Les cellules souches hématopoïétiques (CSH) de phénotype LSK (Ligneage-c-Kit+Sca1+) sont à l’origine de toutes les lignées sanguines. Leur maturation passe parla génération de progéniteurs multipotents (MPP), subdivisés grâce à l’expression deVCAM-1 et Flt3 (VCAM-1+Flt3-: MPP1, VCAM-1+Flt3+: MPP2 et VCAM-1-Flt3+:MPP3). Les MPP3 se différencient en progéniteur lymphoïde commun (CLP), sourcede la lignée B. Sa contribution à la génération de la lignée T reste controversée.La lignée T principale est issue d’un progéniteur de la MO qui a colonisé le thymus. Ilexiste aussi une lignée T extra-thymique, identifiés au sein de différents organes(l’intestin, la MO, le sang et la rate) dont la maturation se termine dans le thymus oul’intestin. Une des questions importantes est de savoir si ces 2 lignées sont issues de lamême source. Nous nous sommes intéressés à la lignée de pré-T extra-thymique (de larate) : Lin-Thy1.2+ CD25+Il7R��+. Ces derniers sont très abondants chez la sourisathymique (5-6 fois plus que chez la souris contrôle C57BL/6). Notre but a été dedéfinir la source de cette lignée parmi les progéniteurs de la MO. Suite aux transplantations des différents compartiments hématopoïétiques de la MO àdes receveurs athymiques irradiés, nous avons montré que les MPP3 (VCAM1-Flt3+)sont la population plus douée d’activité pré-T. Au contraire, les CLP génèrent deslymphocytes B matures (CD19+IgM+). Ces données sont confortées par l’étude del’expression de gènes lymphoïdes et myéloïdes qui indique l’engagement lymphoïdeprécoce d’une sous- population de MPP3. Les cellules progénitrices de la MO quicolonisent la rate (et le thymus) doivent circuler par le sang pour pouvoir coloniser cesorganes. La population de MPP majoritaire en circulation est les MPP3. De plus,l’analyse du profil d’expression des gènes des récepteurs aux chimiokines et d’autresgènes spécifique de la différentiation apporte de nouvelles informations sur le potentielT intrinsèque des progéniteurs de la MO.L’ensemble des données accumulées permettent de conclure que les MPP3 sont debons candidats pour la génération des pré-T extra-thymiques et que l’engagementlymphoïde commencé dans la MO se termine dans le sang grâce au maintien del’expression de Notch1. / Pas de résumé en anglais

Le taux physiologique d’oxygène est finement régulé dans les tissus des mammifères, l’oxygénation diffère d’un tissu à l’autre, ainsi qu’au sein même de ces derniers, ce phénomène est en grande partie dû à l’architecture vasculaire. L’oxygène est un stimulus clef dans la destinée des cellules durant l’embryogenèse et la progression tumorale. Il est actuellement reconnu que les cellules souches se distribuent en suivant un gradient d’oxygène, où les faibles concentrations en oxygène (Hypoxie) favorisent la conservation d’un état indifférencié. Les cellules souches hématopoïétiques (CSH) résident dans des niches osseuses où la disponibilité en oxygène est limitée voir nulle. Le modèle de l’hématopoïèse a été largement décrit au niveau cellulaire et moléculaire et est un des principaux modèles utilisé dans l’étude des mécanismes gouvernant le caractère souche d’une cellule. Des études récentes révèlent dans des modèles murins que les facteurs de transcriptions induits par l’hypoxie (HIF) affectent le comportement des cellules souches hématopoïétiques. Ici, nous étudions le rôle potentiel des facteurs HIF-1α et HIF-2α dans les CSH Humaines. Le knockdown des deux facteurs a été obtenu en combinant une stratégie de short-hairpin RNA et de vecteurs de transferts lentiviraux. La transduction de cellules de sang de cordon CD34-positive révèle que les deux knockdowns affectent à court terme la croissance des progéniteurs et CSH et à long terme leurs capacités de reconstitution dans des souris immuno-déficientes NOD/LtSz-scid IL2rgnull. Cependant, nous observons un effet plus délétère de HIF-2α sur le maintien des cellules souches en comparaison à HIF-1α. / Physiological oxygen level is tightly regulated in mammalian tissues. Moreover, oxygenation differs from one tissue to the other, as well as within a single tissue, due to vasculature modeling. Oxygen levels have been shown to be a key stimulus of cell fate during embryogenesis and cancer progression. It is now widely admitted that stem cells fate followes oxygen gradients with low levels (hypoxia) promoting an undifferentiated state. Hematopoietic stem cells (HSC) reside in bone marrow niches in which oxygen availability is low, even absent. Hypoxia-inducible factors (HIF) are the main factors regulating the cell-response to oxygen variation. Studies on mouse models reveal that HIFs affect HSC activity. Here, we investigate the potential function of HIF-1α and HIF-2α within human HSCs. Knockdown of both factors was obtained by lentivirus-mediated short-hairpin RNA strategy. Transductions of CD34-positive cord blood cells reveal that HIF-2α knockdown affects myelo-erythroid differentiation. Both HIF-α are required for long-term reconstitution in immune-deficient NOD/LtSz-scid IL2rγnull mice, whereas a more pronounced deficiency was observed for HIF-2α. Overall, our data strongly suggest the existence of multiple but preponderant functions in human stem cell maintenance and differentiation.

