RIOS, Emiliano Ricardo Vasconcelos. Efeito antinociceptivo do acetato de citronelila : estudo dos possíveis mecanismos de ação. 2014. 115 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2014. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2014-07-17T16:12:34Z No. of bitstreams: 1 2014_tese_ervrios.pdf: 1164250 bytes, checksum: 2756bc3785e62013839fa6a7e0ed57f0 (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2014-07-17T16:14:48Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_tese_ervrios.pdf: 1164250 bytes, checksum: 2756bc3785e62013839fa6a7e0ed57f0 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-07-17T16:14:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_tese_ervrios.pdf: 1164250 bytes, checksum: 2756bc3785e62013839fa6a7e0ed57f0 (MD5) Previous issue date: 2014 / This work shows for the first time the antinociceptive effect of the citronellyl acetate (CAT) and aimed to characterize the profile of effect and identify possible antinociceptive mechanisms of the cat, in models of acute nociception in mice. The CAT was testeed standardized animal models of pain using mice Swiss (24-32g). The CAT was administered at doses of 25, 50, 75, 100 or 200 mg/kg, by gavage. It was used in the tests of abdominal writhings by acetic acid; hot plate; formalin test; mechanic sensitivity; inflamatory hipernociception induced by carrageennan; Nociception test induced by capsaicin, cinnamaldeide, menthol, acid saline, PMA, 8-Br-cAMP, bradykinin or glutamate, as well as in behavioural models (open field and rota rod tests) that allowed to exclude the possibility of a muscle relaxant action or to induce false-positive result in the earlier models. The results showed that the CAT have antinociceptive effect in the visceral nociception model induced by acetic acid (in the 100 or 200 mg/kg doses, with ED50 of 74.42 mg/kg), this effect was verified after 30 minutes of aplication and continued until 240 minutes (200 mg/kg). Pretreatment with CAT showed antinociceptive effect in licking model induced by intraplantar formalin application and in the thermal nociception model (hot plate). CAT showed the decreasing of mechanical sencibility using the von Frey hair. In the antinociceptive mechanism investigation, CAT showed effect related with K+ATP channels, TRPV1, TRPM8, ASIC, glutamatergics receptors, bradykinin receptors, PKA and PKC. IN the investigation of neurotramitters pathways involved in antinociceptive effect of CAT, we can suggest the involvement of serotonergics system (5-HT1A, 5-HT2A/C receptors) and muscarinic, dopaminergic and α2-adrenergics receptors. With the results showed, we can conclude the CAT have antinociceptive effect in mice, and as possible mechanism the modulation of intracellular mediators PKC and/or PKA, relacted with moleculars mechanisms of K+ATP channels, TRPV1, TRPM8, ASIC, glutamatergics receptors, bradykinin receptors, serotonergics system (5-HT1, 5-HT2A/C receptors) and muscarinic, dopaminergic and α2-adrenergics receptors. / Esse trabalho, até onde se sabe, mostra pela primeira vez o efeito antinociceptivo do acetato de citronelila (CAT) e teve como objetivo caracterizar o perfil do efeito e identificar possíveis mecanismos antinociceptivos do CAT, em modelos de nocicepção aguda em camundongos. O CAT foi testado em modelos animais padronizados de dor utilizando camundongos Swiss (24-32g). O CAT foi administrado nas doses de 25, 50, 75, 100 ou 200 mg/kg, por via oral. Foram utilizados os testes de contorções abdominais induzidas por ácido acético; placa quente; teste da formalina; nocicepção mecânica, hipernocicepção inflamatória induzida pela carragenina; teste da nocicepção induzida por capsaicina, cinamaldeído, mentol, salina ácida, PMA, 8-Br-cAMP, bradicinina ou glutamato, bem como em modelos comportamentais (testes do campo aberto e rota Rod) que permitiram excluir a possibilidade de uma atividade relaxante muscular ou induzir resultados falso-positivos nos modelos anteriores. Os resultados mostraram que o CAT possui efeito antinociceptivo no modelo de nocicepção visceral induzida por ácido acético (nas doses de 100 ou 200 mg/kg, com DE50 de 74,42 mg/kg), esse efeito foi verificado após 30 minutos da aplicação e persistiu por até 240 minutos (200 mg/kg). O pré-tratamento com o CAT mostrou efeito antinociceptivo no modelo de lambedura induzida pela aplicação intraplantar de formalina e no modelo de nocicepção térmica (placa quente). O CAT mostrou diminuição da sensibilidade mecânica utilizando o filamento de von Frey. Na investigação do mecanismo antinociceptivo, o CAT mostrou efeito relacionado com os canais K+ATP, TRPV1, TRPM8, ASIC, receptores glutamatérgicos, receptores de bradicinina, PKA e PKC. Na investigação das vias de neurotransmissão envolvidas no efeito antinociceptivo do CAT, podemos sugerir o envolvimento dos receptores α2-adrenérgicos, sistema serotonérgico (receptores 5-HT1A, 5-HT2A/C), receptores muscarínicos e dopaminérgicos. Com os resultados mostrados, podemos concluir que o CAT possui efeito antinociceptivo em camundongos, e como possíveis mecanismos a modulação de mediadores intracelulares PKA e/ou PKC, relacionados com os mecanismos moleculares dos canais K+ATP, TRPV1, TRPM8, ASIC, receptores glutamatérgico, receptores de bradicinina, receptores α2-adrenérgico, sistema serotonérgico (receptores 5-HT1, 5-HT2A/C), receptores muscarínicos e dopaminérgicos.