Orientador: Marcos Silveira Buckeridge / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-12T17:19:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tonini_PatriciaPinho_D.pdf: 2946398 bytes, checksum: 0c45bddc87c835268cd2cfd05f89d364 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Sementes de Sesbania virgata (Cav.) Pers. acumulam suas reservas de carbono no endosperma na forma de um polissacarídeo de parede celular, o galactomanano. A mobilização deste ocorre após a germinação e envolve três enzimas hidrolíticas, dentre elas a a-galactosidase. Além da reserva de carbono, há uma grande quantidade de corpos protéicos, no citoplasma das células endospérmicas, que constituem a principal reserva de nitrogênio nestas sementes. Para que ocorra a correta distribuição dos produtos de degradação das reservas deve haver sincronização entre os processos de degradação das reservas de carbono e nitrogênio, porém para compreender tais mecanismos, é necessário estudar aspectos do controle da produção e ação das enzimas responsáveis pela hidrólise das reservas. Buscando determinar em que ponto do metabolismo a semente de S. virgata se encontra em relação à produção destas enzimas hidrolíticas, durante e após a germinação, e supostamente os tecidos envolvidos nesta produção, sementes desta espécie foram embebidas em actinomicina-D (inibidor de transcrição) e cicloheximida (inibidor de tradução) e os efeitos destes inibidores verificados através da atividade e detecção da a-galactosidase no tegumento e endosperma destas sementes. Além disso, buscando verificar e relacionar o efeito do ácido abscísico, do etileno e dos açúcares na degradação das reservas após a germinação de S. virgata, sementes desta espécie foram embebidas em ABA, etileno, glucose e sacarose, e os efeitos destes foram verificados através dos teores protéicos, da atividade da a-galactosidase e da produção endógena de ABA e etileno nestas sementes. Como a presença de actinomicina-D e cicloheximida não inibiram a produção e a atividade da a-galactosidase no endosperma durante e após a germinação, sugere-se que a produção desta enzima ocorra principalmente durante a maturação da semente. Aparentemente, a partir do período pós-germinativo, a enzima pré-formada seria processada e ativada, para conseqüente degradação dos galactomananos, através de um processo proteolítico. Em contrapartida, como a presença deactinomicina-D e cicloheximida inibiram a degradação das proteínas de reserva no tegumento e endosperma e, inclusive, induziram a atividade da a-galactosidase nestes tecidos no final do processo de degradação dos galactomananos, sugerese a síntese de novo de proteases durante e após a germinação e a relação íntima destas enzimas com a degradação das proteínas de reserva e da a-galactosidase no final do processo de degradação dos galactomananos. Quanto aos hormônios, a presença de ABA exógeno retardou o início da degradação das proteínas de reserva no endosperma, assim como diminuiu a atividade da a-galactosidase no mesmo tecido no final do processo de degradação do galactomanano, sugerindo um efeito modulador deste hormônio durante a degradação das reservas, reprimindo a ação das enzimas hidrolíticas. A presença de etileno exógeno, entretanto, aumentou a atividade da a-galactosidase no endosperma e, inclusive, no tegumento no final do processo de degradação do galactomanano, sugerindo um efeito indutor deste hormônio na ativação e ação das enzimas hidrolíticas. De fato, analisando a produção endógena de ABA e etileno, observou-se um aumento brusco dos hormônios no período de mobilização das reservas, que pode estar relacionado à influência destes hormônios na atividade das enzimas hidrolíticas em sementes de S. virgata. Ainda, como ocorreram mudanças na produção de ABA e etileno endógeno na presença de glucose e sacarose, sugere-se uma relação íntima entre a via de sinalização destes hormônios e a dos açúcares, a fim de controlar o processo de degradação das reservas. Desta forma, estas evidências sugerem que o ABA e o etileno controlariam antagonicamente a mobilização de reservas em sementes de S. virgata, juntamente com os açúcares, através da ativação e ação das enzimas hidrolíticas, a fim de controlar o processo de degradação das proteínas e dos galactomananos, evitando a produção dos açúcares redutores e de sacarose em excesso durante o período pós-germinativo e garantindo o afluxo eficiente de carbono e nitrogênio para o desenvolvimento da plântula. / Abstract: Seeds of Sesbania virgata (Cav.) Pers. have an endosperm which accumulates galactomannan as a storage polysaccharide in the cell walls that is hydrolysed after germination by three enzymes (a-galactosidase, endo-ß-mannanase and exo-ß-mannosidase). Besides the storage of carbon, there is a great amount of protein bodies in the cytoplasm of endospermic cells, which play the major role as a nitrogen reserve in this seed. It is likely that a synchronization between the process of galactomannan