surfaces plasmoniques ont entre autres été utilisées pour augmenter la sélectivité axiale du montage. Notre microscope a été dédié à l'étude de l'effet du cholestérol sur l'interaction entre la protéine précurseur de l'amyloïde APP, protéine transmembranaire impliquée dans la maladie d'Alzheimer et une de ses enzymes de clivage BACE1. Nous avons ainsi effectué un suivi dynamique de l'effet du cholestérol sur l'interaction entre APP et BACE1 dans des cellules HEK-293 et dans des cultures primaires de neurones d'hippocampe d'embryons de rat, de la membrane plasmique à l'intérieur des cellules grâce à notre dispositif TIRFLIM. La mesure d'anisotropie de fluorescence résolue en temps a également été implémentée sur notre montage. Ces mesures résolues en temps et en polarisation ont permis de mesurer le temps de corrélation rotationnelle de fluorophores et de mettre en évidence de manière qualitative différents niveaux d'homodimérisation de protéines impliquées dans la maladie d'Alzheimer.

Les modèles de Markov cachés (MMC) - par exemple ceux de la librairie Pfam - sont des outils très populaires pour l'annotation des domaines protéiques. Cependaqnt, ils ne sont pas toujours adaptés aux protéines les plus divergentes. C'est notamment le cas avec Plasmodium falciparum (principal agent du paludisme chez l'Homme), où les MMC de Pfam identifient peu de familles distinctes de domaines, et couvrent moins de 50% des protéines de l'organisme. L'objectif de cette thèse est d'apporter des méthodes nouvelles pour affiner la détection de domaines dans les protéines divergentes. Le premier axe développé est une approche d'identification de domaines utilisant leurs propriétés de co- occurrence. Différentes études ont montré que la majorité des domaines apparaissent dans les protéines avec un ensemble très réduits d'autres domaines favoris. Notre méthode exploite cette propriété pour détecter des domaines trop divergents pour être identifiés par l'approche classique. Cette détection s'accompagne d'une estimation du taux d'erreur par une procédure de ré-échantillonnage. Chez P. falciparum, elle permet d'identifier, avec un taux d'erreur estimé inférieur à 20%, 585 nouveaux domaines - dont 159 familles étaient inédites dans cet organisme -, ce qui représente 16% du nombre de domaines connus. Le second axe de mes recherches présente plusieurs méthodes de corrections statistiques et évolutives des MMC pour l'annotation d'organismes divergents. Deux types d'approches ont été proposées. D'un côté, nous intégrons aux alignements d'apprentissage des MMC les séquences précédemment identifiés dans l'organisme cible ou ses proches relatifs. La limitation de cette solution est que seules des familles de domaines déjà connues dans le taxon peuvent ainsi être identifiées. Le deuxième type d'approches contourne cette limitation en corrigeant tous les modèles par une prise en compte de l'évolution des séquences d'apprentissage. Pour cela, nous faisons appel à des techniques classiques de la bioinformatique et de l'apprentissage statistique. Les résultats obtenus offrent un ensemble de prédictions complémentaires totalisant 663 nouveaux domaines supplémentaires - dont 504 familles inédites -, soit une augmentation de 18% à ajouter aux précédents résultats.