As alquilfosfocolinas (APC) são uma classe de fármacos derivados de fosfolipídios endógenos que apresentam potencial antitumoral. Diferentemente de outros fármacos antitumorais que agem no DNA da célula, as APCs têm como primeiro local de ação a membrana plasmática e proteínas de sinalização, como a PKC. O objetivo desse trabalho é elucidar, através de metodologias computacionais, os possíveis mecanismos de ação das APCs que provocam hemólise, inibição da PKC e interação com membranas celulares. Inicialmente, a toxicidade de um conjunto de 34 APCs foi estudada pelos métodos quimiométricos de Análise de Agrupamentos Hierárquicos (HCA) e Componentes Principais (PCA). As moléculas foram simuladas com dinâmica molecular (DM) e propriedades físico-químicas e estruturais foram calculadas para os confôrmeros de menor energia. Após aplicação de HCA e PCA, as APCs foram divididas em 3 grupos, de acordo com suas características estruturais. Os resultados sugerem que a presença de grupos catiônicos volumosos, ou anéis como adamantila e ciclohexila, aumentam a hemólise de compostos de cadeia alquílica longa. Anéis macrocíclicos como ciclopentadecila parecem ser importantes para o potencial hemolítico de compostos com cadeia alquílica curta. Com relação a compostos sem anéis e de cadeia linear, grupos catiônicos menos volumosos parecem favorecer a hemólise. Na próxima etapa do estudo, 7 derivados de APC, com diferentes grupos catiônicos, foram selecionados e ancorados no domínio C2 da PKCα. O intuito foi mapear resíduos de aminoácidos importantes para a interação dos ligantes com a enzima, e comparar com o modo de ligação do ativador endógeno fosfatidilserina (PS). Mais uma vez, HCA e PCA foram aplicados para extrair informação relevante do mapeamento. Os resultados mostraram que as cadeias laterais de Pro188, Asn189, Arg216, Trp247, Asp249 e Thr250 não permitem a aproximação adequada do ligante, o que impede que a porção fosforila se coordene com um dos átomos de cálcio. A porção catiônica da PS, em contrapartida, consegue estabelecer ligação-hidrogênio com Asn189 de forma a posicionar os oxigênios da fosforila para interagir, ao mesmo tempo, com o átomo de cálcio. Com menos pontos de coordenação, a afinidade de ligação do cálcio pela PKCα diminui e a ativação da enzima fica comprometida, interrompendo toda a cascata de sinalização que depende dela. A parte final desse trabalho se dedicou ao estudo da interação da miltefosina com diferentes bicamadas lipídicas sob o ponto de vista termodinâmico. Oito bicamadas de diferentes fosfolipídios foram simuladas por DM e a interação energética da miltefosina foi calculada por Umbrella Sampling. Os resultados mostraram que a miltefosina apresenta maior partição em bicamadas contendo colesterol, sendo a miscibilidade nesses sistemas cerca de 76 vezes maior que os valores encontrados para bicamadas sem colesterol. Além disso, verificou-se que a internalização da miltefosina é mais fácil em regiões contendo lipídeos poli-insaturados, provavelmente devido ao empacotamento mais frouxo da bicamada. Os dados sugerem que a miltefosina age principalmente em rafts lipídicos e que células contendo mais lipídicos poli-insaturados podem incorporar maior quantidade do fármaco. / Alquilfosfocolines (APCs) comprise a class of drugs with antitumor activity derived from endogenous phospholipids. Differently from other drugs whose primary site of action is the DNA, APCs act firstly in the plasma membrane and signaling proteins, such as PKC. The main objective of this work is to elucidate, via computational approaches, the possible mechanisms of actions that cause hemolysis, PKC inhibition and interaction with cellular membranes. Initially, a set of 34 APCs was studied by means of Hierarchical Cluster Analysis (HCA) and Principal Component Analysis (PCA). The molecules were simulated by means of molecular dynamics simulations (MD) and molecular and