O crescimento da expectativa de vida média da população mundial tem sido acompanhado do aumento na prevalência de doenças neurodegenerativas, como a doença de Parkinson, isquemia cerebral e, especialmente, a doença de Alzheimer. A doença de Alzheimer (DA) caracteriza-se por um crescente declínio na função mental e memória do paciente. Estes sintomas são explicados por uma profunda perda neuronal e pela presença de alterações estruturais no tecido cerebral: as placas senis, extracelulares e os emaranhados neurofibrilares, intracelulares. O passo que desencadeia a neurodegeneração na DA é ainda objeto de estudo, mas a hipótese mais aceita atualmente é a de que a secreção anormal do peptídeo β amilóide (Aβ), principal componente das placas senis, dê início ao processo. O presente trabalho teve como objetivos investigar a toxicidade induzida pelo peptídeo Aβ1-42 e seu fragmento, o peptídeo Aβ25-35 em culturas organotípicas de hipocampo de ratos. Na primeira parte do trabalho, investigamos a toxicidade induzida pela exposição de culturas organotípicas de hipocampo de ratos a 10 ou 20 μM do peptídeo Aβ1-42, por 24 ou 72 h. Além disso, investigamos o envolvimento das proteínas iNOS e GSK-3β no mecanismo de morte celular induzida pelo peptídeo Aβ1-42. Na segunda parte do trabalho, investigamos a toxicidade induzida pelo fragmento Aβ25-35 na concentração de 25 μM, nos tempos de 1, 3, 6, 12, 24 ou 48 h de exposição às culturas organotípicas, e seu efeito sobre as proteínas Akt, GSK-3β e PTEN. A morte celular foi quantificada pela incorporação do iodeto de propídeo, corante marcador excluído de células sadias, e as proteínas foram quantificadas por imunodetecção com o uso de anticorpos específicos. Nossos resultados mostraram que o peptídeo Aβ1-42 apresentou toxicidade nas concentrações de 10 e 20 μM, induzindo a uma considerável morte celular após 72 h de exposição. A análise do imunoconteúdo da proteína iNOS mostrou um aumento significativo em relação ao controle, após 72 h de exposição ao peptídeo e na concentração de 20 μM. Os resultados obtidos na segunda parte do trabalho mostraram uma morte celular significativa apenas após 48 h de exposição ao peptídeo Aβ25- 35 na concentração de 25 μM. O tratamento com peptídeo Aβ25-35 levou ao aumento no estado de fosforilação da proteína Akt após 6 h de exposição e também da proteína GSK-3β, um potencial substrato da Akt. Após 12 h de exposição ao peptídeo, observamos uma diminuição de ambas as proteínas (Akt e GSK-3β). Porém, após 24 h de exposição ao peptídeo, a proteína Akt continua menos fosforilada enquanto que a proteína GSK-3β apresenta um novo pico de fosforilação. O imunoconteúdo da proteína fosfatase PTEN apresentou um aumento significativo em 24 h e 48 h. Os resultados do presente estudo mostraram que o tratamento das culturas organotípicas de hipocampo de ratos com o peptídeo Aβ1-42 como com o fragmento Aβ25-35 apresentou toxicidade após um período de aproximadamente 48 h de tratamento, e mostrou ser um bom modelo para o estudo de sua toxicidade. Com relação ao mecanismo investigado, os dados sugerem que a proteína iNOS pode estar envolvida na toxicidade induzida pelo peptídeo Aβ1-42. Além disso, sugerem que o fragmento Aβ25-35 possa exercer sua toxicidade através da inibição da via de sobrevivência celular PI3-K, por diminuir a fosforilação/ativação da proteína Akt, parecendo envolver a proteína fosfatase PTEN, principal regulador negativo da via PI3-K/Akt.

O crescimento da expectativa de vida média da população mundial tem sido acompanhado do aumento na prevalência de doenças neurodegenerativas, como a doença de Parkinson, isquemia cerebral e, especialmente, a doença de Alzheimer. A doença de Alzheimer (DA) caracteriza-se por um crescente declínio na função mental e memória do paciente. Estes sintomas são explicados por uma profunda perda neuronal e pela presença de alterações estruturais no tecido cerebral: as placas senis, extracelulares e os emaranhados neurofibrilares, intracelulares. O passo que desencadeia a neurodegeneração na DA é ainda objeto de estudo, mas a hipótese mais aceita atualmente é a de que a secreção anormal do peptídeo β amilóide (Aβ), principal componente das placas senis, dê início ao processo. O presente trabalho teve como objetivos investigar a toxicidade induzida pelo peptídeo Aβ1-42 e seu fragmento, o peptídeo Aβ25-35 em culturas organotípicas de hipocampo de ratos. Na primeira parte do trabalho, investigamos a toxicidade induzida pela exposição de culturas organotípicas de hipocampo de ratos a 10 ou 20 μM do peptídeo Aβ1-42, por 24 ou 72 h. Além disso, investigamos o envolvimento das proteínas iNOS e GSK-3β no mecanismo de morte celular induzida pelo peptídeo Aβ1-42. Na segunda parte do trabalho, investigamos a toxicidade induzida pelo fragmento Aβ25-35 na concentração de 25 μM, nos tempos de 1, 3, 6, 12, 24 ou 48 h de exposição às culturas organotípicas, e seu efeito sobre as proteínas Akt, GSK-3β e PTEN. A morte celular foi quantificada pela incorporação do iodeto de propídeo, corante marcador excluído de células sadias, e as proteínas foram quantificadas por imunodetecção com o uso de anticorpos específicos. Nossos resultados mostraram que o peptídeo Aβ1-42 apresentou toxicidade nas concentrações de 10 e 20 μM, induzindo a uma considerável morte celular após 72 h de exposição. A análise do imunoconteúdo da proteína iNOS mostrou um aumento significativo em relação ao controle, após 72 h de exposição ao peptídeo e na concentração de 20 μM. Os resultados obtidos na segunda parte do trabalho mostraram uma morte celular significativa apenas após 48 h de exposição ao peptídeo Aβ25- 35 na concentração de 25 μM. O tratamento com peptídeo Aβ25-35 levou ao aumento no estado de fosforilação da proteína Akt após 6 h de exposição e também da proteína GSK-3β, um potencial substrato da Akt. Após 12 h de exposição ao peptídeo, observamos uma diminuição de ambas as proteínas (Akt e GSK-3β). Porém, após 24 h de exposição ao peptídeo, a proteína Akt continua menos fosforilada enquanto que a proteína GSK-3β apresenta um novo pico de fosforilação. O imunoconteúdo da proteína fosfatase PTEN apresentou um aumento significativo em 24 h e 48 h. Os resultados do presente estudo mostraram que o tratamento das culturas organotípicas de hipocampo de ratos com o peptídeo Aβ1-42 como com o fragmento Aβ25-35 apresentou toxicidade após um período de aproximadamente 48 h de tratamento, e mostrou ser um bom modelo para o estudo de sua toxicidade. Com relação ao mecanismo investigado, os dados sugerem que a proteína iNOS pode estar envolvida na toxicidade induzida pelo peptídeo Aβ1-42. Além disso, sugerem que o fragmento Aβ25-35 possa exercer sua toxicidade através da inibição da via de sobrevivência celular PI3-K, por diminuir a fosforilação/ativação da proteína Akt, parecendo envolver a proteína fosfatase PTEN, principal regulador negativo da via PI3-K/Akt.