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade em Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2014. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2014-10-24T15:21:06Z No. of bitstreams: 1 2014_RubensSantosSamuelAlmeida.pdf: 2610665 bytes, checksum: 27c9282e87024c46e2e4d9b9fff37dbe (MD5) / Approved for entry into archive by Tania Milca Carvalho Malheiros(tania@bce.unb.br) on 2014-10-24T15:50:26Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_RubensSantosSamuelAlmeida.pdf: 2610665 bytes, checksum: 27c9282e87024c46e2e4d9b9fff37dbe (MD5) / Made available in DSpace on 2014-10-24T15:50:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_RubensSantosSamuelAlmeida.pdf: 2610665 bytes, checksum: 27c9282e87024c46e2e4d9b9fff37dbe (MD5) / Muitos fatores são caracterizados como desencadeadores do câncer como os fatores genéticos e a desregulação nos processos de sinalização celular. O acúmulo de mutações em células normais está nos fatores genéticos ligados a carcinogênese e a localização dessas mutações no genoma possui um papel fundamental. Até o momento, diversas mutações têm sido descritas em genes importantes relacionados à carcinogênese mamária. Desregulação nos processos de sinalização celular levam por vezes ao amento da proliferação celular característica fundamental para o desenvolvimento do câncer. Genes da família MYLK (Miosin Light Chain Kinase) codificam proteínas do tipo serina/treonina quinase inicialmente identificados como responsáveis pela fosforilação da cadeia leve da miosina. Estudos anteriores identificaram mutações no gene MYLK4 como de grande importância no câncer de mama. Estudos mostram que um aumento da expressão dos genes MYLK1 e MYLK2 estão relacionados com a carcinogênese mamária. Os membros desta família não foram totalmente caracterizados. Este estudo buscou investigar uma possível relação entre o MYLK4 e o câncer de mama. Foi constatado que a frequência de mutações no gene MYLK4 é baixa tanto em linhagens celulares quanto em amostras clínicas de câncer de mama. Ainda, observamos uma superexpressão do gene em linhagens celulares de câncer de mama e uma maior expressão em mama quando comparado com outros tipos de tecidos normais. A análise por imunohistoquímica em amostras clínicas parafinizadas demonstrou uma maior expressão do MYLK4 no tecido tumoral e presença em tecido normal. Analisando sua expressão em um número maior de amostras clínicas tumorais pareadas com sua contra parte normal ou não, não foram observadas alterações significativas na expressão do MYLK4 apenas uma grande variância em sua expressão. Ensaio de superexpressão do MYLK4 em linhagem celular normal demonstrou um aumento na proliferação celular in vitro. Os dados em conjunto apontam para um possível envolvimento do MYLK4 no crescimento celular em tumores que apresentem superexpressão deste gene. _________________________________________________________________________ ABSTRACT / Many factors are characterized as causes of cancer such as genetic factors and deregulation of cellular signaling processes. The accumulation of mutations in normal cells is linked to genetic factors in carcinogenesis and the location of these mutations in the genome plays a key role. To date, several mutations have been described in important genes related to mammary carcinogenesis. Disruption in cellular signaling process sometimes leads to increased cell proliferation, critical to the development of cancer. The MYLK (Light Chain Kinase Miosin) gene family encodes proteins of the serine / threonine kinase family originally identified as responsible for the phosphorylation of myosin light chain. Previous studies have identified mutations in the gene MYLK4 to be important in breast cancer. Studies have shown that increased expression of genes MYLK1 and MYLK2 are related to mammary carcinogenesis. Members of this family have not been fully characterized. This study sought to investigate a possible relationship between MYLK4 and breast cancer. It has been found that the frequency of mutations in the gene MYLK4 is low in both cell lines and clinical samples of breast cancer. Also, we observed a gene overexpression in cell lines of breast cancer and increased expression in normal cells of breast cancer when compared with other types of normal tissues. Analysis by immunohistochemistry in paraffin embedded clinical samples showed an increased expression of MYLK4 in tumor tissue and its presence in normal tissue. Analyzing its expression in a larger number of clinical tumor samples paired with its counterpart normal part or not, no significant changes were observed in the expression of MYLK4 just a great variance in their expression. Assay overexpressing MYLK4 normal cell line showed increase on cell proliferation in vitro. This data together suggest a possible involvement of MYLK4 in cell growth in tumors that exhibit overexpression of this gene.