structural properties were calculated for the lowest-energy conformer. After HCA and PCA methodologies, the set was divided into 3 groups according to their structural features. The findings suggest that the presence of bulky cationic moieties, or the adamantyl and cyclohexil rings, increase the hemolytic potential of compounds with long alkyl chains. Macrocyclic rings, such as cyclopentadecyl, seem to be important to elevate the hemolysis of compounds with short alkyl chains. Regarding linear carbon chain derivatives with no ring substitution, less bulky cationic head groups seem to favor hemolysis. In the next step of this work, 7 APC derivatives were selected and docked in the C2 domain of PKCα. The aim now was to map the residues relevant for ligands interaction compared to the binding mode of the endogenous activator, phosphatidylserine (PS). HCA and PCA were again applied in order to extract relevant information from the mapping. The results showed that the lateral chains of Pro188, Asn189, Arg216, Trp247, Asp249 and Thr250 do not allow the proper approximation of the ligands, impeding the phosphoryl moiety from coordinating with one of the calcium atoms. On the other hand, the cationic moiety of PS forms hydrogen-bonding with Asn189 in order to position the oxygens to interact, at the same time, with a calcium atom. With less coordination sites, calcium binding affinity diminishes and the enzyme activation is compromised, interrupting the signaling cascade. The final part of this work was dedicated to the study of miltefosine interaction with different lipid bilayers from the thermodynamics standpoint. Eight bilayers were simulated with MD and the energetic interaction was calculated via Umbrella Sampling simulations. The findings showed that miltefosine has higher partition in bilayers containing cholesterol, with miscibility of about 76 times higher than the values referring to bilayers without cholesterol. Moreover, it was observed that the internalization of miltefosine is facilitated in regions containing polyunsaturated lipids, probably due to the looser packing. The data suggest that miltefosine acts primarily in lipid rafts, and that cells containing more polyunsaturated lipids in their membranes can incorporate higher quantities of this drug.

As doenças isquêmicas representam a principal causa de mortalidade e morbidade no mundo. Dessa forma, o melhor entendimento dos sinais intracelulares envolvidos no estabelecimento e propagação do dano induzido pela isquemia-reperfusão (I/R) é essencial para o desenvolvimento de novas estratégias, futuramente utilizadas na prevenção e no tratamento do infarto agudo do miocárdio, acidente vascular cerebral e isquemia renal. O processo de isquemia-reperfusão gera danos irreparáveis aos tecidos acometidos. A reperfusão do tecido afetado, que ficara temporariamente mantido em hipóxia (com baixa tensão de oxigênio), resulta em um brusco aporte de oxigênio (alta tensão de oxigênio) e consequente colapso metabólico, caracterizado pela disfunção mitocondrial associada à elevada produção de radicais livres. Recentemente demonstramos que estímulos cardioprotetores (ex. pré-condicionamento isquêmico e etanol) são acompanhados pela ativação da proteína quinase C isoforma épsilon (PKCε), aumento de sua translocação para a mitocôndria e consequente fosforilação/ativação da enzima mitocondrial aldeído desidrogenase 2 (ALDH2). A ALDH2 é uma enzima chave na proteção contra danos isquêmicos devido a sua capacidade de oxidar aldeídos, como 4-hidroxi-2-nonenal e acetaldeído, produzidos durante estresse oxidativo. Semelhante ao pré-condicionamento isquêmico, o exercício físico (EF) também promove um aumento da tolerância do miocárdio à lesão de isquemia-reperfusão, entretanto os mecanismos celulares envolvidos nessa cardioproteção ainda são pouco compreendidos. No presente projeto de pesquisa buscamos validar o eixo