O crescimento da expectativa de vida média da população mundial tem sido acompanhado do aumento na prevalência de doenças neurodegenerativas, como a doença de Parkinson, isquemia cerebral e, especialmente, a doença de Alzheimer. A doença de Alzheimer (DA) caracteriza-se por um crescente declínio na função mental e memória do paciente. Estes sintomas são explicados por uma profunda perda neuronal e pela presença de alterações estruturais no tecido cerebral: as placas senis, extracelulares e os emaranhados neurofibrilares, intracelulares. O passo que desencadeia a neurodegeneração na DA é ainda objeto de estudo, mas a hipótese mais aceita atualmente é a de que a secreção anormal do peptídeo β amilóide (Aβ), principal componente das placas senis, dê início ao processo. O presente trabalho teve como objetivos investigar a toxicidade induzida pelo peptídeo Aβ1-42 e seu fragmento, o peptídeo Aβ25-35 em culturas organotípicas de hipocampo de ratos. Na primeira parte do trabalho, investigamos a toxicidade induzida pela exposição de culturas organotípicas de hipocampo de ratos a 10 ou 20 μM do peptídeo Aβ1-42, por 24 ou 72 h. Além disso, investigamos o envolvimento das proteínas iNOS e GSK-3β no mecanismo de morte celular induzida pelo peptídeo Aβ1-42. Na segunda parte do trabalho, investigamos a toxicidade induzida pelo fragmento Aβ25-35 na concentração de 25 μM, nos tempos de 1, 3, 6, 12, 24 ou 48 h de exposição às culturas organotípicas, e seu efeito sobre as proteínas Akt, GSK-3β e PTEN. A morte celular foi quantificada pela incorporação do iodeto de propídeo, corante marcador excluído de células sadias, e as proteínas foram quantificadas por imunodetecção com o uso de anticorpos específicos. Nossos resultados mostraram que o peptídeo Aβ1-42 apresentou toxicidade nas concentrações de 10 e 20 μM, induzindo a uma considerável morte celular após 72 h de exposição. A análise do imunoconteúdo da proteína iNOS mostrou um aumento significativo em relação ao controle, após 72 h de exposição ao peptídeo e na concentração de 20 μM. Os resultados obtidos na segunda parte do trabalho mostraram uma morte celular significativa apenas após 48 h de exposição ao peptídeo Aβ25- 35 na concentração de 25 μM. O tratamento com peptídeo Aβ25-35 levou ao aumento no estado de fosforilação da proteína Akt após 6 h de exposição e também da proteína GSK-3β, um potencial substrato da Akt. Após 12 h de exposição ao peptídeo, observamos uma diminuição de ambas as proteínas (Akt e GSK-3β). Porém, após 24 h de exposição ao peptídeo, a proteína Akt continua menos fosforilada enquanto que a proteína GSK-3β apresenta um novo pico de fosforilação. O imunoconteúdo da proteína fosfatase PTEN apresentou um aumento significativo em 24 h e 48 h. Os resultados do presente estudo mostraram que o tratamento das culturas organotípicas de hipocampo de ratos com o peptídeo Aβ1-42 como com o fragmento Aβ25-35 apresentou toxicidade após um período de aproximadamente 48 h de tratamento, e mostrou ser um bom modelo para o estudo de sua toxicidade. Com relação ao mecanismo investigado, os dados sugerem que a proteína iNOS pode estar envolvida na toxicidade induzida pelo peptídeo Aβ1-42. Além disso, sugerem que o fragmento Aβ25-35 possa exercer sua toxicidade através da inibição da via de sobrevivência celular PI3-K, por diminuir a fosforilação/ativação da proteína Akt, parecendo envolver a proteína fosfatase PTEN, principal regulador negativo da via PI3-K/Akt.

A doença de Alzheimer é uma desordem neurodegenerativa cuja patogenia não é completamente elucidada. Atribui-se ao peptídeo beta-amilóide (A ), em sua forma oligomérica ou fibrilada, um importante papel neste processo. Uma vez que a produção e a fibrilação do peptídeo ocorrem ao nível de membrana neural, sua dinâmica e composição lipídica podem modular a cascata amilóide e/ou interferir na extensão do dano gerado pela mesma. Tendo isto em vista e considerando o potencial sinalizatório dos glicoesfingolipídios, o objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do peptídeo betaamilóide (A 25-35), em sua forma fibrilada ou não-fibrilada, sobre a biossíntese dos gangliosídios em modelo de cultura organotípica de hipocampo. Para tanto, foram utilizados ratos Wistar de 6-8 dias, dos quais o hipocampo foi dissecado, fatiado e submetido à cultura. No 28º dia de cultura foi adicionado A 25- 35 (25μM), em sua forma fibrilada ou não fibrilada; após 24h adicionou-se ao meio D- [1-14C]-galactose para avaliar a biossíntese dos gangliosídios; no 30º dia a morte celular foi analisada com iodeto de propídio. A partir das fatias, os gangliosídios radiomarcados foram extraídos, purificados, analisados por HPTLC, fluorografia e densitometria. Nossos resultados demonstraram uma alteração na biossíntese de gangliosídios induzida pelo peptídeo beta-amilóide A 25-35, um efeito que foi dependente de seu estado de fibrilação. Desta maneira, o A 25-35, em sua forma fibrilada, promoveu um aumento na biossíntese de GM3 e uma redução na biossíntese de GD1b, ao passo que o peptídeo não fibrilado levou a um aumento na síntese do gangliosídio GM1. Uma vez que o GM3 é considerado um gangliosídio apoptótico, quando expresso em neurônios adultos, um aumento em sua síntese pode estar relacionado aos eventos tóxicos desencadeados pelo peptídeo beta-amilóide fibrilado. O GM1, por sua vez, ainda não possui um papel suficientemente claro no desenvolvimento da doença de Alzheimer. Uma série de efeitos neuroprotetores são atribuídos a este gangliosídio enquanto fortes evidências sugerem que o GM1 poderia acelerar o processo de fibrilação do beta-amilóide, e assim influenciar a progressão da doença. A fim de investigar o papel do GM1 no presente modelo, realizamos uma série de experimentos com a finalidade de avaliar uma possível ação neuroprotetora deste gangliosídio. Como resultado, um pré-tratamento das fatias hipocampais com GM1(10μM) foi capaz de prevenir a toxicidade induzida pelo peptídeo beta-amilóide em sua forma fibrilada, como demonstram os resultados da captação de iodeto de propídio. Com o intuito de corroborar sua ação neuroprotetora, bem como investigar o mecanismo pelo qual esta neuroproteção seria mediada, analisamos o efeito de um tratamento com GM1 (1h, 6h, 12h ou 24h) sobre as alterações induzidas pelo peptídeo beta-amilóide no estado de fosforilação (ativação/inativação) da GSK3b. Nossos resultados demonstraram um importante efeito neuroprotetor do GM1 após 24 horas de tratamento, uma vez que nestas circunstâncias este gangliosídio foi capaz de reverter a ativação (defosforilação) da GSK3b, uma via de sinalização associada à morte celular programada. Como conclusão, nossos resultados dão suporte a participação dos gangliosídios em modelos de doença de Alzheimer, e sugerem uma ação neuroprotetora do gangliosídio GM1 frente à toxicidade induzida pelo beta-amilóide, o que, no futuro, pode ser explorado como uma alternativa terapêutica ao tratamento do Alzheimer. / Alzheimer disease (AD) is a neurodegenerative disorder whose pathogenesis is still poorly understood. It is attributed to beta-amyloid peptide, in its fibrillar or nonfibrillar forms, an important role in the disease development and progression. Once the production and fibrillation of beta-amyloid peptide occurs on the neural membrane surface, the lipid dynamic and composition of these membranes could modulate amyloid cascade and/or interfere in the damage triggered by it. Taking this into account, and considering the potential signalling role of glycosphingolipids, the objective of this study was to investigate the effect of fibrillar and non-fibrillar beta-amyloid peptide (Ab25-35) upon ganglioside biosynthesis in a model of organotypic hippocampal culture. In order to do this, we used 6-8 days old Wistar rats, whose hippocampi were dissected, sliced and subjected to culture. On the 28th in vitro day, A 25-35 (25μM) was added to the culture medium, in its fibrillar or non-fibrillar forms. After 24h incubation, D-[1-C14]-galactose was added to the medium with the purpose of labeling ganglioside; on day 30th in vitro day cell death was analyzed by PI uptake. The radiolabeled gangliosides were extracted from the hippocampal slices, purified, and analyzed by HPTLC, fluorography and densitometry. Our results demonstrated an Ab25-35 induced alteration in ganglioside biosynthesis, an effect which seemed to be dependent on the peptide fibrillation state. Furthermore, the fibrillar Ab25-35 caused an increase in GM3 and a reduction in GD1b biosynthesis, whereas the non-fibrillar form of this peptide was able to enhance the synthesis of GM1 ganglioside. Once GM3 is an apoptotic ganglioside, when expressed in adult neurons, an increase in its synthesis could take part of the toxic events triggered by the fibrillar betaamyloid peptide. GM1, in turn, has a still poorly understood participation in Alzheimer development. A sort of neuroprotective effects are attributed to this ganglioside while several evidences suggest that GM1 could accelerate the endogenous fibril formation, and thence influence the disease progression. To further investigate the role of GM1 ganglioside in our model, we have performed some experiments in order to test a possible neuroprotective effect of this gangliosides. As a result, a pre-treatment of the hippocampal slices with 10μM GM1 was able to prevent the toxicity triggered by the fibrillar beta-amyloid peptide, when measured by PI uptake protocol. In order to corroborate its neuroprotective action, as well as to investigate a candidate mechanism by which GM1 could promote neuroprotection, we have analyzed the effect of GM1 treatment (1h, 6h, 12h and 24h) upon the amyloid-induced alterations in GSK3b phosphorylation/dephosphorylation state. Our results demonstrated an important effect of GM1 after 24h incubation, once it was able to reverse the amyloid-induced dephosphorilation (activation) of GSK3b, a signalling pathway involved in apoptosis triggering. Taken together, our results provides new and important support for the ganglioside participation in Alzheimer models, and suggests a protective role of GM1 upon the amyloid induced toxicity, which, in the future, could expand the therapeutic strategy available for Alzheimer disease treatment.