Vários resultados na literatura fornecem fortes evidências de que o processamento de memórias requerem a participação da proteína cinase C (PKC) em estruturas sabidamente necessárias para este processamento, como o hipocampo, a amígdala basolateral (ABL) e o córtex parietal posterior (CPP). Neste trabalho mostramos que o inibidor seletivo das isoformas cálcio-dependentes da PKC, Go 6976, produz um efeito amnésico dosedependente sobre a consolidação de memória espacial de longa duração em ratos submetidos ao treino no labirinto aquático de Morris (LAM), quando infundido na região CA1 do hipocampo dorsal 15 minutos pré-treino, imediatamente pós-treino ou 15 minutos pré-teste para esta tarefa, sem alterar a atividade locomotora dos animais. Ainda na tarefa do LAM, o Go 6976 também apresentou este efeito amnésico sobre a reconsolidação de memórias espaciais de longa duração recentes e antigas, bem como sobre a consolidação da memória espacial de longa duração relativa ao treino reverso no LAM, mas não teve efeito sobre a memória espacial de curta duração nem sobre a extinção da memória espacial de longa duração. Já na tarefa de esquiva inibitória (EI) o Go 6976 produziu um efeito amnésico quando infundido na ABL imediatamente ou 30 minutos pós-treino, ou no CPP 270 ou 360 minutos pós-treino, enquanto o inibidor não-seletivo das isoformas da PKC, Go 7874, produziu os mesmos efeitos, exceto por, no CPP, causar amnésia quando infundido 180 ao invés de 270 minutos pós-treino. Estes resultados indicam que as PKCs, sobretudo as cálcio-dependentes, são importantes para o processamento de memórias espaciais e aversivas, apresentando na consolidação de memórias aversivas distintos tempos críticos de ativação em diferentes estruturas cerebrais, e sendo necessárias para a aquisição, consolidação, evocação e reconsolidação de memórias espaciais.

Vários resultados na literatura fornecem fortes evidências de que o processamento de memórias requerem a participação da proteína cinase C (PKC) em estruturas sabidamente necessárias para este processamento, como o hipocampo, a amígdala basolateral (ABL) e o córtex parietal posterior (CPP). Neste trabalho mostramos que o inibidor seletivo das isoformas cálcio-dependentes da PKC, Go 6976, produz um efeito amnésico dosedependente sobre a consolidação de memória espacial de longa duração em ratos submetidos ao treino no labirinto aquático de Morris (LAM), quando infundido na região CA1 do hipocampo dorsal 15 minutos pré-treino, imediatamente pós-treino ou 15 minutos pré-teste para esta tarefa, sem alterar a atividade locomotora dos animais. Ainda na tarefa do LAM, o Go 6976 também apresentou este efeito amnésico sobre a reconsolidação de memórias espaciais de longa duração recentes e antigas, bem como sobre a consolidação da memória espacial de longa duração relativa ao treino reverso no LAM, mas não teve efeito sobre a memória espacial de curta duração nem sobre a extinção da memória espacial de longa duração. Já na tarefa de esquiva inibitória (EI) o Go 6976 produziu um efeito amnésico quando infundido na ABL imediatamente ou 30 minutos pós-treino, ou no CPP 270 ou 360 minutos pós-treino, enquanto o inibidor não-seletivo das isoformas da PKC, Go 7874, produziu os mesmos efeitos, exceto por, no CPP, causar amnésia quando infundido 180 ao invés de 270 minutos pós-treino. Estes resultados indicam que as PKCs, sobretudo as cálcio-dependentes, são importantes para o processamento de memórias espaciais e aversivas, apresentando na consolidação de memórias aversivas distintos tempos críticos de ativação em diferentes estruturas cerebrais, e sendo necessárias para a aquisição, consolidação, evocação e reconsolidação de memórias espaciais.