and protein degradation occurs for a more efficient distribution and use of the storage degradation products. However, to understand these mechanisms, it is necessary to study aspects of the production and action control of the hydrolytic enzymes responsible for the mobilisation of these reserves. Aiming to determine in which point of the metabolism the seed of S. virgata is in relation to the production of the hydrolytic enzymes, during and after germination, and the supposed tissues involved in this production, seeds of this specie were imbibed in actinomycin-D (transcription inhibitor) and cycloheximide (translation inhibitor), and the effects of these inhibitors verified thought the a-galactosidase activity and detection in the testa and endosperm of these seeds. Besides of this, for to verify and relate the effects of abscisic acid, ethylene and sugars on the reserves degradation after germination of the S. virgata, seeds of this specie were imbibed in ABA, ethylene, glucose and sucrose, and the effects of these were verified through the protein content, a-galactosidase activity and endogenous production of ABA and ethylene in this seeds. In the presence of actinomycin-D and cycloheximide, the production and activity of the a- galactosidase were not inhibited during and after germination, suggesting that the production of this enzyme occurs principally during the maturation of the seed. Apparently, after the germination, this enzyme is processed by proteolysis, so that it becomes activated to perform galactomannan degradation. On the other hand, the presence of actinomycin-D and cycloheximide inhibited the protein degradation in the testa and endosperm and at the same time induced the a-galactosidaseactivity in the same tissues at the final steps of the galactomannan degradation process. This suggests the existence of synthesis de novo of the proteases during and after germination and a possible relationship between the storage protein and galactomannan mobilisation. Regarding the hormones, the presence of exogenous ABA retarded the beginning of the storage protein degradation in the endosperm and also decreased a-galactosidase activity in the same tissue at the end of galactomannan degradation. This suggests that there is a regulator effect of this hormone during the storage degradation, repressing the enzymes action. In the presence of exogenous ethylene an increase in the a-galactosidase activity in the endosperm and in the testa were observed at the end of galactomannan degradation, suggesting an inducing effect of this hormone on the hydrolytic enzymes. The finding of endogenous ABA and ethylene production, observed during the period of the storage mobilisation, give support to the above raised hypothesis that the two hormones participate in the control of the hydrolytic enzyme activities in seeds of S. virgata. Furthermore, the changes observed in the endogenous ABA and ethylene production in the presence of glucose and sucrose, suggested a relation between the signaling pathway of these hormones and the sugars signaling, controlling the process of storage degradation. Thus, our results add evidence to suggest that ABA and ethylene antagonistically control the storage mobilisation in seeds of S. virgata, together with the sugars, through the hydrolytic enzymes activation, controlling the process of storage protein and galactomannan degradation, in other to avoiding the excess production of reductor sugars and sucrose during the post-germinative period and assuring the efficient afflux of the carbon and nitrogen to the seedling development. / Doutorado / Biologia Celular / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Paulo Arruda / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-08T07:58:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Figueira_ThaisRezendeeSilva_D.pdf: 6195048 bytes, checksum: a6968f696fa4837277a389b9699a272b (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: O seqüenciamento de ESTs e a sua organização em bancos de dados constituem poderosas ferramentas para a identificação de genes expressos em determinados tecidos e/ou tipos celulares. Buscando obter informações sobre o metabolismo e o desenvolvimento da semente do milho, nós criamos um banco de ESTs denominado MAIZEST. Esse banco de dados contem ESTs de um grande número de tecidos do milho e é especialmente rico em seqüências provenientes do endosperma em desenvolvimento. O MAIZEST contém 227.431 ESTs oriundas de mais de 30 órgãos e tecidos de milho. Desses, 64.537 são provenientes de endosperma em desenvolvimento sendo que 30.531 foram seqüenciados em nosso laboratório. Utilizando ferramentas de bioinformatica, identificamos no MAIZEST um conjunto de genes preferencialmente expressos no endosperma, dentre os quais destacam-se fatores de transcrição posivelmente envolvidos em processos chave do metabolismo, diferenciação e desenvolvimento do endosperma. Em seguida, identificamos no MAIZEST os genes