A doença de Alzheimer é uma desordem neurodegenerativa cuja patogenia não é completamente elucidada. Atribui-se ao peptídeo beta-amilóide (A ), em sua forma oligomérica ou fibrilada, um importante papel neste processo. Uma vez que a produção e a fibrilação do peptídeo ocorrem ao nível de membrana neural, sua dinâmica e composição lipídica podem modular a cascata amilóide e/ou interferir na extensão do dano gerado pela mesma. Tendo isto em vista e considerando o potencial sinalizatório dos glicoesfingolipídios, o objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do peptídeo betaamilóide (A 25-35), em sua forma fibrilada ou não-fibrilada, sobre a biossíntese dos gangliosídios em modelo de cultura organotípica de hipocampo. Para tanto, foram utilizados ratos Wistar de 6-8 dias, dos quais o hipocampo foi dissecado, fatiado e submetido à cultura. No 28º dia de cultura foi adicionado A 25- 35 (25μM), em sua forma fibrilada ou não fibrilada; após 24h adicionou-se ao meio D- [1-14C]-galactose para avaliar a biossíntese dos gangliosídios; no 30º dia a morte celular foi analisada com iodeto de propídio. A partir das fatias, os gangliosídios radiomarcados foram extraídos, purificados, analisados por HPTLC, fluorografia e densitometria. Nossos resultados demonstraram uma alteração na biossíntese de gangliosídios induzida pelo peptídeo beta-amilóide A 25-35, um efeito que foi dependente de seu estado de fibrilação. Desta maneira, o A 25-35, em sua forma fibrilada, promoveu um aumento na biossíntese de GM3 e uma redução na biossíntese de GD1b, ao passo que o peptídeo não fibrilado levou a um aumento na síntese do gangliosídio GM1. Uma vez que o GM3 é considerado um gangliosídio apoptótico, quando expresso em neurônios adultos, um aumento em sua síntese pode estar relacionado aos eventos tóxicos desencadeados pelo peptídeo beta-amilóide fibrilado. O GM1, por sua vez, ainda não possui um papel suficientemente claro no desenvolvimento da doença de Alzheimer. Uma série de efeitos neuroprotetores são atribuídos a este gangliosídio enquanto fortes evidências sugerem que o GM1 poderia acelerar o processo de fibrilação do beta-amilóide, e assim influenciar a progressão da doença. A fim de investigar o papel do GM1 no presente modelo, realizamos uma série de experimentos com a finalidade de avaliar uma possível ação neuroprotetora deste gangliosídio. Como resultado, um pré-tratamento das fatias hipocampais com GM1(10μM) foi capaz de prevenir a toxicidade induzida pelo peptídeo beta-amilóide em sua forma fibrilada, como demonstram os resultados da captação de iodeto de propídio. Com o intuito de corroborar sua ação neuroprotetora, bem como investigar o mecanismo pelo qual esta neuroproteção seria mediada, analisamos o efeito de um tratamento com GM1 (1h, 6h, 12h ou 24h) sobre as alterações induzidas pelo peptídeo beta-amilóide no estado de fosforilação (ativação/inativação) da GSK3b. Nossos resultados demonstraram um importante efeito neuroprotetor do GM1 após 24 horas de tratamento, uma vez que nestas circunstâncias este gangliosídio foi capaz de reverter a ativação (defosforilação) da GSK3b, uma via de sinalização associada à morte celular programada. Como conclusão, nossos resultados dão suporte a participação dos gangliosídios em modelos de doença de Alzheimer, e sugerem uma ação neuroprotetora do gangliosídio GM1 frente à toxicidade induzida pelo beta-amilóide, o que, no futuro, pode ser explorado como uma alternativa terapêutica ao tratamento do Alzheimer. / Alzheimer disease (AD) is a neurodegenerative disorder whose pathogenesis is still poorly understood. It is attributed to beta-amyloid peptide, in its fibrillar or nonfibrillar forms, an important role in the disease development and progression. Once the production and fibrillation of beta-amyloid peptide occurs on the neural membrane surface, the lipid dynamic and composition of these membranes could modulate amyloid cascade and/or interfere in the damage triggered by it. Taking this into account, and considering the potential signalling role of glycosphingolipids, the objective of this study was to investigate the effect of fibrillar and non-fibrillar beta-amyloid peptide (Ab25-35) upon ganglioside biosynthesis in a model of organotypic hippocampal culture. In order to do this, we used 6-8 days old Wistar rats, whose hippocampi were dissected, sliced and subjected to culture. On the 28th in vitro day, A 25-35 (25μM) was added to the culture medium, in its fibrillar or non-fibrillar forms. After 24h incubation, D-[1-C14]-galactose was added to the medium with the purpose of labeling ganglioside; on day 30th in vitro day cell death was analyzed by PI uptake. The radiolabeled gangliosides were extracted from the hippocampal slices, purified, and analyzed by HPTLC, fluorography and densitometry. Our results demonstrated an Ab25-35 induced alteration in ganglioside biosynthesis, an effect which seemed to be dependent on the peptide fibrillation state. Furthermore, the fibrillar Ab25-35 caused an increase in GM3 and a reduction in GD1b biosynthesis, whereas the non-fibrillar form of this peptide was able to enhance the synthesis of GM1 ganglioside. Once GM3 is an apoptotic ganglioside, when expressed in adult neurons, an increase in its synthesis could take part of the toxic events triggered by the fibrillar betaamyloid peptide. GM1, in turn, has a still poorly understood participation in Alzheimer development. A sort of neuroprotective effects are attributed to this ganglioside while several evidences suggest that GM1 could accelerate the endogenous fibril formation, and thence influence the disease progression. To further investigate the role of GM1 ganglioside in our model, we have performed some experiments in order to test a possible neuroprotective effect of this gangliosides. As a result, a pre-treatment of the hippocampal slices with 10μM GM1 was able to prevent the toxicity triggered by the fibrillar beta-amyloid peptide, when measured by PI uptake protocol. In order to corroborate its neuroprotective action, as well as to investigate a candidate mechanism by which GM1 could promote neuroprotection, we have analyzed the effect of GM1 treatment (1h, 6h, 12h and 24h) upon the amyloid-induced alterations in GSK3b phosphorylation/dephosphorylation state. Our results demonstrated an important effect of GM1 after 24h incubation, once it was able to reverse the amyloid-induced dephosphorilation (activation) of GSK3b, a signalling pathway involved in apoptosis triggering. Taken together, our results provides new and important support for the ganglioside participation in Alzheimer models, and suggests a protective role of GM1 upon the amyloid induced toxicity, which, in the future, could expand the therapeutic strategy available for Alzheimer disease treatment.

