Las plantas son útiles para la producción de proteínas heterólogas y otros productos de aplicación en medicina o industria, así como los virus de vegetales. El virus del grabado del tabaco (TEV), es un virus de RNA de cadena positiva ampliamente empleado en estudios sobre biología molecular de virus de plantas. Con base en un clon infeccioso de este virus, se ha desarrollado un vector viral desarmado que permite la expresión simultánea de múltiples proteínas heterólogas en plantas. Como primera etapa se construyeron 3 nuevos plásmidos con el mismo clon infeccioso del TEV que permitieran infectar plantas con RNA transcrito in vitro (pMTEV), con DNA (p35TEV) o por agroinoculación (pGTEV). El vector de expresión se construyó sobre el plásmido pGTEV, reemplazando el cistrón que codifica la proteína NIb por un casete que contenía los cDNAs de las proteínas heterólogas flanqueados por sitios de corte naturales y artificiales de la proteasa viral NIaPro. Se construyeron dos versiones del vector, uno que expresa tres proteínas fluorescentes, roja, amarilla y azul, y otro que expresa dos factores de transcripción de A. majus (Delila y Rosea1) de la ruta de biosíntesis de las antocianinas. Al inocular plantas de tabaco transgénicas, que suplementan la función NIb, se detectó la expresión colocalizada de las 3 proteínas fluorescentes tanto a nivel de tejido como subcelular, se comprobó el eficiente procesamiento de cada proteína heteróloga y se probó que el vector es incapaz de infectar plantas en las que la función NIb no se suplementa. En la expresión de Delila y Rosea1, la inoculación de plantas provocó una alta acumulación de antocianinas en los tejidos infectados por el virus adquiriendo una coloración rojiza. A continuación, se analizó el efecto de insertar un segundo supresor viral del silenciamiento, y los resultados sobre un vector que expresa la proteína fluorescente roja mostraron que la coexpresión de la proteína P19 del virus del enanismo arbustivo del tomate (TBSV) aumenta la expresión en aproximadamente un 50%, y la proteína 2b del virus del mosaico del pepino (CMV) la aumenta un 20%. En contraste, la proteína 16K del virus del cascabeleo del tabaco (TRV) no tiene ningún efecto, mientras que la proteína HC-Pro de otro potyvirus, el virus de la sharka de los frutales de hueso, tiene un efecto negativo. / Bedoya Rojas, LC. (2011). DESARROLLO DE UN VECTOR PARA LA EXPRESIÓN SIMULTÁNEA DE MÚLTIPLES PROTEÍNAS EN PLANTAS BASADO EN EL POTYVIRUS DEL GRABADO DEL TABACO [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/13833

Este trabalho tem como finalidade estudar as melhores condições do cultivo da microalga Chlamydomonas reindhartii geneticamente modificada para a produção da proteína fluorescente mCherry a partir do estudo dos macronutrientes contidos no meio de cultivo. A proteína mCherry possui a vantagem de ser facilmente detectada no meio de cultivo por espectofotometria convencional, convertendo-se, desta forma, em uma molécula interessante para o estudo como modelo de expressão. Inicialmente, foram estudadas três diferentes fontes de nitrogênio para avaliar a expressão da proteína recombinante. Os resultados indicaram que a melhor fonte de nitrogênio para a produção da mCherry foi o NH4NO3. Em seguida, para avaliar os efeitos gerados pelos macronutrientes (acetato, cloreto de cálcio, sultato de magnésio, nitrato de amônio e fostato total) contidos no meio de cultivo TAP, foi realizado um planejamento composto central 25, em cultivos em microplacas, sendo os resultados avaliados por regressão multivariada. Além disso, a análise realizada por regressão multivariada indicou que, dos níveis avaliados das variáveis, as condições que melhor atendem à otimização da produção de mCherry e crescimento celular são: acetato, 33,35 mM; cloreto de cálcio, 0,45 mM; sulfato de magnésio, 0,83 mM; nitrato de amônio, 10,31 mM; fosfato total, 1,96 mM. Essas condições foram escolhidas para cultivo em fotobiorreator tubular, onde foi obtido título de fluorescência de mCherry a 608 nm de 59209 UF, correspondendo a um aumento de 118,5% maior que o título de fluorescência obtido com uso de meio TAP padrão. Com a finalidade de seguir com os processos de produção foi disenhado um biorreator tipo coluna e foi reaizado um estudio de produção em sistema semicontinuo. Os resultados obtidos demostraram que o sistema semicontinuo aumento 2,6 veces a produtividade da biomassa. / This work aims to study the best conditions of the cultivation of the microalgae Chlamydomonas reindhartii genetically modified for the production of the fluorescent protein mCherry from the study of the macronutrients contained in the culture medium. The mCherry protein has the advantage of being easily detected in the culture medium by conventional spectrophotometry, thus becoming an interesting molecule for the study as an expression model. Initially, three different nitrogen sources were studied to evaluate the expression of the recombinant protein. The results indicated that the best source of nitrogen for the production of mCherry was NH4NO3. Then, to evaluate the effects generated by macronutrients (acetate, calcium chloride, magnesium sulphate, ammonium nitrate and total phosphate) contained in the TAP culture medium, a central composite 25 was carried out in cultures on microplates, Results evaluated by multivariate regression. In addition, multivariate regression analysis indicated that, from the evaluated levels of the variables, the conditions that best serve the optimization of mCherry production and cell growth are: acetate, 33.35 mM; Calcium chloride, 0.45 mM; Magnesium sulfate, 0.83 mM; 10.31 mM ammonium nitrate; Total phosphate, 1.96 mM. These conditions were chosen for cultivation in tubular photobioreactor where fluorescence titre of mCherry at 608 nm of 59209 UF was obtained, corresponding to an increase of 118.5% greater than the titer of fluorescence obtained using standard TAP medium. In order to follow the production processes, a column type bioreactor was designed and a production study was carried out in a semicontinuous system. The results showed that the semicontinuous system increased 2.6 times the productivity of the biomass.