intracelular PKCε-ALDH2 como possível mecanismo cardioprotetor induzido pelo EF frente estresse de isquemia-reperfusão. Inicialmente, utilizando camundongos selvagens, avaliamos se o exercício físico (7 dias consecutivos) modula a PKCε e a ALDH2, e se essa resposta é transiente ou sustentada. Em seguida, por meio da técnica de isquemia-reperfusão ex vivo (Langendorff), avaliamos a participação individual da PKCε e ALDH2 na cardioproteção mediada pelo exercício físico. Nossos resultados mostram que o exercício físico aumenta a expressão da PKCε no cardiomiócito de forma transiente, visto que 24h após a última sessão de exercício físico esse valor foi restabelecido, e a ALDH2 mostrou aumento sustentado em sua atividade, mantida até mesmo 24h após a última sessão de exercício físico. Além disso, sete dias de exercício físico é capaz de proteger o coração da lesão de isquemia e reperfusão. Entretanto, quando foram utilizados inibidores específicos ou animais geneticamente modificados, essa cardioproteção foi perdida. Assim, nossos resultados sugerem um papel importante do eixo PKCε-ALDH2 na cardioproteção induzida pelo exercício físico frente a uma lesão por isquemia/reperfusão. / Ischemic diseases are the leading cause of mortality and morbidity worldwide. Thus, a better understanding of the intracellular signals involved in the establishment and propagation of damage induced by ischemia-reperfusion is essential to the development of new strategies that can be used in the prevention and treatment of myocardial infarction, stroke and renal ischemia. The process known as ischemia-reperfusion (I/R) causes irreparable damage to the affected tissues due to the wide variation in tissue oxygen tension. Reperfusion of the affected tissue, which had been temporarily maintained at hypoxia (low oxygen tension), results in abrupt oxygen supply (high oxygen tension) and consequent metabolic collapse, characterized by mitochondrial dysfunction associated with high production of free radicals. We recently demonstrated that cardioprotective stimuli (i.e. ischemic preconditioning and ethanol) are accompanied by increased translocation of protein kinase C isoform epsilon (PKCε) to the mitochondria and subsequent phosphorylation-activation of mitochondrial aldehyde dehydrogenase enzyme 2 (ALDH2), which has an inverse correlation with myocardial injury. ALDH2 is a key enzyme in the protection against ischemic damage due to its capacity to oxidize aldehydes (i.e. acetaldehyde and 4-hydroxynonenal) produced during oxidative stress. Similar to ischemic preconditioning, exercise promotes increased myocardial tolerance to ischemia-reperfusion injury; however, the cellular mechanisms involved in this process are still poorly understood. We proposed to validate the intracellular PKCε-ALDH2 axis as a possible exercise-mediated cardioprotective mechanism upon ischemia-reperfusion. Firstly, using wild-type mice, we evaluated whether exercise (7 consecutive days) modulates the activity of PKCε and ALDH2 (transient vs. sustained). Then, through the ex vivo ischemia-reperfusion technique (Langendorff), we evaluated the individual participation of PKCε and ALDH2 in exercise-mediated cardioprotection. Our results show that physical exercise increases the cardiomyocyte PKCε levels in a transient way, since this response was reestablished 24h after the last physical exercise session. Moreover, ALDH2 showed a sustained increase in its activity, which was maintained even 24h after the last session. In addition, seven days of physical exercise was able to protect the heart from ischemia and reperfusion injury, whereas this cardioprotection was lost when specific inhibitors or genetically modified animals (PKCε knockout mice and ALDH2 knock-in mice) were used. Thus, our results suggest an important role of the PKCε-ALDH2 axis in the cardioprotection induced by exercise against ischemia/reperfusion injury.