A doença de Alzheimer (DA) é uma devastadora desordem neurológica que afeta mais de 37 milhões de pessoas ao redor do mundo, caracterizada pelo progressivo dano cognitivo e pela perda da memória. Estas alterações clínicas são acompanhadas por alterações histológicas cerebrais características da doença, as quais incluem atrofia cerebral, perda de neurônios e disfunção sináptica secundárias à deposição extracelular do peptídeo beta-amilóide (Aβ) e à deposição intracelular de emaranhados neurofibrilares constituídos da proteína tau. Fármacos disponíveis para a terapia da DA apresentam efeito limitado e tratamentos utilizando um único medicamento ou a combinação de terapias que possam efetivamente parar ou modificar o curso da doença ainda não se encontram disponíveis. O resveratrol, um polifenol de origem vegetal, tem atraído considerável interesse devido aos seus potenciais benefícios à saúde humana. Diversos estudos têm demonstrado que o resveratrol possui propriedades anti-amiloidogênicas; entretanto, os efeitos biológicos in vivo do resveratrol são fortemente limitados devido a sua baixa biodisponibilidade, a qual representa uma barreira no desenvolvimento de aplicações terapêuticas do resveratrol. Neste contexto, o objetivo deste estudo foi desenvolver uma nova formulação capaz de superar a baixa solubilidade, a limitada estabilidade, a elevada metabolização e a baixa biodisponibilidade do resveratrol e avaliar o seu efeito frente à toxicidade induzida pelo Aβ em modelos in vitro e in vivo. Inicialmente, o isômero trans do resveratrol foi incorporado em nanocápsulas poliméricas de núcleo lipídico (RSV-LNC) e a distribuição destas nanocápsulas nos tecidos cerebral, hepático e renal foi avaliada após a administração intraperitoneal (i.p.) ou por gavagem em ratos saudáveis. As nanocápsulas apresentaram elevada capacidade de encapsulamento do resveratrol e animais tratados com RSV-LNC exibiram maior concentração do resveratrol no cérebro, no fígado e no rim quando comparados aos animais tratados com resveratrol livre (RSV) após administrações diárias pelas vias i.p. ou gavagem. Na sequência, nós comparamos o efeito do tratamento com RSV e RSV-LNC frente à toxicidade induzida pelo Aβ através da exposição de culturas organotípicas de hipocampo ao Aβ1-42 por 48 h. Tanto o tratamento prévio quanto o simultâneo das culturas com RSV ou RSV-LNC reduziram significativamente a morte celular induzida pelo Aβ, com o RSV-LNC apresentando efeito mais pronunciado. O pré-tratamento com ambos, RSV ou RSV-LNC, preveniu a produção de espécies reativas de oxigênio; entretanto, o tratamento simultâneo com RSV não protegeu as culturas do dano oxidativo. Ambos os tratamentos, prévio e simultâneo, com RSV-LNC bloquearam a neuroinflamação desencadeada pelo Aβ de maneira sustentada. Além disso, apenas os tratamentos com RSV-LNC foram capazes de aumentar a liberação da IL-10 mesmo na presença do Aβ e prevenir/reduzir a ativação glial e a fosforilação da JNK. Finalmente, nós avaliamos o efeito do resveratrol frente à toxicidade induzida pelo Aβ através da injeção intracerebroventricular do Aβ1-42 em ratos. Nós observamos que os animais que foram injetados com o Aβ1-42 exibiram um significativo défcit na memória, o qual foi acompanhado pela significativa redução nos níveis da sinaptofisina no hipocampo. É importante ressaltar que através do uso das nanocápsulas o resveratrol foi capaz de reduzir estes efeitos deletérios do Aβ1-42 enquanto o tratamento com RSV não foi capaz de proteger da toxicidade induzida pelo Aβ, o que pode ser explicado pelo robusto aumento na biodisponibilidade cerebral do resveratrol atingida pelo uso das nanocápsulas. Adicionalmente, a ativação astrocitária e microglial, bem como fosforilação da JNK desencadeada pelo Aβ foram reduzidas somente após o tratamento com RSV-LNC, enquanto ambos os tratamentos com RSV e RSV-LNC foram capazes de reestabelecer os distúrbios na sinalização mediada pela GSK-3β e a desestabilização da β-catenina desencadeadas pelo Aβ. Juntos, nossos resultados não somente confirmam o potencial do resveratrol no tratamento dos processos neurodegenerativos como também oferecem uma via efetiva para melhorar o efeito neuroprotetor do resveratrol através de um sistema nanocarreador. Estes resultados fornecem suporte para futuros estudos objetivando o entendimento dos mecanismos envolvidos no efeito neuroprotetor do resveratrol. Além disso, a combinação do resveratrol com o sistema de entrega mediado por nanocápsulas poliméricas de núcleo lipídico abrem novas possibilidades para o tratamento da doença de Alzheimer. / Alzheimer's disease (AD) is a devastating neurological disorder that affects more than 37 million people worldwide, characterized clinically by progressive impairments in cognition and memory. These clinical features are accompanied by characteristic histological changes in the brain, which include brain atrophy, loss of neurons and loss of synaptic function secondary to extracellular deposition of amyloid-beta peptide (Aβ) and intracellular deposition of neurofibrillary tangle composed of the microtubule-associated protein tau. Available drugs for AD therapy have small effect sizes and we still not have a single treatment or combination therapy that can effectively stop or reverse the relentless progression of AD. Resveratrol, a naturally occurring polyphenol, has attracted considerable interest for its beneficial potentials for human health. Several studies have been shown that resveratrol is associated with anti-amyloidogenic properties; however, the in vivo biological effects of resveratrol appear strongly limited by its low bioavailability, which is a barrier to the development of therapeutic applications. In this context, the present study was designed to develop a novel resveratrol formulation to overcome its poor solubility, limited stability, high metabolization and weak bioavailability, and to evaluate the effects of resveratrol against in vitro and in vivo Aβ-induced toxicity. Initially, trans-resveratrol was loaded into lipid-core nanocapsules (RSV-LNC) and the nanocapsule distribution in brain, liver and kidney tissues was evaluated by intraperitoneal (i.p.) and gavage routes in healthy rats. Lipid-core nanocapsules showed high entrapment of resveratrol and animals treated with RSV-LNC displayed a higher resveratrol concentration in the brain, the liver and the kidney than those treated with free resveratrol (RSV) after daily i.p. or gavage administration. Next, we compared the effects of RSV and RSV-LNC treatment against Aβ-induced toxicity by expositing organotypic hippocampal cultures to Aβ1-42 by 48 h. Pre- and co-treatment of cultures with both, RSV and RSV-LNC, significantly attenuated Aβ-induced cell death, with RSV-LNC showing somewhat higher potency. Reactive oxygen species formation was prevented by pretreatment with both RSV or RSV-LNC; however, co-treatment with RSV failed to protect cultures from oxidative damage. Pre- and co-treatment with RSV-LNC was able to block the neuroinflammation triggered by Aβ in a sustained pattern. Furthermore, only RSV-LNC treatments were able to increase IL-10 release even in the presence of Aβ, and prevent/decrease glial activation and JNK phosphorylation. Finally, we evaluated the effects of resveratrol against Aβ-induced toxicity by using an intracerebroventricular injection of Aβ1-42 model in rats. We found that Aβ1-42-injected animals showed a significant impairment on learning-memory ability, which was paralleled by a significant decrease in hippocampal synaptophysin levels. Noteworthy, by using lipid-core nanocapsules, resveratrol was able to rescue these deleterious effects of Aβ1-42 while treatment with RSV failed to protect against Aβ-induced toxicity, which can be explained by robust increase of brain bioavailability of resveratrol achieved by lipid-core nanocapsules. Additionally, activated astrocytes and microglial cells, as well as JNK phosphorylation triggered by Aβ was reduced only after RSV-LNC treatment, while both RSV and RSV-LNC treatments were able to restore the disturbance in GSK-3β signaling and destabilization of β-catenin triggered by Aβ. Taken together, our results not only confirm the potential of resveratrol in treating neurodegenerative processes but also offer an effective way to improve the neuroprotective efficiency of resveratrol by nanocarrier delivery system. These findings provide further support for future studies aiming at precisely understanding of mechanisms involved in the neuroprotective effects of resveratrol. Furthermore, the combination of resveratrol and lipidcore nanocapsules-based delivery system may open new avenues for the treatment of Alzheimer’s disease.