Le rétrovirus Graffi induit des leucémies chez la souris et permet donc l'étude de phénomènes impliqués dans la leucémie ou plus généralement dans le cancer. Le but du présent projet a été de caractériser le rétrovirus murin Graffi et les leucémies induites afin d'apporter des éléments nouveaux aidant à la compréhension de la leucémie. La leucémie est une conséquence d'un dysfonctionnement de l'hématopoïèse. Les cellules leucémiques dérivent de progéniteurs hématopoïétiques qui ont subi des mutations et l'expression de plusieurs proto-oncogènes est dérégulée. Ainsi ces cellules anormales ne peuvent pas terminer le processus de différenciation, prolifèrent de façon anarchique, échappent à l'apoptose et envahissent l'organisme. Bien que ne formant pas de tumeurs solides, les cellules leucémiques ont beaucoup de caractéristiques en commun avec d'autres types de cellules cancéreuses. Le rétrovirus murin Graffi a été isolé en 1954 par Arnold Graffi, qui l'a caractérisé comme un rétrovirus induisant des leucémies myéloïdes. Son équipe et lui-même ont cependant été confrontés au phénomène qu'ils ont appelé 'diversification hématologique'. Récemment, 2 clones moléculaires ont été dérivés dans le laboratoire d'Eric Rassart à partir de l'extrait original du rétrovirus Graffi et qui correspondent à 2 génomes non défectifs, nommés GV-1.2 et GV-1.4. Les leucémies induites par ces 2 variants avaient été classifiées comme myéloïdes, ceci basé sur l'observation morphologique de frottis sanguins. Une nouvelle étude de caractérisation des leucémies induites par ces 2 variants dans 3 souches de souris a montré que le rétrovirus Graffi est capable d'induire des types de leucémies très variés: lymphoïdes (T et B) et non-lymphoïdes (myéloïdes, érythroïdes et mégacaryoblastiques). Beaucoup de ces leucémies sont très complexes (leucémies mixtes ou biphénotypiques). Les leucémies mégacaryoblastiques sont particulièrement intéressantes car ces leucémies humaines sont associées à un mauvais pronostic et sont peu étudiées. L'étude a également révélée que la région enhancer du virus joue un rôle clé dans la pathogenèse, ceci correspondant à un plus grand nombre de leucémies lymphoïdes (T) induit par GV-1.2 en comparaison avec GV-1.4. Une analyse phylogénétique détaillée a été effectuée grâce à l'obtention des séquences génomiques de GV-1.2 et GV-1.4. Cette étude a montré que le rétrovirus Graffi est très proche des virus SRS 19-6 et Moloney. L'étude phylogénique réalisée est très large, prenant en compte des membres de chaque classe de la famille des rétrovirus murins de la leucémies (écotropiques, amphotropiques, xénotropiques, polytropiques). Le rétrovirus Graffi, avec les virus SRS 19-6, Moloney, Rauscher et Friend sont plus proches des virus de type Casistas que des virus xénotropiques. En outre, l'analyse a également révélée que l'enveloppe de HEMV, un prototype d'un virus ancestral et celle de CasBrE sont proches d'un point de vue phylogénique. Finalement, afin d'utiliser les avantages du modèle 'Graffi', le profilage génique de chaque type de leucémies induites par ce rétrovirus a été effectuée grâce à la technologie des micropuces à haute densité (Affymetrix). De très nombreuses données sont issues de cette analyse et beaucoup de gènes non encore reliés à la leucémie ont été mis en évidence. Certains de ces gènes sont potentiellement des oncogènes et leurs fonctions méritent d'être analysées de façon plus approfondie. L'expression de certains gènes a été validée par RT-PCR. En conclusion, le rétrovirus Graffi représente un modèle complexe mais très intéressant pour étudier divers types de leucémies. L'expérience des micropuces a permis de faire ressortir des gènes dont il serait intéressant d'approfondir l'étude de la fonction. Globalement, l'utilisation des nombreuses données issues de l'analyse des micropuces permet une meilleure compréhension des cellules leucémiques et des lignées hématopoïétiques correspondantes. Le profilage génique des leucémies induites par le rétrovirus Graffi a permis d'ouvrir sur de nombreuses perspectives, certaines à caractères thérapeutiques. Ainsi, à plus long terme, cela pourrait permettre de fournir des éléments s'ajoutant aux outils de diagnostic, et d'identifier des gènes ou voies de signalisation pouvant être ciblés par des molécules inhibitrices. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Rétrovirus murin de la leucémie, Leucémie, Oncogène, Cancer, Hématopoïèse.