As alquilfosfocolinas (APC) são uma classe de fármacos derivados de fosfolipídios endógenos que apresentam potencial antitumoral. Diferentemente de outros fármacos antitumorais que agem no DNA da célula, as APCs têm como primeiro local de ação a membrana plasmática e proteínas de sinalização, como a PKC. O objetivo desse trabalho é elucidar, através de metodologias computacionais, os possíveis mecanismos de ação das APCs que provocam hemólise, inibição da PKC e interação com membranas celulares. Inicialmente, a toxicidade de um conjunto de 34 APCs foi estudada pelos métodos quimiométricos de Análise de Agrupamentos Hierárquicos (HCA) e Componentes Principais (PCA). As moléculas foram simuladas com dinâmica molecular (DM) e propriedades físico-químicas e estruturais foram calculadas para os confôrmeros de menor energia. Após aplicação de HCA e PCA, as APCs foram divididas em 3 grupos, de acordo com suas características estruturais. Os resultados sugerem que a presença de grupos catiônicos volumosos, ou anéis como adamantila e ciclohexila, aumentam a hemólise de compostos de cadeia alquílica longa. Anéis macrocíclicos como ciclopentadecila parecem ser importantes para o potencial hemolítico de compostos com cadeia alquílica curta. Com relação a compostos sem anéis e de cadeia linear, grupos catiônicos menos volumosos parecem favorecer a hemólise. Na próxima etapa do estudo, 7 derivados de APC, com diferentes grupos catiônicos, foram selecionados e ancorados no domínio C2 da PKCα. O intuito foi mapear resíduos de aminoácidos importantes para a interação dos ligantes com a enzima, e comparar com o modo de ligação do ativador endógeno fosfatidilserina (PS). Mais uma vez, HCA e PCA foram aplicados para extrair informação relevante do mapeamento. Os resultados mostraram que as cadeias laterais de Pro188, Asn189, Arg216, Trp247, Asp249 e Thr250 não permitem a aproximação adequada do ligante, o que impede que a porção fosforila se coordene com um dos átomos de cálcio. A porção catiônica da PS, em contrapartida, consegue estabelecer ligação-hidrogênio com Asn189 de forma a posicionar os oxigênios da fosforila para interagir, ao mesmo tempo, com o átomo de cálcio. Com menos pontos de coordenação, a afinidade de ligação do cálcio pela PKCα diminui e a ativação da enzima fica comprometida, interrompendo toda a cascata de sinalização que depende dela. A parte final desse trabalho se dedicou ao estudo da interação da miltefosina com diferentes bicamadas lipídicas sob o ponto de vista termodinâmico. Oito bicamadas de diferentes fosfolipídios foram simuladas por DM e a interação energética da miltefosina foi calculada por Umbrella Sampling. Os resultados mostraram que a miltefosina apresenta maior partição em bicamadas contendo colesterol, sendo a miscibilidade nesses sistemas cerca de 76 vezes maior que os valores encontrados para bicamadas sem colesterol. Além disso, verificou-se que a internalização da miltefosina é mais fácil em regiões contendo lipídeos poli-insaturados, provavelmente devido ao empacotamento mais frouxo da bicamada. Os dados sugerem que a miltefosina age principalmente em rafts lipídicos e que células contendo mais lipídicos poli-insaturados podem incorporar maior quantidade do fármaco. / Alquilfosfocolines (APCs) comprise a class of drugs with antitumor activity derived from endogenous phospholipids. Differently from other drugs whose primary site of action is the DNA, APCs act firstly in the plasma membrane and signaling proteins, such as PKC. The main objective of this work is to elucidate, via computational approaches, the possible mechanisms of actions that cause hemolysis, PKC inhibition and interaction with cellular membranes. Initially, a set of 34 APCs was studied by means of Hierarchical Cluster Analysis (HCA) and Principal Component Analysis (PCA). The molecules were simulated by means of molecular dynamics simulations (MD) and molecular and structural properties were calculated for the lowest-energy conformer. After HCA and PCA methodologies, the set was divided into 3 groups according to their structural features. The findings suggest that the presence of bulky cationic moieties, or the adamantyl and cyclohexil rings, increase the hemolytic potential of compounds with long alkyl chains. Macrocyclic rings, such as cyclopentadecyl, seem to be important to elevate the hemolysis of compounds with short alkyl chains. Regarding linear carbon chain derivatives with no ring substitution, less bulky cationic head groups seem to favor hemolysis. In the next step of this work, 7 APC derivatives were selected and docked in the C2 domain of PKCα. The aim now was to map the residues relevant for ligands interaction compared to the binding mode of the endogenous activator, phosphatidylserine (PS). HCA and PCA were again applied in order to extract relevant information from the mapping. The results showed that the lateral chains of Pro188, Asn189, Arg216, Trp247, Asp249 and Thr250 do not allow the proper approximation of the ligands, impeding the phosphoryl moiety from coordinating with one of the calcium atoms. On the other hand, the cationic moiety of PS forms hydrogen-bonding with Asn189 in order to position the oxygens to interact, at the same time, with a calcium atom. With less coordination sites, calcium binding affinity diminishes and the enzyme activation is compromised, interrupting the signaling cascade. The final part of this work was dedicated to the study of miltefosine interaction with different lipid bilayers from the thermodynamics standpoint. Eight bilayers were simulated with MD and the energetic interaction was calculated via Umbrella Sampling simulations. The findings showed that miltefosine has higher partition in bilayers containing cholesterol, with miscibility of about 76 times higher than the values referring to bilayers without cholesterol. Moreover, it was observed that the internalization of miltefosine is facilitated in regions containing polyunsaturated lipids, probably due to the looser packing. The data suggest that miltefosine acts primarily in lipid rafts, and that cells containing more polyunsaturated lipids in their membranes can incorporate higher quantities of this drug.