A doença de Alzheimer é uma desordem neurodegenerativa cuja patogenia não é completamente elucidada. Atribui-se ao peptídeo beta-amilóide (A ), em sua forma oligomérica ou fibrilada, um importante papel neste processo. Uma vez que a produção e a fibrilação do peptídeo ocorrem ao nível de membrana neural, sua dinâmica e composição lipídica podem modular a cascata amilóide e/ou interferir na extensão do dano gerado pela mesma. Tendo isto em vista e considerando o potencial sinalizatório dos glicoesfingolipídios, o objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do peptídeo betaamilóide (A 25-35), em sua forma fibrilada ou não-fibrilada, sobre a biossíntese dos gangliosídios em modelo de cultura organotípica de hipocampo. Para tanto, foram utilizados ratos Wistar de 6-8 dias, dos quais o hipocampo foi dissecado, fatiado e submetido à cultura. No 28º dia de cultura foi adicionado A 25- 35 (25μM), em sua forma fibrilada ou não fibrilada; após 24h adicionou-se ao meio D- [1-14C]-galactose para avaliar a biossíntese dos gangliosídios; no 30º dia a morte celular foi analisada com iodeto de propídio. A partir das fatias, os gangliosídios radiomarcados foram extraídos, purificados, analisados por HPTLC, fluorografia e densitometria. Nossos resultados demonstraram uma alteração na biossíntese de gangliosídios induzida pelo peptídeo beta-amilóide A 25-35, um efeito que foi dependente de seu estado de fibrilação. Desta maneira, o A 25-35, em sua forma fibrilada, promoveu um aumento na biossíntese de GM3 e uma redução na biossíntese de GD1b, ao passo que o peptídeo não fibrilado levou a um aumento na síntese do gangliosídio GM1. Uma vez que o GM3 é considerado um gangliosídio apoptótico, quando expresso em neurônios adultos, um aumento em sua síntese pode estar relacionado aos eventos tóxicos desencadeados pelo peptídeo beta-amilóide fibrilado. O GM1, por sua vez, ainda não possui um papel suficientemente claro no desenvolvimento da doença de Alzheimer. Uma série de efeitos neuroprotetores são atribuídos a este gangliosídio enquanto fortes evidências sugerem que o GM1 poderia acelerar o processo de fibrilação do beta-amilóide, e assim influenciar a progressão da doença. A fim de investigar o papel do GM1 no presente modelo, realizamos uma série de experimentos com a finalidade de avaliar uma possível ação neuroprotetora deste gangliosídio. Como resultado, um pré-tratamento das fatias hipocampais com GM1(10μM) foi capaz de prevenir a toxicidade induzida pelo peptídeo beta-amilóide em sua forma fibrilada, como demonstram os resultados da captação de iodeto de propídio. Com o intuito de corroborar sua ação neuroprotetora, bem como investigar o mecanismo pelo qual esta neuroproteção seria mediada, analisamos o efeito de um tratamento com GM1 (1h, 6h, 12h ou 24h) sobre as alterações induzidas pelo peptídeo beta-amilóide no estado de fosforilação (ativação/inativação) da GSK3b. Nossos resultados demonstraram um importante efeito neuroprotetor do GM1 após 24 horas de tratamento, uma vez que nestas circunstâncias este gangliosídio foi capaz de reverter a ativação (defosforilação) da GSK3b, uma via de sinalização associada à morte celular programada. Como conclusão, nossos resultados dão suporte a participação dos gangliosídios em modelos de doença de Alzheimer, e sugerem uma ação neuroprotetora do gangliosídio GM1 frente à toxicidade induzida pelo beta-amilóide, o que, no futuro, pode ser explorado como uma alternativa terapêutica ao tratamento do Alzheimer. / Alzheimer disease (AD) is a neurodegenerative disorder whose pathogenesis is still poorly understood. It is attributed to beta-amyloid peptide, in its fibrillar or nonfibrillar forms, an important role in the disease development and progression. Once the production and fibrillation of beta-amyloid peptide occurs on the neural membrane surface, the lipid dynamic and composition of these membranes could modulate amyloid cascade and/or interfere in the damage triggered by it. Taking this into account, and considering the potential signalling role of glycosphingolipids, the objective of this study was to investigate the effect of fibrillar and non-fibrillar beta-amyloid peptide (Ab25-35) upon ganglioside biosynthesis in a model of organotypic hippocampal culture. In order to do this, we used 6-8 days old Wistar rats, whose hippocampi were dissected, sliced and subjected to culture. On the 28th in vitro day, A 25-35 (25μM) was added to the culture medium, in its fibrillar or non-fibrillar forms. After 24h incubation, D-[1-C14]-galactose was added to the medium with the purpose of labeling ganglioside; on day 30th in vitro day cell death was analyzed by PI uptake. The radiolabeled gangliosides were extracted from the hippocampal slices, purified, and analyzed by HPTLC, fluorography and densitometry. Our results demonstrated an Ab25-35 induced alteration in ganglioside biosynthesis, an effect which seemed to be dependent on the peptide fibrillation state. Furthermore, the fibrillar Ab25-35 caused an increase in GM3 and a reduction in GD1b biosynthesis, whereas the non-fibrillar form of this peptide was able to enhance the synthesis of GM1 ganglioside. Once GM3 is an apoptotic ganglioside, when expressed in adult neurons, an increase in its synthesis could take part of the toxic events triggered by the fibrillar betaamyloid peptide. GM1, in turn, has a still poorly understood participation in Alzheimer development. A sort of neuroprotective effects are attributed to this ganglioside while several evidences suggest that GM1 could accelerate the endogenous fibril formation, and thence influence the disease progression. To further investigate the role of GM1 ganglioside in our model, we have performed some experiments in order to test a possible neuroprotective effect of this gangliosides. As a result, a pre-treatment of the hippocampal slices with 10μM GM1 was able to prevent the toxicity triggered by the fibrillar beta-amyloid peptide, when measured by PI uptake protocol. In order to corroborate its neuroprotective action, as well as to investigate a candidate mechanism by which GM1 could promote neuroprotection, we have analyzed the effect of GM1 treatment (1h, 6h, 12h and 24h) upon the amyloid-induced alterations in GSK3b phosphorylation/dephosphorylation state. Our results demonstrated an important effect of GM1 after 24h incubation, once it was able to reverse the amyloid-induced dephosphorilation (activation) of GSK3b, a signalling pathway involved in apoptosis triggering. Taken together, our results provides new and important support for the ganglioside participation in Alzheimer models, and suggests a protective role of GM1 upon the amyloid induced toxicity, which, in the future, could expand the therapeutic strategy available for Alzheimer disease treatment.