Vários resultados na literatura fornecem fortes evidências de que o processamento de memórias requerem a participação da proteína cinase C (PKC) em estruturas sabidamente necessárias para este processamento, como o hipocampo, a amígdala basolateral (ABL) e o córtex parietal posterior (CPP). Neste trabalho mostramos que o inibidor seletivo das isoformas cálcio-dependentes da PKC, Go 6976, produz um efeito amnésico dosedependente sobre a consolidação de memória espacial de longa duração em ratos submetidos ao treino no labirinto aquático de Morris (LAM), quando infundido na região CA1 do hipocampo dorsal 15 minutos pré-treino, imediatamente pós-treino ou 15 minutos pré-teste para esta tarefa, sem alterar a atividade locomotora dos animais. Ainda na tarefa do LAM, o Go 6976 também apresentou este efeito amnésico sobre a reconsolidação de memórias espaciais de longa duração recentes e antigas, bem como sobre a consolidação da memória espacial de longa duração relativa ao treino reverso no LAM, mas não teve efeito sobre a memória espacial de curta duração nem sobre a extinção da memória espacial de longa duração. Já na tarefa de esquiva inibitória (EI) o Go 6976 produziu um efeito amnésico quando infundido na ABL imediatamente ou 30 minutos pós-treino, ou no CPP 270 ou 360 minutos pós-treino, enquanto o inibidor não-seletivo das isoformas da PKC, Go 7874, produziu os mesmos efeitos, exceto por, no CPP, causar amnésia quando infundido 180 ao invés de 270 minutos pós-treino. Estes resultados indicam que as PKCs, sobretudo as cálcio-dependentes, são importantes para o processamento de memórias espaciais e aversivas, apresentando na consolidação de memórias aversivas distintos tempos críticos de ativação em diferentes estruturas cerebrais, e sendo necessárias para a aquisição, consolidação, evocação e reconsolidação de memórias espaciais.

A pré-eclâmpsia (PE) é causa importante de mortalidade fetal e materna em todo mundo e existem evidências que a resistência à insulina esteja implicada em sua fisiopatologia. A via Akt/PKB é estimulada pela insulina e exerce várias funções vitais como crescimento, sobrevivência e metabolismo celular. Objetivo: investigar a expressão basal da Akt/PKB, proteínas que regulam sua atividade e de seus substratos em placenta, músculo esquelético e adipócitos de parturientes normais e com pré-eclâmpsia. Método: amostras de 17 pacientes normais e 17 pacientes com PE foram coletadas, preparadas e analisadas por Western blot para quantificação da expressão de proteínas envolvidas na cascata de sinalização da Akt/PKB. Resultados: em placentas a expressão basal da P85 foi 1,12 (0,83 – 1,62 mediana e percentils 25 - 75), para normais e 1,29 (0,89 – 1,96) para PE com p = 0,42; a expressão da Akt/PKB total foi 1,85 (1,07 - 3,12) para normais e 1,53 (1,27-3,08) com p = 1,00. A atividade dos substratos da Akt/PKB fosforilados em serina e treonina foi semelhante entre placentas de parturientes normais e PE, e a expressão da HSP90 também se mostrou semelhante entre os dois grupos. No músculo esquelético a expressão da P85 foi de 1,41 (1,20 - 6,29) para normais e 1,63 (1,32- 1,90) para PE com p = 0,91. A expressão de Akt/PKB total foi de 0,96 (0,84 - 1,31) para normais e 1,55 (0,87 - 1,86), p = 0,41. A atividade dos substratos da Akt/PKB fosforilados em serina e treonina foi semelhante nesse tecido entre normais e PE, e a expressão da HSP90 também se mostrou semelhante entre os dois grupos no músculo esquelético. No tecido adiposo a expressão de Akt/PKB total foi 1,10 (0,53 - 1,73) em normais e 1,66 (0,83 - 2,00) em PE com p = 0,37 e a expressão do IRß; 1,58 (0,56 - 3,23) para normais e 2,00 (0,91 - 6,65) para PE com p = 0,53. Conclusões: Não houve diferença na via da Akt/PKB, em estado basal, em placenta e músculo esquelético de pacientes com PE e normais. Contudo, não podemos descartar defeitos nessa via de sinalização como fisiopatologia da PE, pois ainda é necessária a análise dessa via estimulada. / Preeclampsia (PE) is important cause of fetal and maternal mortality around the world and there are evidences that insulin resistance has been implicated in the pathophysiology of preeclampsia. Akt/PKB via is stimulated by insulin and perform several vital functions as growth, survival and cellular metabolism. Objective: to investigate the basal expression of Akt/PKB, proteins that regulate Akt/PKB activity and Akt/PKB substrate in the placenta, skeletal muscle and adipocytes of normal and preeclampsia parturient. Method: samples were collected from 17 normal patients and 17 PE patients, prepared and analyzed by Western blot to quantify the proteins expression involved in signaling cascade of Akt/PKB. Results: the basal expression of P85 in normal placentas was 1.12 (0.83 – 1.62 median and percentiles 25 - 75), and for PE 1.29 (0.89 – 1.96) with p = 0.42; total Akt/PKB expression for normal was 1.85 (1.07 – 3.12) and 1.53 (1.27-3.08) with p = 1.00. The Akt/PKB phospho(ser/thr) substrates activity was not different in placentas of the normal and PE groups and the HSP90 also showed no difference between the groups. In the skeletal muscle the expression of P85 of normal placentas was 1.41 (1.20 – 6.29) and for PE 1.63 (1.32- 1.90) with p = 0.91. Total Akt/PKB expression for normal was 0.96 (0.84 – 1.31) and 1.55 (0.87 – 1.86), p = 0.41. The Akt/PKB phospho(ser/thr) substrates activity was not different in skeletal muscle of the normal and PE groups and the HSP90 also showed no difference between the groups. Total Akt/PKB expression in the adipose tissue of normal placentas was 1.10 (0.53 – 1.73) and for PE 1.66 (0.83 – 2.00) with p = 0.37 and the expression of IRß of normal placentas was 1.58 (0.56 – 3.23) and for PE 2.00 (0.91 – 6.65) with p = 0.53. Conclusions: there was no difference in Akt/PKB via, in basal state, in placentas and skeletal muscle of normal and PE patients. However, we cannot discard defects in this signaling via as pathophysiology of PE, because it is still necessary to analyze this via during stimulation.