Este trabalho tem como finalidade estudar as melhores condições do cultivo da microalga Chlamydomonas reindhartii geneticamente modificada para a produção da proteína fluorescente mCherry a partir do estudo dos macronutrientes contidos no meio de cultivo. A proteína mCherry possui a vantagem de ser facilmente detectada no meio de cultivo por espectofotometria convencional, convertendo-se, desta forma, em uma molécula interessante para o estudo como modelo de expressão. Inicialmente, foram estudadas três diferentes fontes de nitrogênio para avaliar a expressão da proteína recombinante. Os resultados indicaram que a melhor fonte de nitrogênio para a produção da mCherry foi o NH4NO3. Em seguida, para avaliar os efeitos gerados pelos macronutrientes (acetato, cloreto de cálcio, sultato de magnésio, nitrato de amônio e fostato total) contidos no meio de cultivo TAP, foi realizado um planejamento composto central 25, em cultivos em microplacas, sendo os resultados avaliados por regressão multivariada. Além disso, a análise realizada por regressão multivariada indicou que, dos níveis avaliados das variáveis, as condições que melhor atendem à otimização da produção de mCherry e crescimento celular são: acetato, 33,35 mM; cloreto de cálcio, 0,45 mM; sulfato de magnésio, 0,83 mM; nitrato de amônio, 10,31 mM; fosfato total, 1,96 mM. Essas condições foram escolhidas para cultivo em fotobiorreator tubular, onde foi obtido título de fluorescência de mCherry a 608 nm de 59209 UF, correspondendo a um aumento de 118,5% maior que o título de fluorescência obtido com uso de meio TAP padrão. Com a finalidade de seguir com os processos de produção foi disenhado um biorreator tipo coluna e foi reaizado um estudio de produção em sistema semicontinuo. Os resultados obtidos demostraram que o sistema semicontinuo aumento 2,6 veces a produtividade da biomassa. / This work aims to study the best conditions of the cultivation of the microalgae Chlamydomonas reindhartii genetically modified for the production of the fluorescent protein mCherry from the study of the macronutrients contained in the culture medium. The mCherry protein has the advantage of being easily detected in the culture medium by conventional spectrophotometry, thus becoming an interesting molecule for the study as an expression model. Initially, three different nitrogen sources were studied to evaluate the expression of the recombinant protein. The results indicated that the best source of nitrogen for the production of mCherry was NH4NO3. Then, to evaluate the effects generated by macronutrients (acetate, calcium chloride, magnesium sulphate, ammonium nitrate and total phosphate) contained in the TAP culture medium, a central composite 25 was carried out in cultures on microplates, Results evaluated by multivariate regression. In addition, multivariate regression analysis indicated that, from the evaluated levels of the variables, the conditions that best serve the optimization of mCherry production and cell growth are: acetate, 33.35 mM; Calcium chloride, 0.45 mM; Magnesium sulfate, 0.83 mM; 10.31 mM ammonium nitrate; Total phosphate, 1.96 mM. These conditions were chosen for cultivation in tubular photobioreactor where fluorescence titre of mCherry at 608 nm of 59209 UF was obtained, corresponding to an increase of 118.5% greater than the titer of fluorescence obtained using standard TAP medium. In order to follow the production processes, a column type bioreactor was designed and a production study was carried out in a semicontinuous system. The results showed that the semicontinuous system increased 2.6 times the productivity of the biomass.