A doença de Alzheimer (DA) é uma devastadora desordem neurológica que afeta mais de 37 milhões de pessoas ao redor do mundo, caracterizada pelo progressivo dano cognitivo e pela perda da memória. Estas alterações clínicas são acompanhadas por alterações histológicas cerebrais características da doença, as quais incluem atrofia cerebral, perda de neurônios e disfunção sináptica secundárias à deposição extracelular do peptídeo beta-amilóide (Aβ) e à deposição intracelular de emaranhados neurofibrilares constituídos da proteína tau. Fármacos disponíveis para a terapia da DA apresentam efeito limitado e tratamentos utilizando um único medicamento ou a combinação de terapias que possam efetivamente parar ou modificar o curso da doença ainda não se encontram disponíveis. O resveratrol, um polifenol de origem vegetal, tem atraído considerável interesse devido aos seus potenciais benefícios à saúde humana. Diversos estudos têm demonstrado que o resveratrol possui propriedades anti-amiloidogênicas; entretanto, os efeitos biológicos in vivo do resveratrol são fortemente limitados devido a sua baixa biodisponibilidade, a qual representa uma barreira no desenvolvimento de aplicações terapêuticas do resveratrol. Neste contexto, o objetivo deste estudo foi desenvolver uma nova formulação capaz de superar a baixa solubilidade, a limitada estabilidade, a elevada metabolização e a baixa biodisponibilidade do resveratrol e avaliar o seu efeito frente à toxicidade induzida pelo Aβ em modelos in vitro e in vivo. Inicialmente, o isômero trans do resveratrol foi incorporado em nanocápsulas poliméricas de núcleo lipídico (RSV-LNC) e a distribuição destas nanocápsulas nos tecidos cerebral, hepático e renal foi avaliada após a administração intraperitoneal (i.p.) ou por gavagem em ratos saudáveis. As nanocápsulas apresentaram elevada capacidade de encapsulamento do resveratrol e animais tratados com RSV-LNC exibiram maior concentração do resveratrol no cérebro, no fígado e no rim quando comparados aos animais tratados com resveratrol livre (RSV) após administrações diárias pelas vias i.p. ou gavagem. Na sequência, nós comparamos o efeito do tratamento com RSV e RSV-LNC frente à toxicidade induzida pelo Aβ através da exposição de culturas organotípicas de hipocampo ao Aβ1-42 por 48 h. Tanto o tratamento prévio quanto o simultâneo das culturas com RSV ou RSV-LNC reduziram significativamente a morte celular induzida pelo Aβ, com o RSV-LNC apresentando efeito mais pronunciado. O pré-tratamento com ambos, RSV ou RSV-LNC, preveniu a produção de espécies reativas de oxigênio; entretanto, o tratamento simultâneo com RSV não protegeu as culturas do dano oxidativo. Ambos os tratamentos, prévio e simultâneo, com RSV-LNC bloquearam a neuroinflamação desencadeada pelo Aβ de maneira sustentada. Além disso, apenas os tratamentos com RSV-LNC foram capazes de aumentar a liberação da IL-10 mesmo na presença do Aβ e prevenir/reduzir a ativação glial e a fosforilação da JNK. Finalmente, nós avaliamos o efeito do resveratrol frente à toxicidade induzida pelo Aβ através da injeção intracerebroventricular do Aβ1-42 em ratos. Nós observamos que os animais que foram injetados com o Aβ1-42 exibiram um significativo défcit na memória, o qual foi acompanhado pela significativa redução nos níveis da sinaptofisina no hipocampo. É importante ressaltar que através do uso das nanocápsulas o resveratrol foi capaz de reduzir estes efeitos deletérios do Aβ1-42 enquanto o tratamento com RSV não foi capaz de proteger da toxicidade induzida pelo Aβ, o que pode ser explicado pelo robusto aumento na biodisponibilidade cerebral do resveratrol atingida pelo uso das nanocápsulas. Adicionalmente, a ativação astrocitária e microglial, bem como fosforilação da JNK desencadeada pelo Aβ foram reduzidas somente após o tratamento com RSV-LNC, enquanto ambos os tratamentos com RSV e RSV-LNC foram capazes de reestabelecer os distúrbios na sinalização mediada pela GSK-3β e a desestabilização da β-catenina desencadeadas pelo Aβ. Juntos, nossos resultados não somente confirmam o potencial do resveratrol no tratamento dos processos neurodegenerativos como também oferecem uma via efetiva para melhorar o efeito neuroprotetor do resveratrol através de um sistema nanocarreador. Estes resultados fornecem suporte para futuros estudos objetivando o entendimento dos mecanismos envolvidos no efeito neuroprotetor do resveratrol. Além disso, a combinação do resveratrol com o sistema de entrega mediado por nanocápsulas poliméricas de núcleo lipídico abrem novas possibilidades para o tratamento da doença de Alzheimer. / Alzheimer's disease (AD) is a devastating neurological disorder that affects more than 37 million people worldwide, characterized clinically by progressive impairments in cognition and memory. These clinical features are accompanied by characteristic histological changes in the brain, which include brain atrophy, loss of neurons and loss of synaptic function secondary to extracellular deposition of amyloid-beta peptide (Aβ) and intracellular deposition of neurofibrillary tangle composed of the microtubule-associated protein tau. Available drugs for AD therapy have small effect sizes and we still not have a single treatment or combination therapy that can effectively stop or reverse the relentless progression of AD. Resveratrol, a naturally occurring polyphenol, has attracted considerable interest for its beneficial potentials for human health. Several studies have been shown that resveratrol is associated with anti-amyloidogenic properties; however, the in vivo biological effects of resveratrol appear strongly limited by its low bioavailability, which is a barrier to the development of therapeutic applications. In this context, the present study was designed to develop a novel resveratrol formulation to overcome its poor solubility, limited stability, high metabolization and weak bioavailability, and to evaluate the effects of resveratrol against in vitro and in vivo Aβ-induced toxicity. Initially, trans-resveratrol was loaded into lipid-core nanocapsules (RSV-LNC) and the nanocapsule distribution in brain, liver and kidney tissues was evaluated by intraperitoneal (i.p.) and gavage routes in healthy rats. Lipid-core nanocapsules showed high entrapment of resveratrol and animals treated with RSV-LNC displayed a higher resveratrol concentration in the brain, the liver and the kidney than those treated with free resveratrol (RSV) after daily i.p. or gavage administration. Next, we compared the effects of RSV and RSV-LNC treatment against Aβ-induced toxicity by expositing organotypic hippocampal cultures to Aβ1-42 by 48 h. Pre- and co-treatment of cultures with both, RSV and RSV-LNC, significantly attenuated Aβ-induced cell death, with RSV-LNC showing somewhat higher potency. Reactive oxygen species formation was prevented by pretreatment with both RSV or RSV-LNC; however, co-treatment with RSV failed to protect cultures from oxidative damage. Pre- and co-treatment with RSV-LNC was able to block the neuroinflammation triggered by Aβ in a sustained pattern. Furthermore, only RSV-LNC treatments were able to increase IL-10 release even in the presence of Aβ, and prevent/decrease glial activation and JNK phosphorylation. Finally, we evaluated the effects of resveratrol against Aβ-induced toxicity by using an intracerebroventricular injection of Aβ1-42 model in rats. We found that Aβ1-42-injected animals showed a significant impairment on learning-memory ability, which was paralleled by a significant decrease in hippocampal synaptophysin levels. Noteworthy, by using lipid-core nanocapsules, resveratrol was able to rescue these deleterious effects of Aβ1-42 while treatment with RSV failed to protect against Aβ-induced toxicity, which can be explained by robust increase of brain bioavailability of resveratrol achieved by lipid-core nanocapsules. Additionally, activated astrocytes and microglial cells, as well as JNK phosphorylation triggered by Aβ was reduced only after RSV-LNC treatment, while both RSV and RSV-LNC treatments were able to restore the disturbance in GSK-3β signaling and destabilization of β-catenin triggered by Aβ. Taken together, our results not only confirm the potential of resveratrol in treating neurodegenerative processes but also offer an effective way to improve the neuroprotective efficiency of resveratrol by nanocarrier delivery system. These findings provide further support for future studies aiming at precisely understanding of mechanisms involved in the neuroprotective effects of resveratrol. Furthermore, the combination of resveratrol and lipidcore nanocapsules-based delivery system may open new avenues for the treatment of Alzheimer’s disease.