A pré-eclâmpsia (PE) é causa importante de mortalidade fetal e materna em todo mundo e existem evidências que a resistência à insulina esteja implicada em sua fisiopatologia. A via Akt/PKB é estimulada pela insulina e exerce várias funções vitais como crescimento, sobrevivência e metabolismo celular. Objetivo: investigar a expressão basal da Akt/PKB, proteínas que regulam sua atividade e de seus substratos em placenta, músculo esquelético e adipócitos de parturientes normais e com pré-eclâmpsia. Método: amostras de 17 pacientes normais e 17 pacientes com PE foram coletadas, preparadas e analisadas por Western blot para quantificação da expressão de proteínas envolvidas na cascata de sinalização da Akt/PKB. Resultados: em placentas a expressão basal da P85 foi 1,12 (0,83 – 1,62 mediana e percentils 25 - 75), para normais e 1,29 (0,89 – 1,96) para PE com p = 0,42; a expressão da Akt/PKB total foi 1,85 (1,07 - 3,12) para normais e 1,53 (1,27-3,08) com p = 1,00. A atividade dos substratos da Akt/PKB fosforilados em serina e treonina foi semelhante entre placentas de parturientes normais e PE, e a expressão da HSP90 também se mostrou semelhante entre os dois grupos. No músculo esquelético a expressão da P85 foi de 1,41 (1,20 - 6,29) para normais e 1,63 (1,32- 1,90) para PE com p = 0,91. A expressão de Akt/PKB total foi de 0,96 (0,84 - 1,31) para normais e 1,55 (0,87 - 1,86), p = 0,41. A atividade dos substratos da Akt/PKB fosforilados em serina e treonina foi semelhante nesse tecido entre normais e PE, e a expressão da HSP90 também se mostrou semelhante entre os dois grupos no músculo esquelético. No tecido adiposo a expressão de Akt/PKB total foi 1,10 (0,53 - 1,73) em normais e 1,66 (0,83 - 2,00) em PE com p = 0,37 e a expressão do IRß; 1,58 (0,56 - 3,23) para normais e 2,00 (0,91 - 6,65) para PE com p = 0,53. Conclusões: Não houve diferença na via da Akt/PKB, em estado basal, em placenta e músculo esquelético de pacientes com PE e normais. Contudo, não podemos descartar defeitos nessa via de sinalização como fisiopatologia da PE, pois ainda é necessária a análise dessa via estimulada. / Preeclampsia (PE) is important cause of fetal and maternal mortality around the world and there are evidences that insulin resistance has been implicated in the pathophysiology of preeclampsia. Akt/PKB via is stimulated by insulin and perform several vital functions as growth, survival and cellular metabolism. Objective: to investigate the basal expression of Akt/PKB, proteins that regulate Akt/PKB activity and Akt/PKB substrate in the placenta, skeletal muscle and adipocytes of normal and preeclampsia parturient. Method: samples were collected from 17 normal patients and 17 PE patients, prepared and analyzed by Western blot to quantify the proteins expression involved in signaling cascade of Akt/PKB. Results: the basal expression of P85 in normal placentas was 1.12 (0.83 – 1.62 median and percentiles 25 - 75), and for PE 1.29 (0.89 – 1.96) with p = 0.42; total Akt/PKB expression for normal was 1.85 (1.07 – 3.12) and 1.53 (1.27-3.08) with p = 1.00. The Akt/PKB phospho(ser/thr) substrates activity was not different in placentas of the normal and PE groups and the HSP90 also showed no difference between the groups. In the skeletal muscle the expression of P85 of normal placentas was 1.41 (1.20 – 6.29) and for PE 1.63 (1.32- 1.90) with p = 0.91. Total Akt/PKB expression for normal was 0.96 (0.84 – 1.31) and 1.55 (0.87 – 1.86), p = 0.41. The Akt/PKB phospho(ser/thr) substrates activity was not different in skeletal muscle of the normal and PE groups and the HSP90 also showed no difference between the groups. Total Akt/PKB expression in the adipose tissue of normal placentas was 1.10 (0.53 – 1.73) and for PE 1.66 (0.83 – 2.00) with p = 0.37 and the expression of IRß of normal placentas was 1.58 (0.56 – 3.23) and for PE 2.00 (0.91 – 6.65) with p = 0.53. Conclusions: there was no difference in Akt/PKB via, in basal state, in placentas and skeletal muscle of normal and PE patients. However, we cannot discard defects in this signaling via as pathophysiology of PE, because it is still necessary to analyze this via during stimulation.