La Drosophile produit des cellules sanguines aussi appelées hémocytes qui se rapprochent fonctionnellement des cellules de la lignée myéloïde des vertébrés. On en dénombre trois sortes : les plasmatocytes qui sont apparentées aux macrophages des vertébrés, les cellules à cristaux, qui participent à la coagulation, et les lamellocytes qui ne sont produits que suite à certains challenges immuns et qui participent à l'encapsulation de corps trop gros pour être phagocytés. Le choix de destin, la prolifération et la différenciation des cellules hématopoïétiques sont contrôlés par plusieurs familles de facteurs de transcription conservés de la Drosophile à l'Homme. En particulier, le gène serpent (srp), codant pour un facteur de transcription de type GATA, joue un rôle majeur à différentes étapes du développement des cellules sanguines embryonnaires et larvaires de la Drosophile. En effet, srp est non seulement requis pour la spécification et le maintien des progéniteurs sanguins (prohémocytes) mais il participe aussi à la différenciation des trois lignages hématopoïétiques. Cette diversité de fonction de Srp est notamment assurée par l'interaction avec d'autres partenaires dont le cofacteur de type FOG (Friend of GATA) U-shaped (Ush) qui participe au contrôle de la différenciation des plasmatocytes et des lamellocytes. Enfin un second facteur de transcription de type GATA, Pannier (Pnr), est quant à lui nécessaire à la différenciation et à la maturation des plasmatocytes. L'objectif de ma thèse est de mieux comprendre la fonction et le mode d'action de ces facteurs GATA et FOG dans le contrôle du développement des cellules sanguines larvaires, et en particulier des lamellocytes. Dans un premier temps, une analyse génétique m'a permis d'identifier des rôles spécifiques pour les deux complexes GATA/FOG, Srp/Ush et Pnr/Ush, dans le processus de formation des hémocytes larvaires circulants. Ainsi, mes résultats suggèrent que : 1) le complexe Srp/Ush réprime la prolifération et la différenciation des hémocytes circulants ; 2) Srp participe à la maturation des lamellocytes ; 3) le complexe Pnr/Ush contrôle le maintien de l'identité des plasmatocytes par répression de leur transdifférentiation en lamellocytes ; 4) le complexe Srp/Ush réprime l'expression de pnr, qui est nécessaire à la maturation des plasmatocytes. Il apparait donc que la combinatoire des trois facteurs Srp, Pnr et Ush régule différentes étapes du développement des cellules sanguines larvaires. Dans un second temps, j'ai cherché à mettre à jour les réseaux géniques contrôlés par ces facteurs. Pour cela, j'ai utilisé une lignée de cellules sanguines d'origine larvaire sur laquelle j'ai réalisé des expériences d'immunoprécipitation de chromatine (ChIP-Seq) contre Srp, Pnr et Ush ainsi que des analyses transcriptomiques (RNA-Seq) en condition normale ou de perte de fonction de ush. Mes analyses montrent notamment que Ush participe à l'activation de l'expression de marqueurs des plasmatocytes comme les gènes codant pour les composants de la matrice extracellulaire et à la répression de l'expression de marqueurs des lamellocytes comme les gènes codant pour les récepteurs de la matrice extracellulaire. Ces analyses montrent aussi que Ush régule l'expression de composants de différentes voies de signalisation impliquées