A produção de proteínas e peptídeos heterólogos representa um dos mais importantes segmentos do setor biotecnológico. Apesar das diferentes tecnologias hoje disponíveis para a (bio) síntese de proteínas e peptídeos (como a síntese química ou o emprego de microrganismos, animais e plantas transgênicos), nenhuma destas é capaz de produzir uma quantidade suficiente de proteínas e peptídeos para suprir as necessidades do mercado por apresentarem altos custos de produção e comercialização. Diante disso, este projeto visou utilizar os sistemas genéticos alternativos ou não convencionais existentes nas células da levedura Saccharomyces cerevisiae para a produção de peptídeos e proteínas heterólogas em larga escala, com um alto grau de pureza necessário às aplicações clínicas e com um custo de produção relativamente baixo para uso comercial. Estes sistemas não convencionais, representados especialmente por partículas virais intracelulares de S. cerevisiae, são conhecidos há várias décadas por conferirem o fenótipo killer em diferentes linhagens de leveduras, tanto para os isolados ambientais quanto para as linhagens utilizadas industrialmente. As características moleculares destes sistemas virais são bem conhecidas, sendo que os genomas dos diferentes tipos de partículas virais de S. cerevisiae já foram completamente seqüenciados. Assim, este trabalho avaliou a capacidade de leveduras industriais e laboratoriais em produzir proteínas e peptídeos heterólogos funcionais utilizando para tanto, um sistema viral naturalmente presente na levedura, que compreende um mutante natural do vírus helper L-A denominado de sistema viral X de S. cerevisiae. / Submitted by Marcelo Teixeira (mvteixeira@ucs.br) on 2014-06-02T19:51:46Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao Queli Defaveri Varela.pdf: 4371110 bytes, checksum: 9992e73e45f4352a46630f52b980c259 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-06-02T19:51:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Queli Defaveri Varela.pdf: 4371110 bytes, checksum: 9992e73e45f4352a46630f52b980c259 (MD5) / The production of heterologous proteins and peptides represents one of the most important segments of the biotechnology industry. Despite the different technologies available today for (bio) synthesis of proteins and peptides (such as chemical synthesis or the use of microorganisms, transgenic animals and plants), none of these are capable of producing sufficient quantities of proteins and peptides to the needs of the market because they present high costs of production and marketing. Thus, this project aims to use the alternative genetic systems or unconventional existing in the cells of the yeast Saccharomyces cerevisiae for the production of heterologous proteins and peptides on a large scale, with a high degree of purity needed for clinical applications and at a cost of production compared low for commercial use. These non-conventional systems, particularly represented by intracellular viral particles of S. cerevisiae, are known for several decades to give the killer phenotype in different strains of yeast, both for environmental isolates and to the strains used industrially. The molecular characteristics of these viral systems are well known, and the genomes of different types of viral particles from S. cerevisiae have been completely sequenced. Thus, this work assessed the capacity of industrial and laboratory yeasts to produce heterologous proteins and peptides using a viral system naturally present in yeast that is a natural mutant of the helper virus L-A, called X system of S. cerevisiae.

A produção de proteínas e peptídeos heterólogos representa um dos mais importantes segmentos do setor biotecnológico. Apesar das diferentes tecnologias hoje disponíveis para a (bio) síntese de proteínas e peptídeos (como a síntese química ou o emprego de microrganismos, animais e plantas transgênicos), nenhuma destas é capaz de produzir uma quantidade suficiente de proteínas e peptídeos para suprir as necessidades do mercado por apresentarem altos custos de produção e comercialização. Diante disso, este projeto visou utilizar os sistemas genéticos alternativos ou não convencionais existentes nas células da levedura Saccharomyces cerevisiae para a produção de peptídeos e proteínas heterólogas em larga escala, com um alto grau de pureza necessário às aplicações clínicas e com um custo de produção relativamente baixo para uso comercial. Estes sistemas não convencionais, representados especialmente por partículas virais intracelulares de S. cerevisiae, são conhecidos há várias décadas por conferirem o fenótipo killer em diferentes linhagens de leveduras, tanto para os isolados ambientais quanto para as linhagens utilizadas industrialmente. As características moleculares destes sistemas virais são bem conhecidas, sendo que os genomas dos diferentes tipos de partículas virais de S. cerevisiae já foram completamente seqüenciados. Assim, este trabalho avaliou a capacidade de leveduras industriais e laboratoriais em produzir proteínas e peptídeos heterólogos funcionais utilizando para tanto, um sistema viral naturalmente presente na levedura, que compreende um mutante natural do vírus helper L-A denominado de sistema viral X de S. cerevisiae. / The production of heterologous proteins and peptides represents one of the most important segments of the biotechnology industry. Despite the different technologies available today for (bio) synthesis of proteins and peptides (such as chemical synthesis or the use of microorganisms, transgenic animals and plants), none of these are capable of producing sufficient quantities of proteins and peptides to the needs of the market because they present high costs of production and marketing. Thus, this project aims to use the alternative genetic systems or unconventional existing in the cells of the yeast Saccharomyces cerevisiae for the production of heterologous proteins and peptides on a large scale, with a high degree of purity needed for clinical applications and at a cost of production compared low for commercial use. These non-conventional systems, particularly represented by intracellular viral particles of S. cerevisiae, are known for several decades to give the killer phenotype in different strains of yeast, both for environmental isolates and to the strains used industrially. The molecular characteristics of these viral systems are well known, and the genomes of different types of viral particles from S. cerevisiae have been completely sequenced. Thus, this work assessed the capacity of industrial and laboratory yeasts to produce heterologous proteins and peptides using a viral system naturally present in yeast that is a natural mutant of the helper virus L-A, called X system of S. cerevisiae.