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade do Extremo Sul Catarinense – UNESC, para obtenção do título de Doutora em Ciências da Saúde. / The present study aimed to evaluate neurochemical and behavioral parameters in early and late phases in male Wistar rats (60 days old, 250-300g) subjected to an animal model of sepsis induced by cecal ligation and perforation. This work was divided in 3 steps: in the Experiment I, the animals were divided into groups Sham (control), Sepsis 30 days or Sepsis 60 days, with n=12. After, were dissected the prefrontal cortex, hippocampus, striatum and cortex in order to evaluate thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) levels; carbonyl groups; activities of complexes I, II, II-III and IV of the mitochondrial respiratory chain and creatine kinase (CK). The cerebrospinal fluid was collected for quantification of TNF-, IL-1 and IL-6 cytokines, with n=5. In the Experiment II, the animals were divided into groups Sham, Sepsis and Sepsis+Sodium butyrate (SB), for (24 hours and 10 days), with n=12. SB or artificial cerebrospinal fluid were injected in the lateral ventricle in the brain of animals. After 24 hours or 10 days were dissected prefrontal cortex, hippocampus, striatum and cortex for histone deacetylase (HDAC) activity analysis. The inhibitory avoidance test was performed after 10 days of sepsis induction. In Experiment III, the animals were subjected to sham or sepsis 24 hours and 10 days, with n=5. After, the hippocampus was dissected for quantification of the phosphorylation levels of proteins ERK1/2, JNK1/2 and p38MAPK by Western blotting. The results of Experiment I showed increased levels of IL-6 in the sepsis group (30 days); increased levels of TNF- in the sepsis group (60 days); increased levels of TBARS in the prefrontal cortex and decreased in the hippocampus, striatum and cortex in the sepsis group (30 days); decreased carbonyl groups in the prefrontal cortex and the striatum and increased in the sepsis group (30 days); decreased levels of TBARS in the hippocampus in the sepsis group (60 days); increased carbonyl groups in the striatum in sepsis group (60 days); increased complex IV activity in the hippocampus in the sepsis group (30 days); decreased complex I activity in the prefrontal cortex, hippocampus and striatum in the sepsis group (60 days) and no statistical difference of CK activity in all analyzed brain structures. All data were analyzed by comparing the sepsis group (30 and 60 days) with the sham group. The results of Experiment II showed a decrease in latency in the animals of sepsis group (10 days) in the inhibitory avoidance test and the administration of SB reversed the cognitive damage observed in these animals. There was also an increase in HDACs activity in hippocampus and cortex in the sepsis group (24 hours) and prefrontal cortex and hippocampus in sepsis group (10 days). Moreover, the administration of SB inhibited HDAC activity in the prefrontal cortex and hippocampus of animals from sepsis group (10 days). All data were analyzed by comparing the sepsis group (24 hours and 10 days) with the sham group. The results of Experiment III showed no statistical difference between the sham and sepsis groups on the levels of phosphorylation of proteins ERK1/2, JNK1/2 and p38MAPK in 24 hours and 10 days after sepsis induction. Taken together, the results of the present study may contribute for comprehending the cognitive damage observed in sepsis survivor rats, providing new insights that might have clinical relevance. / O objetivo deste estudo foi avaliar parâmetros neuroquímicos e comportamentais em fases iniciais e tardias em ratos submetidos ao modelo animal de sepse induzido por ligação e perfuração cecal. No experimento I, ratos Wistar machos (60 dias, 250-300g) foram divididos entre os grupos Sham (controle), Sepse 30 dias e Sepse 60 dias, com n=12. Após, foram retirados o córtex pré-frontal, hipocampo, estriado e córtex para análises dos níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS); conteúdo de grupos carbonila; atividade dos complexos I, II, II-III e IV da cadeia respiratória mitocondrial e da enzima creatina quinase (CK). O fluido cerebrospinal foi coletado para quantificação das citocinas TNF-, IL-1 e IL-6, com n=5. No experimento II, os animais foram divididos entre os grupos Sham, Sepse e Sepse+Butirato de sódio (SB) (24 horas e 10 dias), com n=12. Por meio de cirurgia estereotáxica, SB ou fluido cerebroespinal artificial foram injetados no ventrículo lateral cerebral dos animais. Em 24 horas e 10 dias após, foram retirados o córtex pré-frontal, hipocampo, estriado e córtex, para análise da atividade de histonas desacetilases (HDAC). O teste de esquiva inibitória foi realizado 10 dias após a indução de sepse. No experimento III, os