A família proteína quinases C (PKC) é composta por dez isoenzimas, as quais são capazes de fosforilar resíduos de serina e treonina. A ativação dessas quinases envolve mudanças conformacionais, como a remoção do pseudo-substrato do sítio ativo e associação dessas enzimas com lipídeos em membranas biológicas. Além disso, três fosforilações são importantes para a maturação/ enovelamento da enzima e não estão associadas com o estado de ativação das cPKCs. Apesar dessas quinases estarem envolvidas em vários processos patológicos, como carcinogênese e doenças cardiovasculares, ainda não se estabeleceu a relação entre estado de ativação das PKCs com essas doenças. Isso se deve, em parte, à ausência de ferramentas que possibilitam a distinção das formas ativas e inativas das PKCs. Na presente tese, baseando-se em mudanças conformacionais sofridas pelas PKCs durante o processo de ativação, dois anticorpos contra cPKCs ativas foram racionalmente desenvolvidos, sendo um anticorpo policlonal (anti-C2Cat) e outro monoclonal (4.8E). O anticorpo anti-C2Cat foi desenvolvido a partir de imunização de coelhos com um peptídeo localizado na região de interação entre os domínios C2 e catalítico na PKC inativa. Já o anticorpo monoclonal 4.8E foi produzido após a imunização de camundongos Balb/ C com extrato de proteínas proveniente de células HEK293T superexpressando formas constitutivamente ativas da PKCβI. A seletividade de anti-C2Cat e 4.8E por cPKCs ativas foi demonstrada por ensaios de ELISA e de imunoprecipitação, sendo que os anticorpos sempre apresentaram maior afinidade por cPKCs ativas purificadas, superexpressas ou mesmo as endógenas. O anticorpo anti-C2Cat foi capaz de monitorar a dinâmica espaço-temporal da ativação das cPKCs em linhagens de neuroblastoma (Neuro-2A e SK-N-SH) estimuladas com PMA, morfina, ATP ou glutamato por diferentes tempos. Ainda, um maior conteúdo de cPKCs ativas foi detectado por anti-C2Cat na linhagem de câncer de mama MDA-MB-231 (triplo- negativa) do que em células MCF-7 (ER+). Em acordo com esses dados, anti-C2Cat identificou uma maior ativação de cPKCs em tumores mais agressivos de câncer de mama (subtipo triplo-negativo) do que em tumores menos agressivos (ER+, subtipo luminal). Os anticorpos conformacionais anti-C2Cat e 4.8E foram aplicados para elucidar vias de sinalização que levam à carcinogênese em células MDA-MB-231, por meio da realização de ensaios de co-imunoprecipitação, seguida pela identificação das proteínas por espectrometria de massas. Usando essa abordagem, os resultados sugerem que as cPKCs ativas possam estar envolvidas com a tradução de proteínas envolvidas na migração celular, como actina. Em conjunto, os resultado obtidos na presente tese demonstram duas formas racionais de desenvolver anticorpos contra cPKCs ativas, sendo que algumas aplicações para estas ferramentas foram demonstradas. Estratégias baseadas em mudanças conformacionais, similares às apresentadas aqui, poderão ser utilizadas para a produção racional de anticorpos contra outras quinases ou proteínas / The protein kinase C family (PKC) is composed of ten isoenzymes, which are capable of phosphorylating serine and threonine amino acid residues. PKC activation involves conformational changes, such as removing the pseudo-substrate from the active site and binding of the enzyme to lipids in biological membranes. In addition, PKC undergoes three phosphorylations that are important for the maturation/ folding of the enzyme and are not linked with activation status. Despite the fact that these kinases are involved in various pathological processes, such as carcinogenesis and cardiovascular disease, a relationship between PKC activation status with these diseases has not yet been established. This is partly due to the lack of tools to detect active PKC in tissue samples. In this thesis, based on conformational changes suffered by PKC during its activation, two antibodies against active cPKCs were rationally developed; a polyclonal antibody (anti-C2Cat) and a monoclonal (4.8E). Anti-C2Cat was produced after immunization of rabbits with a peptide located at the interface between the C2 and catalytic domains of cPKCs in an inactive PKC. The monoclonal antibody 4.8E was produced after immunization of Balb/C mice with total lysates from HEK293T cells overexpressing constitutively active forms of PKCβI. The anti-C2Cat and 4.8E specificity by active cPKCs was demonstrated by ELISA and immunoprecipitation assays, where the antibodies always showed higher affinity to active cPKCs. Anti-C2Cat was able to detect the temporal and spatial dynamics of cPKC activation upon receptor (morphine, ATP or glutamate) or phorbol ester stimulation in neuroblastoma lines (Neuro-2A and SK-N-SH). Futhermore, anti-C2Cat is able to detect active PKC in human tissues. Higher levels of active cPKC were observed in the more aggressive triple negative breast cancer tumors as compared to the less aggressive estrogen receptor positive tumors. Also, both antibodies were applied to study signaling pathways that lead to carcinogenesis in MDA-MB-231 cells by performing co-immunoprecipitation and mass spectrometry. Using this approach, the results suggest that active cPKCs may be involved in translation of proteins involved in cell migration, such as actin. Taken together, the results obtained in this thesis showed two rational ways to develop antibodies against active cPKCs and some applications for these tools were demonstrated. Strategies based on conformational changes, similar to those presented herein may be used for rational production of antibodies against other kinases and proteins.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-10-17T11:03:10Z No. of bitstreams: 1 lilianesenapinheiro.pdf: 8108520 bytes, checksum: b03200480798ddb2cf88a9276e4c9d8d (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2016-10-22T13:09:54Z (GMT) No. of bitstreams: 1 lilianesenapinheiro.pdf: 8108520 bytes, checksum: b03200480798ddb2cf88a9276e4c9d8d (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-22T13:09:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 lilianesenapinheiro.pdf: 8108520 bytes, checksum: b03200480798ddb2cf88a9276e4c9d8d (MD5) Previous issue date: 2008-06-25 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O diabetes mellitus (DM) reduz a secreção de catecolaminas (CAs) das células cromafins adrenais, sendo esse um evento patofisiológico crítico por favorecer a ocorrência de episódios de hipoglicemia grave decorrentes do próprio tratamento da doença. Vários trabalhos relatam a participação de proteínas quinase C (PKCs) nas vias de síntese e secreção de CAs nas células cromafins. Os objetivos desse trabalho foram analisar o efeito do DM sobre a expressão das isoformas α, ε e ζ de PKC em células cromafins de ratos e avaliar se o controle glicêmico reverte os efeitos da doença. Foram utilizados ratos Wistar com DM induzido por estreptozotocina. Foram estabelecidos três grupos experimentais, ratos controles (C), diabéticos tratados com salina (DTS) ou com insulina (DTI). As análises foram feitas 15 dias após a indução. Utilizamos as técnicas de imunohistoquímica e Western Blot. A insulinoterapia foi estabelecida após estudos do comportamento alimentar e da variação dos níveis glicêmicos de ratos controles e doentes durante 24h consecutivas. Foi testada a eficácia de diferentes esquemas de tratamento com insulina. O tratamento estabelecido consistiu em injeções de insulina NPH, sendo 1U aplicada às 13h e 4U às 19h. Após os 15 dias de tratamento, o ganho médio de massa corporal dos ratos C (+37±3g) e DTI (+43±3g) foram similares enquanto os DTS emagreceram (-9±6g). A média da glicemia de jejum dos ratos C (74±1mg/dl) e dos DTI (93±6mg/dl) foram similares e dentro dos níveis normais, enquanto que a dos ratos DTS foi elevada (471±23mg/dl). A insulinoterapia restabeleceu os níveis plasmáticos do colesterol total, c-LDL e c-VLDL nos ratos DTI. O DM não alterou os níveis de c-HDL, triglicerídos e frutosamina. As análises da expressão de PKCs mostraram que a PKCα é a mais