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Papel da proteína EspFU em Escherichia coli enteropatogênica atípica. / Role of EspFU protein in atypical enteropathogenic Escherichia coli.

Martins, Fernando Henrique 14 December 2017 (has links)
Escherichia coli enteropatogênica atípica (aEPEC) é considerada um dos principais agentes etiológicos da diarreia em várias regiões do mundo. O mecanismo central da patogenicidade de aEPEC é a capacidade de causar lesões attaching-effacing (A/E) no epitélio intestinal, uma propriedade desencadeada por proteínas codificadas pelo locus of enterocyte effacement (LEE). Enquanto algumas aEPEC utilizam a via de fosforilação de Tir (Y-P) para induzir a formação de pedestais, outras cepas podem empregar a proteína efetora EspFU (TccP/TccP2) para uma eficiente polimerização de actina. Neste estudo foi avaliada a prevalência e produção de EspFU, como também o papel desempenhado por esta proteína na interação com células epiteliais e colonização intestinal, aspectos essenciais da patogênese de aEPEC. O gene espFU foi detectado em 46% das cepas de aEPEC, com uma predominância do alelo tccP2. A maioria das cepas apresentou o tir fosforilado (Y-P), sugerindo que possam utilizar diferentes mecanismos redundantes para a polimerização de actina. As cepas positivas para tccP e tccP2 foram significativamente associadas com os filogrupos E, e B1, respectivamente. A produção de EspFU (TccP/TccP2) variou de cepa-a-cepa, independentemente dos genótipos e filogrupos. A deleção do gene espFU em uma cepa de aEPEC O55:H7 (BA320) resultou em menor aderência bacteriana e comprometeu a capacidade de induzir polimerização de actina em células HeLa após 6 h de infecção. Adicionalmente, o mutante em espFU apresentou uma menor eficiência na colonização intestinal em um modelo murino de infecção. A análise da cinética da formação de pedestais por aEPEC mostrou que, de modo geral, cepas expressando EspFU foram mais aderentes e induziram polimerização de actina mais rapidamente em comparação à via de TirY-P. A adesão bacteriana e formação de pedestais mediada por EspFU regulou negativamente a expressão de LEE, além de modular a resposta transcricional epitelial por meio da ativação de genes pró-inflamatórios, como NF-kB, IL-6, IL-8, entre outros. Em suma, a proteína EspFU é ampla e filogeneticamente distribuída em cepas de aEPEC, desempenha um importante papel na adesão bacteriana e colonização intestinal, e pode contribuir direta ou indiretamente para a indução de resposta inflamatória. / Atypical enteropathogenic Escherichia coli (aEPEC) is one of the most important pathogen causing diarrhea disease worldwide. The hallmark of aEPEC pathogenesis is the ability to cause attaching and effacing (A/E) lesions on intestinal epithelium, a property triggered by proteins encoded on a pathogenicity island called locus of enterocyte effacement (LEE). While some aEPEC require tyrosine phosphorylation (Y-P) of Tir to trigger actin assembling, certain strains whose Tir is not tyrosine phosphorylated utilize the T3SS effector Tir-cytoskeleton coupling protein (TccP/TccP2) for efficient actin polymerization. In the present study, we evaluated the prevalence, production, and functions played by the EspFU protein on important aspects of aEPEC pathogenesis, such as interaction with epithelial cells and intestinal colonization. The tccP and/or tccP2 genes were detected in 45.8% of the aEPEC strains, with a predominance of tccP2 allele. Most of these strains carried tirY-P, suggesting that can trigger actin polymerization using both Tir tyrosine phosphorylation and TccP/TccP2 pathways. aEPEC strains carrying tccP or tccP2 were significantly associated to phylogroups E and B1, respectively. We also observed a differential production of TccP/TccP2 among the strains, regardless genotypes and phylogeny. Deletion of espFU from aEPEC BA320 (serotype O55:H7) significantly decreased bacterial adherence and impaired the ability to induce actin rearrangement in HeLa cells after 6 h of infection. Also, the espFU mutant showed lower colonization levels compared to the wild-type strain in a murine infection model. Analysis of the kinetics of pedestal formation showed EspFU-expressing strains were more adherent and induced actin rearrangement more rapidly than Tir-phosphorylated (TirY-P) producing aEPEC. Importantly, bacterial adherence and pedestal formation driven by EspFU downregulated the LEE expression, and also induced changes in the epithelial transcriptional response, specifically by activating pro-inflammatory genes such as NKFB, IL6 and IL8. In summary, our data suggest that EspFU protein is widely and phylogenetically distributed among aEPEC strains, and play an important role on bacterial attachment and intestinal colonization. Moreover, aEPEC could induce inflammation in a EspFU-dependent manner.
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DESENVOLVIMENTO DE PROTEÍNA SINTÉTICA QUIMÉRICA BASEADA EM TALE (TRANSCRIPTION ACTIVATOR-LIKE EFFECTOR) PARA APLICAÇÃO EM SISTEMA BIOSSENSOR DE DNA. 72f 2017