animais foram divididos entre os grupos sham e sepse 24 horas e 10 dias, com n=5. Após, o hipocampo foi retirado para quantificação dos níveis de fosforilação das proteínas ERK1/2, JNK1/2 e p38MAPK por Western blotting. Os resultados do Experimento I mostraram um aumento nos níveis de IL-6 no grupo sepse (30 dias); aumento nos níveis de TNF- no grupo sepse (60 dias); um aumento nos níveis de TBARS em córtex pré-frontal e uma diminuição destes níveis em hipocampo, estriado e córtex no grupo sepse (30 dias); uma diminuição do conteúdo de grupos carbonila em córtex pré-frontal e um aumento em estriado no grupo sepse (30 dias); uma diminuição nos níveis de TBARS em hipocampo no grupo sepse (60 dias); aumento do conteúdo de grupos carbonila em estriado no grupo sepse (60 dias). Também houve um aumento na atividade do complexo IV em hipocampo no grupo sepse (30 dias); uma diminuição na atividade do complexo I em córtex pré-frontal, hipocampo e estriado no grupo sepse (60 dias) e nenhuma diferença estatística na atividade da CK entre as estruturas cerebrais analisadas. Todos os dados foram analisados comparando o grupo sepse (30 e 60 dias) com o grupo sham. Já os resultados do Experimento II mostraram uma diminuição no tempo de latência nos animais do grupo sepse (10 dias) no teste de esquiva inibitória e a administração de SB reverteu o dano cognitivo observado nestes animais. Também foi observado um aumento na atividade de HDACs em hipocampo e córtex no grupo sepse (24 horas) e em córtex pré-frontal e hipocampo no grupo sepse (10 dias). Além disso, a administração de SB inibiu a atividade de HDACs em córtex pré-frontal e hipocampo dos animais do grupo sepse (10 dias). Todos os dados foram analisados comparando o grupo sepse (24 horas e 10 dias) com o grupo sham. Por fim, os resultados do Experimento III mostraram que não houve diferença significativa entre os grupos sham e sepse nos níveis de fosforilação das proteínas ERK1/2, JNK1/2 e p38MAPK em 24 horas e 10 dias após a sepse. Tomados em seu conjunto, os dados deste estudo podem contribuir para a compreensão do dano cognitivo observado em ratos sobreviventes à sepse, proporcionando novos conhecimentos que possam ter relevância clínica.

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós Graduação em Ciências da Saúde, da Universidade do Extremo Sul Catarinense – UNESC, para obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde. / O hábito de fumar induz diversas alterações ao sistema cardíaco e isso pode estar relacionado, pelo menos em parte, à excessiva formação de espécies reativas de oxigênio. Evidência recente demonstra que o acúmulo de espécies reativas está envolvido em vários processos importantes, um deles é a autofagia. Uma das moléculas envolvidas na regulação da autofagia é a AMPK. A AMPK estimula a ULK e consequentemente outras proteínas relacionadas a autofagia. No entanto, o conhecimento sobre esse processo carece de maiores investigações. Diante disso, o presente estudo avaliou o envolvimento das espécies reativas de oxigênio no processo autofágico no músculo cardíaco de camundongos expostos à fumaça de cigarro. Foram utilizados camundongos Swiss expostos à 4 cigarros comerciais com filtro por sessão, 3 sessões/dia, todos os dias da semana por 7, 15, 30 e 45 dias (n=10) e o grupo controle. Os animais sofreram eutanásia, o tecido cardíaco foi removido e realizado análises moleculares e bioquímicas. Nos grupos expostos à fumaça de cigarro por 30 e 45 dias, observou-se maiores alterações no processo autofágico no tecido cardíaco; o tempo de 30 dias de exposição foi utilizado para os experimentos posteriores (suplementação com N-acetilcisteína e cessação da fumaça de cigarro por 30 dias). Após protocolo de exposição, suplementação e cessação da fumaça de cigarro por 30 dias os animais sofreram eutanásia, o tecido cardíaco foi removido e realizado análises bioquímicas e moleculares. Os resultados demonstraram que a exposição à fumaça de cigarro por diferentes dias aumentou a produção de espécies reativas de oxigênio, fosforilação de AMPK e ULKser317, níveis proteicos de sestrina 2, Atg5 e LC3 II e diminuiu a fosforilação de mTOR. Após o uso de antioxidante e a cessação da fumaça de cigarro por 30 dias, a produção de espécies reativas de oxigênio foi significamente menor nos grupos suplementados e cessados por 30 dias em relação aos animais expostos por 30 dias. Em adição, a fosforilação de AMPK e ULKser317 e os níveis proteicos de sestrina 2, Atg5 e LC3 II foram menores nesses grupos. Além disso, a fosforilação de mTOR foi aumentada nos grupos suplementados com n-acetilcisteína e no grupo com cessação da fumaça. Os resultados demonstraram que a exposição da fumaça de cigarro aumenta a autofagia mediada pelas espécies reativas de oxigênio no tecido cardíaco de camundongos Swiss.