que codificam as proteínas de reserva de milho, as zeínas, e fizemos um estudo comparativo entre os genes que coficam as prolaminas do milho, do sorgo e da cana-de-açúcar. Estudos evolutivos sugerem que o milho seja o produto de uma alotetraploidização ocorrida pela hibridização interespecífica de dois ancestrais n=5. O milho deve ter sido originado através de um evento de alotetraploidização segmental, ocorrido a aproximadamente 11 milhões de anos, ou através de um evento único de duplicação, ocorrido acerca de 5 milhões de anos. Todavia, até o momento, os progenitores do milho ainda não haviam sido identificados. Neste trabalho, demonstramos que um destes progenitores pertence à linhagem Saccharum, que deu origem à moderna cana-de-açúcar. Comparando os padrões das prolaminas do milho, do sorgo e da cana-de-açúcar, observamos uma grande similaridade entre milho e cana. As prolaminas, que se acumulam no endosperma dos cereais, podem ser agrupadas em classes estruturalmente distintas, denominadas de a-, ß-, ?- e d-prolaminas. Quase a totalidade dessas classes de prolaminas são encontradas nas três espécies, mas em milho existem duas classes de a-zeinas, as de 22KD e as de 19KD. Sorgo possui apenas a-kafirinas de 22 KD, enquanto a cana, como o milho, possui as a-prolaminas de 22 e 19KD, as quais denominamos caneinas. O alinhamento das seqüências de aminoácido das a-zeínas, a-caneinas e a-kafirinas revelou que em cana e milho, o sexto domínio, de uma estrutura composta por 10 domínios a-helices que caracterizam as a-prolaminas de 22 KD, está ausente nas a-prolaminas de 19KD. Uma vez que as a-prolaminas de 22KD estão presentes em sorgo, e em outras espécies da tribo Andropogoneae, como o Coix, nós postulamos que as a-prolaminas de 19KD foram origindas pela deleção do sexto domínio das a-prolaminas de 22KD, ocorrida em uma linhagem acestral de Saccharum. Saccharum e Sorgo divergiram entre 8-9 milhões de anos, quando apenas as a-prolaminas de 22KD existiam. As caneínas de 19KD foram originadas após esta divergência o que sugere que o milho herdou a a-zeina de 19KD de Saccharum, após a hibridização interespecífica entre Saccharum e outro progenitor Androponeae n=5 / Abstract: The sequencing of ESTs (expressed sequence tags) and its organization in databases constitute powerful tools to identify genes of interest in certain tissues and/or cell types. In this work we have created a database of ESTs expressed in diverse maize tissues called MAIZEST. MAIZEST contains 227,431 ESTs coming from over 30 different maize tissues, 64,357 of which coming from developing endosperm. The analysis of MAIZEST database leaded to the identification of 4,032 transcripts preferentially expressed in endosperm, and its annotation revealed a great variety of new genes involved in endosperm metabolism and development. We used the information of the genes encoding the maize storage protein, zein, to comparre with the storage protein genes from sorghum and sugarcane. Genetic and molecular evolution studies have suggested that maize is the product of a tetraploid event which occurred by the interspecific hybridisation of two n = 5 ancestors. It has been proposed that maize may have originated through a segmental allotetraploid event occurred at 11.5 Mya or by a single duplication event occurred about 4.8 Mya. However, the progenitors of the allotetraploid have not as yet been identified. Here we show that one of the progenitors belongs to the saccharum lineage from which modern sugarcane originates. Comparing patterns of the seed storage protein, prolamins, of maize, sorghum and sugarcane, a striking similarity was found between maize and sugarcane. Prolamins, which accumulate in the endosperm of cereal seeds, can be grouped into structurally distinct classes named a-, ß-, ?- and d-prolamins. Almost all prolamin classes are present in maize, sorghum and sugarcane, but in maize there are two molecular weight distinct classes of a-prolamins, the 22 KD and the 19 KD a-zeins. Sorghum possesses only the 22 KD a-kafirin while sugarcane possesses both the 22KD and the 19 KD a-prolamins, which we called caneins. Alignment of the 22 and the 19 KD amino acid sequences revealed that both the 19 KD a-zein and the 19 KD a-canein lack the 6th a-helices domain from the 10 a-helices domains found in the 22 KD a-prolamins. Since the 22 KD a-prolamins are present in sorghum and in the more ancient Andropogoneae species Coix, we postulate that the 19 KD a-prolamins originated, by a deletion of the 6th a-helices domain of the 22 KD a-prolamins, in the saccharum lineage. Saccharum and sorghum diverged about 5-9 Mya, when only the 22 KD a-prolamins existed. The 19KD a-canein originated after this divergence. Therefore, maize inherited the 19KD a-zein from saccharum after the interspecific hybridisation between saccharum and another n = 5 Andropogoneae progenitor / Doutorado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Doutor em Genetica e Biologia Molecular