dans la formation des lamellocytes tels que shaggy (voie Wnt), wts (voie Hippo) et pi3k21B (voie mTor). Le cofacteur Ush, au travers de ses interactions avec Srp et Pnr, apparait donc comme un acteur central dans la régulation du destin des plasmatocytes et des lamellocytes au cours de l'hématopoïèse chez la Drosophile. L'ensemble de ces résultats apportent une meilleure compréhension des réseaux géniques mis en œuvre lors de la formation des cellules sanguines et notamment du rôle joué par les facteurs GATA et du cofacteur FOG au cours du processus hématopoïétique. / Drosophila produces blood cells or hemocytes, which are related to the myeloid lineage of vertebrates. There are three kinds of hemocytes: plasmatocytes are phagocytic cells akin to vertebrate macrophages; crystal cells are involved in the clotting process and lamellocytes are produced after immune challenges like wasp infestation in order to encapsulate objects too large to be phagocytized. Different families of transcription factor conserved from Drosophila to Human finely regulate blood cell fate, proliferation and differentiation. For instance, the GATA transcription factor Serpent (Srp), which plays a key role at different steps of embryonic and larval blood cell development in Drosophila. Indeed, srp is not only required for the specification and maintenance of blood cell progenitors (prohemocytes) but it is also involved in the differentiation of the three hemocyte lineages. This functional diversity is ensured in particular by the interaction with other partners such as the Friend of GATA (FOG) co-factor U-shaped (Ush), which is involved in the control of plasmatocytes differentiation into lamellocytes. Moreover, a second GATA factor, Pannier (Pnr) is necessary to plasmatocytes differentiation and maturation. The purpose of my work is to provide a better understanding of the function and mode of action of these two GATA proteins and of their FOG co-factor during Drosophila blood cell development and in particular for lamellocyte production. At first, a genetic analysis allowed us to identify specific role for each GATA / FOG complex in circulating larval hemocytes. Notably my results suggest that 1) the Srp / Ush complex represses hemocytes proliferation and differentiation; 2) Srp alone participates to lamellocytes maturation; 3) the Pnr / Ush complex maintains plasmatocytes identity by repressing their differentiation into lamellocytes; 4) the Srp / Ush complex represses Pnr expression, which is necessary for plasmatocytes maturation. These data indicate that the combinatorial interplay between Srp, Pnr and Ush participates in the fine-tuning of larval blood cell development. Second, I tried to decipher the gene networks regulated by these three factors. To do so, I used an ex vivo cellular model of larval hemocytes to identify Srp, Pnr and Ush direct target genes by chromatin immunoprecipitation (ChIP-Seq) experiments as well as Ush-regulated genes by transcriptomic analyses (RNAseq). My results revealed that Ush participates in the activation of plasmatocytes markers such as extracellular matrix (ECM) components whereas it represses the expression of lamellocytes markers such as ECM receptor. In addition, these analyses allowed us to identify components of different signalling pathway involved in lamellocytes formation that are directly regulated by Ush, including shaggy (Wnt pathway), wts (Hippo pathway) and pi3k21B (mTor pathway). Therefore, it appears that Ush, thanks to its interaction with Srp or Pnr, plays a central role in the regulation of plasmatocyte and lamellocyte fate. All together, these results shed new light on the genetic network involved in blood cell formation and on the role of the GATA / FOG complexes during haematopoiesis.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

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