expressada seguida de ζ e depois de ε. O DM reduziu em 39,5% a expressão da PKCα, enquanto a de ζ foi aumentada em 74,2%. A expressão da PKCε não foi afetada pelo DM. O tratamento com insulina reverteu o efeito do DM sobre a expressão de PKCα, a expressão da PKCε continuou inalterada e a expressão da PKCζ permaneceu elevada (+32,6%) quando comparada aos ratos C. Concluímos que em células cromafins adrenais, o diabetes afeta a expressão de isoformas de PKCs de maneira diferenciada. Trabalhos realizados em nosso laboratório mostraram que o DM reduz o conteúdo total (21,1%), a secreção basal (-24,3%) e a estimulada por carbacol (-28,9%) e K+ (42,2%) de CAs. Como observado para PKCα, a insulinoterapia reverteu o efeito do DM sobre o conteúdo total. Já foi demonstrado que PKCα participa de uma via de sinalização que estimula a atividade de tirosina hidroxilase. Por outro lado, o tratamento não restabeleceu os processos secretórios, sugerindo que PKCζ possa estar envolvida nessa alteração. Há fortes evidências de que PKCζ regula canais de K+ retificadores, o que pode explicar o efeito da doença sobre o processo de secreção via despolarização da membrana. / The diabetes mellitus (DM) reduces the catecholamine (CAs) secretion of adrenal chromaffin cells, a critical pathophysiologic event that promotes the occurrence of serious hypoglycemia episodes, consequence of the disease treatment. Several papers report the participation of protein kinase C (PKC) on catecholamine synthesis signal pathways of adrenal chromaffin cells. The objectives of this work were to study the effect of DM on expression of PKC isoforms α, ε and ζ in rat chromaffin cells and to evaluate if the glicemic control revert the effect of the illness. Male Wistar rats with diabetes induced by streptozotocin were used. Three experimental groups were determined: Control (C), diabetic rats receiving saline solution (DS) and diabetic rats receiving insulin (DI). The analyses were made after 15 days of DM induction. Immunohistochemistry and western blotting techniques were done. The insulin therapy protocol was established after studying the feeding behavior and glycemic level variations during the whole 24h. The information made possible to establish the time of insulin applications. Several schemes of insulin treatments were tested to keep the diabetic rat as close as possible to normoglycemia path. The best results were found by using 1U at 1:00 PM and 4U at 7:00 PM of NPH insulin. After 15 days of treatment the acquired body weight was similar between C and DI rats, 37±3g and 43±3g, respectively. The DS rats emaciated 9±6g. The fasting glycemic levels were 74±1mg/dl, 93±6mg/dl and 471±23mg/dl to C, DI and DS rats, respectively. The insulin therapy reestablishes the plasmic levels of total cholesterol, c-LDL and c-VLDL on DI rats. The DM did not change the levels of c-HDL, triglycerides and frutosamine. The PKCα is the more expressed isoform in adrenal chromaffin cells, followed by ζ and ε. The DM reduced 39,5% the PKCα expression and, unlike, increased 74,2% the expression of PKCζ. The expression of PKCε was not affected by DM. The insulin treatment reverted the effect of DM on PKCα, the expression of PKCε remained unchanged and the expression of PKCζ remained higher than the control group (+32,6%). Studies of our laboratory show that the DM causes reduction on adrenal catecholamine content (21,1%), basal secretion (-24,3%) and catecholamine secretion stimulated by carbachol (-28,9%) and high K+ (-42,2%). The insulin therapy, in like manner as observed on PKCα, reverted the DM effect on adrenal catecholamine content. It was shown that PKCα participates on signal transduction pathway that stimulates the activity of tyrosine hydroxylase. Otherwise, the insulin treatment did not restore the secretory processes, suggesting that PKCζ could be involved in this process. There are strong evidences showing that PKCζ regulates the voltage-dependent delayed rectifier K (Kv) and its expression was not normalized by insulin therapy.