A doença de Alzheimer (DA) é uma devastadora desordem neurológica que afeta mais de 37 milhões de pessoas ao redor do mundo, caracterizada pelo progressivo dano cognitivo e pela perda da memória. Estas alterações clínicas são acompanhadas por alterações histológicas cerebrais características da doença, as quais incluem atrofia cerebral, perda de neurônios e disfunção sináptica secundárias à deposição extracelular do peptídeo beta-amilóide (Aβ) e à deposição intracelular de emaranhados neurofibrilares constituídos da proteína tau. Fármacos disponíveis para a terapia da DA apresentam efeito limitado e tratamentos utilizando um único medicamento ou a combinação de terapias que possam efetivamente parar ou modificar o curso da doença ainda não se encontram disponíveis. O resveratrol, um polifenol de origem vegetal, tem atraído considerável interesse devido aos seus potenciais benefícios à saúde humana. Diversos estudos têm demonstrado que o resveratrol possui propriedades anti-amiloidogênicas; entretanto, os efeitos biológicos in vivo do resveratrol são fortemente limitados devido a sua baixa biodisponibilidade, a qual representa uma barreira no desenvolvimento de aplicações terapêuticas do resveratrol. Neste contexto, o objetivo deste estudo foi desenvolver uma nova formulação capaz de superar a baixa solubilidade, a limitada estabilidade, a elevada metabolização e a baixa biodisponibilidade do resveratrol e avaliar o seu efeito frente à toxicidade induzida pelo Aβ em modelos in vitro e in vivo. Inicialmente, o isômero trans do resveratrol foi incorporado em nanocápsulas poliméricas de núcleo lipídico (RSV-LNC) e a distribuição destas nanocápsulas nos tecidos cerebral, hepático e renal foi avaliada após a administração intraperitoneal (i.p.) ou por gavagem em ratos saudáveis. As nanocápsulas apresentaram elevada capacidade de encapsulamento do resveratrol e animais tratados com RSV-LNC exibiram maior concentração do resveratrol no cérebro, no fígado e no rim quando comparados aos animais tratados com resveratrol livre (RSV) após administrações diárias pelas vias i.p. ou gavagem. Na sequência, nós comparamos o efeito do tratamento com RSV e RSV-LNC frente à toxicidade induzida pelo Aβ através da exposição de culturas organotípicas de hipocampo ao Aβ1-42 por 48 h. Tanto o tratamento prévio quanto o simultâneo das culturas com RSV ou RSV-LNC reduziram significativamente a morte celular induzida pelo Aβ, com o RSV-LNC apresentando efeito mais pronunciado. O pré-tratamento com ambos, RSV ou RSV-LNC, preveniu a produção de espécies reativas de oxigênio; entretanto, o tratamento simultâneo com RSV não protegeu as culturas do dano oxidativo. Ambos os tratamentos, prévio e simultâneo, com RSV-LNC bloquearam a neuroinflamação desencadeada pelo Aβ de maneira sustentada. Além disso, apenas os tratamentos com RSV-LNC foram capazes de aumentar a liberação da IL-10 mesmo na presença do Aβ e prevenir/reduzir a ativação glial e a fosforilação da JNK. Finalmente, nós avaliamos o efeito do resveratrol frente à toxicidade induzida pelo Aβ através da injeção intracerebroventricular do Aβ1-42 em ratos. Nós observamos que os animais que foram injetados com o Aβ1-42 exibiram um significativo défcit na memória, o qual foi acompanhado pela significativa redução nos níveis da sinaptofisina no hipocampo. É importante ressaltar que através do uso das nanocápsulas o resveratrol foi capaz de reduzir estes efeitos deletérios do Aβ1-42 enquanto o tratamento com RSV não foi capaz de proteger da toxicidade induzida pelo Aβ, o que pode ser explicado pelo robusto aumento na biodisponibilidade cerebral do resveratrol atingida pelo uso das nanocápsulas. Adicionalmente, a ativação astrocitária e microglial, bem como fosforilação da JNK desencadeada pelo Aβ foram reduzidas somente após o tratamento com RSV-LNC, enquanto ambos os tratamentos com RSV e RSV-LNC foram capazes de reestabelecer os distúrbios na sinalização mediada pela GSK-3β e a desestabilização da β-catenina desencadeadas pelo Aβ. Juntos, nossos resultados não somente confirmam o potencial do resveratrol no tratamento dos processos neurodegenerativos como também oferecem uma via efetiva para melhorar o efeito neuroprotetor do resveratrol através de um sistema nanocarreador. Estes resultados fornecem suporte para futuros estudos objetivando o entendimento dos mecanismos envolvidos no efeito neuroprotetor do resveratrol. Além disso, a combinação do resveratrol com o sistema de entrega mediado por nanocápsulas poliméricas de núcleo lipídico abrem novas possibilidades para o tratamento da doença de Alzheimer. / Alzheimer's disease (AD) is a devastating neurological disorder that affects more than 37 million people worldwide, characterized clinically by progressive impairments in cognition and memory. These clinical features are accompanied by characteristic histological changes in the brain, which include brain atrophy, loss of neurons and loss of synaptic function secondary to extracellular deposition of amyloid-beta peptide (Aβ) and intracellular deposition of neurofibrillary tangle composed of the microtubule-associated protein tau. Available drugs for AD therapy have small effect sizes and we still not have a single treatment or combination therapy that can effectively stop or reverse the relentless progression of AD. Resveratrol, a naturally occurring polyphenol, has attracted considerable interest for its beneficial potentials for human health. Several studies have been shown that resveratrol is associated with anti-amyloidogenic properties; however, the in vivo biological effects of resveratrol appear strongly limited by its low bioavailability, which is a barrier to the development of therapeutic applications. In this context, the present study was designed to develop a novel resveratrol formulation to overcome its poor solubility, limited stability, high metabolization and weak bioavailability, and to evaluate the effects of resveratrol against in vitro and in vivo Aβ-induced toxicity. Initially, trans-resveratrol was loaded into lipid-core nanocapsules (RSV-LNC) and the nanocapsule distribution in brain, liver and kidney tissues was evaluated by intraperitoneal (i.p.) and gavage routes in healthy rats. Lipid-core nanocapsules showed high entrapment of resveratrol and animals treated with RSV-LNC displayed a higher resveratrol concentration in the brain, the liver and the kidney than those treated with free resveratrol (RSV) after daily i.p. or gavage administration. Next, we compared the effects of RSV and RSV-LNC treatment against Aβ-induced toxicity by expositing organotypic hippocampal cultures to Aβ1-42 by 48 h. Pre- and co-treatment of cultures with both, RSV and RSV-LNC, significantly attenuated Aβ-induced cell death, with RSV-LNC showing somewhat higher potency. Reactive oxygen species formation was prevented by pretreatment with both RSV or RSV-LNC; however, co-treatment with RSV failed to protect cultures from oxidative damage. Pre- and co-treatment with RSV-LNC was able to block the neuroinflammation triggered by Aβ in a sustained pattern. Furthermore, only RSV-LNC treatments were able to increase IL-10 release even in the presence of Aβ, and prevent/decrease glial activation and JNK phosphorylation. Finally, we evaluated the effects of resveratrol against Aβ-induced toxicity by using an intracerebroventricular injection of Aβ1-42 model in rats. We found that Aβ1-42-injected animals showed a significant impairment on learning-memory ability, which was paralleled by a significant decrease in hippocampal synaptophysin levels. Noteworthy, by using lipid-core nanocapsules, resveratrol was able to rescue these deleterious effects of Aβ1-42 while treatment with RSV failed to protect against Aβ-induced toxicity, which can be explained by robust increase of brain bioavailability of resveratrol achieved by lipid-core nanocapsules. Additionally, activated astrocytes and microglial cells, as well as JNK phosphorylation triggered by Aβ was reduced only after RSV-LNC treatment, while both RSV and RSV-LNC treatments were able to restore the disturbance in GSK-3β signaling and destabilization of β-catenin triggered by Aβ. Taken together, our results not only confirm the potential of resveratrol in treating neurodegenerative processes but also offer an effective way to improve the neuroprotective efficiency of resveratrol by nanocarrier delivery system. These findings provide further support for future studies aiming at precisely understanding of mechanisms involved in the neuroprotective effects of resveratrol. Furthermore, the combination of resveratrol and lipidcore nanocapsules-based delivery system may open new avenues for the treatment of Alzheimer’s disease.