Moreira, Catarina Alfaya January 2017 (has links)
Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandarego@gmail.com) on 2018-02-05T18:15:30Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_Catarina Alfaya Moreira.pdf: 3840507 bytes, checksum: 842c5cfecee2c3b039e0c031feb67016 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-02-05T18:15:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_Catarina Alfaya Moreira.pdf: 3840507 bytes, checksum: 842c5cfecee2c3b039e0c031feb67016 (MD5) / As abordagens de Biologia Sintética possuem potencial de aumentar a produção de ferramentas diagnósticas adequadas para utilização na prática, como os biossensores de DNA. O controle dos sistemas biológicos permite o aprimoramento de tecnologias em uso e surgimento de novas tecnologias, como o diagnóstico molecular através da identificação de sequências específicas de DNA. A maioria dos métodos moleculares de diagnóstico de DNA se baseiam em hibridização. Contudo, atualmente, as proteínas ligadoras de DNA tem tido destaque, devido às suas numerosas vantagens. As principais vantagens são a identificação de sequências em DNA dupla-fita, eliminando o passo de desnaturação, e a alta especificidade pelo alvo. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi desenvolver uma proteína sintética quimérica para aplicação em sistema biossensor de DNA que permitirá rápida identificação de uma sequência específica de DNA de Corynebacterium striatum, um importante patógeno emergente. Foi construída, neste estudo, uma proteína quimérica biossensora composta por: (I) um domínio de ligação ao DNA derivado de proteínas TALEs (proteínas efetoras do tipo ativadores transcricionais) o qual reconhece especificamente uma sequência de 18 pb de um gene único de C.striatum codificador de uma permease para transporte de ferro; combinado a (II) uma cromoproteína tsPurple (Tinsel Purple) para permitir detecção visual da sequência alvo. Para construção do gene codificador da proteína TALE específica, o gene específico de C. striatum foi analisado com a ferramenta Tal Effector Nucleotide Targeter (Cornell University) e uma sequência-alvo de 18pb foi definida. A construção de domínios TAL foi realizada utilizando a ferramenta GeneArtTM Perfect Match TAL (Thermo Scientific); o gene sintético encontra-se clonado no plasmídeo pTALE. Para construir as sequências gênicas quiméricas, foram desenhados primers de PCR para isolamento da sequência da tsPurple com a adição de sítios artificiais de restrição para EcoRI e BamHI; os produtos de PCR digeridos foram clonados no plasmídeo pTALE, downstream à sequência da TALE específica. Essas sequências fusionadas foram então sub-clonadas em um vetor de expressão pDESTTM17, através de recombinação utilizando tecnologia Gateway para expressão das proteínas quiméricas. A expressão da proteína quimérica foi induzida pela adição de 1mM de IPTG. A expressão da proteína quimérica foi confirmada através de análises de SDS PAGE 10% , que demonstraram a superexpressão da proteína esperada de 151kDa; além disso, foi observada a forte coloração roxa no precipitado bacteriano, em razão da funcionalidade da cromoproteína TsPurple.

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