A pré-eclâmpsia (PE) é causa importante de mortalidade fetal e materna em todo mundo e existem evidências que a resistência à insulina esteja implicada em sua fisiopatologia. A via Akt/PKB é estimulada pela insulina e exerce várias funções vitais como crescimento, sobrevivência e metabolismo celular. Objetivo: investigar a expressão basal da Akt/PKB, proteínas que regulam sua atividade e de seus substratos em placenta, músculo esquelético e adipócitos de parturientes normais e com pré-eclâmpsia. Método: amostras de 17 pacientes normais e 17 pacientes com PE foram coletadas, preparadas e analisadas por Western blot para quantificação da expressão de proteínas envolvidas na cascata de sinalização da Akt/PKB. Resultados: em placentas a expressão basal da P85 foi 1,12 (0,83 – 1,62 mediana e percentils 25 - 75), para normais e 1,29 (0,89 – 1,96) para PE com p = 0,42; a expressão da Akt/PKB total foi 1,85 (1,07 - 3,12) para normais e 1,53 (1,27-3,08) com p = 1,00. A atividade dos substratos da Akt/PKB fosforilados em serina e treonina foi semelhante entre placentas de parturientes normais e PE, e a expressão da HSP90 também se mostrou semelhante entre os dois grupos. No músculo esquelético a expressão da P85 foi de 1,41 (1,20 - 6,29) para normais e 1,63 (1,32- 1,90) para PE com p = 0,91. A expressão de Akt/PKB total foi de 0,96 (0,84 - 1,31) para normais e 1,55 (0,87 - 1,86), p = 0,41. A atividade dos substratos da Akt/PKB fosforilados em serina e treonina foi semelhante nesse tecido entre normais e PE, e a expressão da HSP90 também se mostrou semelhante entre os dois grupos no músculo esquelético. No tecido adiposo a expressão de Akt/PKB total foi 1,10 (0,53 - 1,73) em normais e 1,66 (0,83 - 2,00) em PE com p = 0,37 e a expressão do IRß; 1,58 (0,56 - 3,23) para normais e 2,00 (0,91 - 6,65) para PE com p = 0,53. Conclusões: Não houve diferença na via da Akt/PKB, em estado basal, em placenta e músculo esquelético de pacientes com PE e normais. Contudo, não podemos descartar defeitos nessa via de sinalização como fisiopatologia da PE, pois ainda é necessária a análise dessa via estimulada. / Preeclampsia (PE) is important cause of fetal and maternal mortality around the world and there are evidences that insulin resistance has been implicated in the pathophysiology of preeclampsia. Akt/PKB via is stimulated by insulin and perform several vital functions as growth, survival and cellular metabolism. Objective: to investigate the basal expression of Akt/PKB, proteins that regulate Akt/PKB activity and Akt/PKB substrate in the placenta, skeletal muscle and adipocytes of normal and preeclampsia parturient. Method: samples were collected from 17 normal patients and 17 PE patients, prepared and analyzed by Western blot to quantify the proteins expression involved in signaling cascade of Akt/PKB. Results: the basal expression of P85 in normal placentas was 1.12 (0.83 – 1.62 median and percentiles 25 - 75), and for PE 1.29 (0.89 – 1.96) with p = 0.42; total Akt/PKB expression for normal was 1.85 (1.07 – 3.12) and 1.53 (1.27-3.08) with p = 1.00. The Akt/PKB phospho(ser/thr) substrates activity was not different in placentas of the normal and PE groups and the HSP90 also showed no difference between the groups. In the skeletal muscle the expression of P85 of normal placentas was 1.41 (1.20 – 6.29) and for PE 1.63 (1.32- 1.90) with p = 0.91. Total Akt/PKB expression for normal was 0.96 (0.84 – 1.31) and 1.55 (0.87 – 1.86), p = 0.41. The Akt/PKB phospho(ser/thr) substrates activity was not different in skeletal muscle of the normal and PE groups and the HSP90 also showed no difference between the groups. Total Akt/PKB expression in the adipose tissue of normal placentas was 1.10 (0.53 – 1.73) and for PE 1.66 (0.83 – 2.00) with p = 0.37 and the expression of IRß of normal placentas was 1.58 (0.56 – 3.23) and for PE 2.00 (0.91 – 6.65) with p = 0.53. Conclusions: there was no difference in Akt/PKB via, in basal state, in placentas and skeletal muscle of normal and PE patients. However, we cannot discard defects in this signaling via as pathophysiology of PE, because it is still necessary to analyze this via during stimulation.