O aumento da longevidade da população mundial tem como conseqüência uma maior prevalência de doenças neurodegenerativas. A Doença de Alzheimer (DA) é a desordem neurodegenerativa mais prevalente e a principal causa de demência após os 60 anos. A DA caracteriza-se por um crescente declínio na função mental e memória do paciente. Esses sintomas são explicados por uma marcante perda neuronal e pela presença de alterações estruturais no tecido cerebral: os emaranhados neurofibrilares (NFTs) intracelulares constituídos pela proteína tau hiperfosforilada e as placas senis extracelulares constituídas pela proteína beta-amilóide (Aß). Estudos recentes têm evidenciado que um processo inflamatório crônico, desencadeado pelo acúmulo de Aß, possui um papel central no processo neurodegenerativo da DA. Alguns dos componentes característicos da neuroinflamação na DA são astrogliose, microgliose e elevação dos níveis de citocinas. Estratégias terapêuticas para o tratamento de doenças do SNC têm sido amplamente pesquisadas. Dentre essas moléculas a melatonina tem demonstrado potencial atividade neuroprotetora, porém os mecanismos celulares e moleculares para esta atividade permanecem pouco conhecidos. Diante disso, o presente trabalho teve como objetivo investigar o efeito neuroprotetor da melatonina em modelo in vitro de toxicidade do Aß25-35. Para esse propósito foram utilizadas culturas de hipocampo de rato tratadas cronicamente com melatonina, nas concentrações de 25µM, 50µM ou 100µM, e expostas a 25µM do peptídeo Aß por 6h, 12h, 24h ou 48h.A morte celular foi quantificada pela medida da incorporação de iodeto de propídeo (IP), um marcador de morte celular. Os resultados do presente estudo mostraram que o tratamento com melatonina nas concentrações de 50µM e 100µM preveniu a morte celular induzida pela exposição das culturas organotípicas de hipocampo de rato ao peptídeo Aß por 48h. A melatonina em todas as concentrações usadas nesse trabalho preveniu a hiperfosforilação da proteína tau induzida pela exposição por 48h ao peptídeo Aß. A ativação da GSK-3ß observada após 12h de exposição ao Aß25- 35 foi prevenida pelo pré-tratamento com 100µM de melatonina. Uma significante ativação glial foi observada após 48h de exposição das culturas organotípicas ao Aß, evidenciado através do aumento do imunoconteúdo da GFAP e da reatividade da Isolectina B4, enquanto que o tratamento com melatonina 100µM foi capaz de prevenir a ativação de astrócitos e microglia. Os níveis de TNF-a mostraram-se aumentados após 24h e 48h de exposição ao Aß e foi observada redução significativa desses nas culturas pré-tratadas com melatonina 100µM. Os níveis de IL-6 aumentaram apenas após 48h de exposição ao Aß25-35, sendo esse efeito prevenido pela melatonina na concentração de 100µM. O tratamento das culturas com melatonina por 14 dias antes da exposição ao peptídeo Aß25-35 apresentou efeito neuroprotetor no modelo in vitro de toxicidade ao peptídeo beta-amilóide. Embora mais estudos sejam necessários para compreensão do mecanismo neuroprotetor da melatonina nessa patogênese, os resultados desse trabalho sugerem que a melatonina possa exercer sua neuroproteção através da inibição da hiperfosforilação da proteína tau, diminuição da atividade da GSK-3ß, prevenção da ativação de astrócitos e da microglia e inibição da liberação dos mediadores pró-inflamatórios TNF-a e IL-6. / The increase of the average life expectancy of the world-wide population has been followed by increase in the prevalence of neurodegenerative diseases. Alzheimer's disease (AD) is the most prevalent age-related neurodegenerative disorder affecting people 60 years and older. The AD is characterized for an increasing decline in the mental function and memory of the patient. These symptoms are explained by a marked neuronal loss and the presence of structural alterations in the cerebral tissue: the intracellular neurofibrilary tangles (NFTs) of the hyperphosphorylated protein tau and extracellular amyloid-beta (Aß) into senile plaques. Recent evidence suggests that a chronic inflammatory process, triggered by Aß deposition, plays an important role in the pathogenesis of AD. Neuroinflammation associated with AD is characterized by astrogliosis, microgliosis and citokyne elevation. Therapeutic strategies for the treatment of CNS diseases have been widely researched. Substantial evidence indicates that melatonin has neuroprotective effects; however, the cellular and molecular mechanisms remain poorly informed. Therefore, the present work was designed to investigate the neuroprotective effects in an in vitro model of toxicity by Aß25-35. For this purpose, organotypic slice cultures of rat hippocampus were treated chronically with melatonin, 25µM, 50µM or 100µM, and then exposed to 25µM of Aß25-35 for 6h, 12h, 24h or 48h. Cell death was quantified by measuring propidium iodide (PI) uptake, a marker of necrotic dead cell. The results of the present study had shown that the pretreatment with melatonin, at concentrations of 50µM and 100µM, prevented cell damage in hippocampus induced by the exposure to 25µM of Aß25-35 for 48h. The treatment with melatonin in all the concentrations prevented the hyperphosphorylation of protein tau induced by 25µM of Aß25- 35 peptide. Melatonin also prevents GSK-3ß activation after 12h of Aß exposition. A marked glial activation was showed after exposure of hippocampal cultures to Aß25-35 for 48h, as evidenced by GFAP and Isolectin B4 increase in reactivity, and the treatment with 100µM of melatonin prevented the activation of astrocytes and microglia.The exposure to 25µM of Aß25-35 for 24h and 48h increased the TNF-α concentration in the medium and the pretreatment with 100µM of melatonin significantly reduced the levels of this cytokine after 48h of exposure to peptide. In addition, IL-6 levels increased only after 48h of exposition to Aß25-35 and the pretreatment with 100µM of melatonin also prevented this increase. The treatment of cultures with melatonin for 14 days before the peptide exposure exercised neuroprotective effects in the in vitro model of toxicity by Aß25-35. Although further studies are necessary for understanding the neuroprotective mechanisms in AD, the data suggests that the melatonin could to exert neuroprotection through the inhibition of tau hyperphosphorylation, reduction of GSK-3ß activity, prevent microglial and astroglial activation and reduce the release of pro-inflammatory factors, as TNF-a and IL-6.